一种猪细小病毒毒株及其应用

摘要

本发明公开一种猪细小病毒毒株及其应用，属于疫苗领域。该病毒是从广东地区采集并分离得到的，经鉴定，命名为猪细小病毒PPVGD株，于2016年03月18日保藏于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：V201618。其全基因序列如SEQ ID NO：1所示。将PPVGD株制备的灭活疫苗接种豚鼠后，28d后，测HI抗体效价的几何平均为1：194；接种四月龄的猪细小病毒抗体阴性的猪，在免疫28d后，测HI，抗体效价的几何平均约为1：147。可知，本发明表明了以广东分离株PPVGD株制备的灭活疫苗接种豚鼠和后备母猪后具有良好的免疫原性，且略高于商品化的灭活疫苗。

权利要求

1.一种猪细小病毒灭活疫苗，其特征在于：含有灭活后的猪细小病毒；

所述的猪细小病毒，名称为猪细小病毒PPVGD株，于2016年03月18日保藏于中国.武汉.武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：V201618；

所述的猪细小病毒PPVGD株的全基因序列如SEQ ID NO：1所示。

说明书

一种猪细小病毒毒株及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于疫苗领域，涉及一种猪细小病毒毒株及其在制备猪细小病毒灭活疫苗中的应用。特别涉及一株自行分离得到的PPVGD株以及由该毒株制备的灭活疫苗。

背景技术

[0002] 猪细小病毒(porcine parvovirus，PPV)为引起母猪繁殖障碍的主要病原之一，可引起胚胎或胎儿的感染和死亡，导致母猪发生流产、死胎、木乃伊胎及新生仔猪的死亡，而母体通常缺乏临诊症状。猪细小病毒是由Mayr等人于1966年进行猪瘟病毒组织培养时首次发现的，于1967年，Cartwright等人首次证明了它的致病作用。在我国，潘雪珠于1983年首次分离到猪细小病毒。此后，在全国各地陆续分离到数株猪细小病毒毒株。目前，人们发现猪细小病毒常与猪瘟病毒、猪圆环病毒等混合感染给猪养殖业带来严重的危害，导致断奶仔猪多系统综合征、皮炎等，所以对猪细小病毒进行研究依然很迫切。

发明内容

[0003] 为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种猪细小病毒毒株。

[0004] 本发明的另一目的在于提供所述的猪细小病毒毒株的应用。

[0005] 本发明的目的通过下述技术方案实现：

[0006] 本发明是采用PCR方法对广东地区采集的疑似PPV病料进行PCR检测，经聚合酶链式反应(PCR)证实为猪细小病毒(PPV)，采用猪睾丸(ST)细胞分离培养，培育1株ST传代细胞培养适应毒株，命名为PPVGD株。通过观察细胞病变、生物学特性研究等途径证实分离的病毒为猪细小病毒。

[0007] 一种猪细小病毒(porcine parvovirus，PPV)，命名为猪细小病毒PPVGD株，其保藏信息为：保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期：2016年03月18日，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：V201618。

[0008] 本发明将设计扩增PPVGD株全部结构基因序列的5对引物，通过梯度PCR得出引物最佳的退火温度。经过PCR扩增、胶回收、加polyA、连接T载体、转化、提取质粒等过程，送公司测序，通过拼接得到PPVGD株全部结构基因序列。

[0009] 所述的猪细小病毒PPVGD株全部结构基因序列如SEQ ID NO：1所示。

[0010] 所述的猪细小病毒PPVGD株的繁殖方法，包括如下步骤：

[0011] 当ST细胞长至60％左右时，弃去培养液，用PBS清洗3次后，加少量DMEM，然后按2％的接毒量接种于ST细胞，轻轻摇动，使病毒液充分均匀的分布于培养液中，置于5％CO2、37℃温箱中孵育1h后，补加培养液，使血清的终浓度为2％，设空白对照组。逐日观察细胞病变情况，当细胞病变达80％左右时，约在接毒后的48～72h左右，反复冻融三次，收获病毒，放于-80℃备用。

[0012] 所述的猪细小病毒PPVGD株在制备猪细小病毒灭活疫苗中的应用。

[0013] 一种猪细小病毒灭活疫苗，含有灭活后的上述猪细小病毒PPVGD株。

[0014] 本发明将猪细小病毒PPVGD株病毒液与油乳剂混合制成乳化剂；

[0015] 所述的油乳剂优选为白油乳剂；

[0016] 将上述乳化剂对350g左右健康豚鼠，在28d后采血，检测到HI抗体效价达1：128以上，几何平均为1：194，而对照组豚鼠猪细小病毒抗体显示阴性；对四月龄左右的猪细小病毒抗体阴性的猪进行免疫，在28d后采血，检测到HI抗体水平达1：64以上，几何平均为1：147，而对照组的猪细小病毒抗体显示阴性。说明以广东分离株PPVGD株制备的灭活疫苗接种豚鼠和后备母猪后具有良好的免疫原性。

[0017] 本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：

[0018] (1)本发明采用甲醛作为灭活剂，有文献介绍甲醛对动物体的影响较小。本发明采用0.2％的甲醛，24h来灭活猪细小病毒液。将灭活的病毒液接种ST细胞经盲传3代测血凝效价为0，ST细胞未出现CPE。所以最终确定0.2％甲醛，24h小时用来灭活猪细小病毒液。

[0019] (2)本发明证明在免疫豚鼠28d后，采血测HI抗体效价可达1：128以上，几何平均为1：194。在猪的免疫试验中，免疫之前，对猪细小病毒抗体阴性的后备母猪进行采血进行HI检测，筛选出猪细小病毒抗体阴性的猪进行试验。本发明证明，在免疫28d后，采血测HI，抗体效价可达1：64以上，几何平均约为1：147。综上所诉，本发明表明了以广东分离株PPVGD株制备的灭活疫苗接种豚鼠和后备母猪后具有良好的免疫原性，且略高于商品化的灭活疫苗。

附图说明

[0020] 图1是组织病料中PPV的PCR检测结果；其中，泳道1、2是阴性对照；泳道3、4是病料中PPV的PCR扩增产物；泳道5、6是阳性对照；泳道M是DNA Marker DL2000；

[0021] 图2是PPV接种于ST细胞后的病变细胞与正常的ST细胞，其中A为病变的ST细胞；B为正常的ST细胞；

[0022] 图3是猪细小病毒PPVGD全基因各片段PCR扩增结果；其中，泳道M是DNA Marker DL5000；泳道1是P1扩增结果；泳道2是P2扩增结果；泳道3是P3扩增结果；泳道4是P4扩增结果；泳道5是P 5扩增结果；

[0023] 图4是猪细小病毒PPVGD全基因各片段质粒PCR扩增结果；其中，A是P1扩增结果；B是P2扩增结果；C是P3扩增结果；D是P4扩增结果；E是P5扩增结果；

[0024] 图5是NS1和VP2基因序列系统发育进化树；其中，A是NS1基因序列系统进化树；B是VP2基因序列系统发育进化树。

具体实施方式

[0025] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

[0026] 实施例1猪细小病毒毒株PPVGD的分离鉴定和生物学特性的研究

[0027] 1材料和方法

[0028] 1.1材料

[0029] 1.1.1病料和细胞

[0030] 组织病料采集于广东省某猪场病死猪的肝脏、脾脏、肾脏和淋巴结。ST细胞购自广州速聚有限生物科技有限公司。

[0031] 1.1.2 HA试剂配制

[0032] 生理盐水的配制：氯化钠0.9g，溶于100mL三蒸水中，高压灭菌后4℃保存备用。

[0033] 抗凝剂(3.8％柠檬酸钠)的配制：取柠檬酸钠3.8g，加蒸馏水到100mL，溶解后过滤，装瓶，121℃高压灭菌15min，4℃保存。

[0034] 0.6％豚鼠红细胞的制备：按常规方法心脏采集健康豚鼠血液(抗凝剂：豚鼠血液＝1:9)，将血液注入离心管中，2000rpm，离心10min，弃去上清，用生理盐水清洗沉淀的红细胞，如此反复清洗三次之后，加生理盐水制成0.6％的豚鼠红细胞悬液。

[0035] 25％高岭土的配制：高岭土25g，定容于100mL三蒸水中，高压灭菌后4℃保存备用。

[0036] 1.2引物设计

[0037] 参考Xu X等人的文章中在非结构基因NS1设计的PPV引物(Pf、Pr)作为检测引物，扩增片段大小为265bp。引物有上海生工生物有限公司合成。

[0038] Pf：5′-AGTTAGAATAGGATGCGAGGAA-3′；

[0039] Pr：5′-AGAGTCTGTTGGTGTATTTATTGG-3′；

[0040] 1.3病料处理和PCR检测

[0041] 1.3.1病料处理

[0042] 将采集疑似PPV的病料组织，经研钵研磨后加入青链霉素和PBS(双抗(青链霉素)：PBS＝1:5)，反复冻融三次后2000rpm离心10min，取上清，用0.22μm滤器过滤除菌，保存于-
20℃，备用。

[0043] 1.3.2 PCR检测

[0044] 采用病毒DNA提取试剂盒提取处理。以组织病料的DNA为模板，进行PCR反应。反应体系为2μL DNA模板，各1μL上下游引物(Pf、Pr)，2μL dNTPs，2.5μL 10×Ex Taq buffer，and 0.25U Ex Taq聚合酶，补足超纯水至25μL，设阴阳性对照。混匀后于PCR，反应条件为预变性94℃，5min；变性94℃，30s，退火45℃，30s，延伸72℃30s，共30～35个循环；最后，终延伸72℃，10min。反应结束后，取5μL PCR产物用1％的琼脂糖凝胶(含6μL/100mLGoldVe)进行电泳。

[0045] 1.4病毒的培养

[0046] PCR检测阳性的病料，按照维持液量的10％接种于长至约60％的ST细胞，置37℃，5％CO2培养箱中培养，细胞病变达约80％，反复冻融三次，收获病毒。若没有病变，盲传直至出现稳定的细胞病变，此后按培养液的2％接毒，将该毒株连续传代直至达到稳定的效价。

[0047] 以DMEM加10％的胎牛血清作为ST细胞的培养液。

[0048] 1.5细胞病变观察

[0049] 将形态良好，长至50％～60％的ST单层细胞，弃培养液，将病毒按照维持液量的2％接种于ST细胞，置37℃，5％CO2恒温培养箱观察，一般接毒后30h左右细胞出现病变。

[0050] 1.6病毒血凝(HA)效价的测定

[0051] 在96孔V型反应板上加入25μL生理盐水于反应板第1孔至第12孔，再加25μL PPVGD细胞培养物于第一孔，按倍比稀释至第11孔，第11孔弃去25μL，第12孔，作阴性对照。每孔加0.6％的豚鼠红细胞25μL，在微量震荡器上震荡30s，置于37℃温箱，静置60min后观察结果。
结果判定在阴性对照孔不发生凝集的条件下，即可对实验组进行结果判定。待检病毒的血凝效价为红细胞发生100％凝集的最高病毒稀释倍数。

[0052] 1.7理化性质鉴定

[0053] 取5支灭菌的离心管，在超净台内加入1mL PPVGD细胞培养液。第一管(耐氯仿试验)，加入终浓度为4.8％的分析纯氯仿，振荡混匀，置4℃，作用10min，随后，500rpm离心5min，然后取上清备用；第二管(耐酸试验)用0.1moL/L的盐酸调PH至3.0，置37℃水浴作用
2h，再用5.6％的NaHCO3溶液将PH调至7.2；第三管(耐热试验)，置56℃水浴中作用30min；第四管(耐胰蛋白酶试验)，加入终浓度为1％的胰蛋白酶37℃处理1h后用灭活胎牛血清终止其作用；第5管，不处理作为阳性对照。用96孔微型板测定血凝效价，处理组与各自对照组，血凝的滴度相差3个数量级以上，说明结果阳性，在3个数量级以内结果阴性。

[0054] 2结果

[0055] 2.1病料检测结果

[0056] 从疑似PPV感染的组织病料中提取DNA，进行PCR扩增，扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测表明，获得约265bp的特异性条带(图1)，与预期片段大小相等。序列如SEQ ID NO：4所示。

[0057] 2.2 PPVGD株的分离培养与细胞病变观察

[0058] 将处理后的组织病料接种于长至60％的ST传代细胞，正常ST细胞紧密的贴壁生长，接毒后的细胞内颗粒物质增多，接着细胞脱落，呈网状，视野中有空洞，很多细胞发生裂解、破碎，部分细胞拉长的碎片仍贴在细胞瓶壁上(图2)。

[0059] 2.3病毒血凝(HA)效价的测定

[0060] PPVGD株，经过ST细胞增殖，HA稳定在29。

[0061] 2.4理化特性的鉴定

[0062] 表1理化特性的检测结果

[0063]

[0064]

[0065] 3讨论

[0066] 血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验是检测猪细小病毒常用的实验室方法，其优点就是成本低，时间短，易于操作；但是结果的判定受到多种因素的影响。第一，缓冲液的选择，如果用PBS，则对PBS的PH值具有较高的要求，文献中大多数报道，一般用PH＝7.2的PBS缓冲溶液。最好是现用现配，或者不超过1个月。对于放久了的PBS，用时最好测PH，PH或高或低都会影响结果的判定。为了方便起见，本发明采用0.9％的NaCl溶液，即生理盐水作为试验所需的缓冲溶液。第二，豚鼠红细胞的配制，豚鼠红细胞的配制准确性直接影响结果的判定。离心时速率和时间不同，造成红细胞的压积也不同，所配制出的红细胞百分比就有差异。大多数文献中，采用2000rpm，离心10min，配置成0.6％的豚鼠红细胞作为血凝或血凝抑制试验的使用红细胞。第三，四单位病毒的配制是影响判定血凝抑制结果的关键因素，值得注意的是四单位病毒要现用现配，以及四单位病毒的检验时准确判定结果。第三、操作原因，如在加豚鼠红细胞的过程中，可能会出现细胞在枪头上挂滴的现象；倍比稀释病毒时可能造成孔内有气泡等等情况都会影响结果的判定，所以，认真操作和多加练习，对以达到更加接近精确判定结果具有很大的实际性意义。

[0067] 通过对PPVGD株理化特性研究，结果表明该毒株经氯仿、56℃热处理、PH3.0的酸处理和胰酶处理过程后，经ST细胞培养观察对细胞的感染力无明显改变，引起的致细胞病变作用(CPE)与文献报道的一致，说明该毒株对上述理化因素均不敏感。以PPVGD细胞毒DNA为模板，进行PCR扩增，其产物与预期大小一致，与其他PPV毒株同源性较高。因此，本实验成功筛选出一株病毒血凝效价较高，且有明显细胞病变的猪细小病毒毒株，并对其生物学特性进行了研究。

[0068] 因此，所述的猪细小病毒(porcine parvovirus，PPV)，命名为猪细小病毒PPVGD株，其保藏信息为：保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期：2016年03月18日，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：V201618。

[0069] 实施例2猪细小病毒株PPVGD的全基因组克隆与序列分析

[0070] 1材料与方法

[0071] 1.1材料

[0072] 猪细小病毒株PPVGD，KOD-plus酶，PCR仪，TAE溶液琼脂糖，EB替代物，T载体，提病毒DNA试剂盒。

[0073] 1.2方法

[0074] 1.2.1引物设计

[0075] 从Gebank下载公布的PPV基因序列，设计5对相互重叠片段的引物(表2)，用于扩增包括全部编码区在内的全基因序列。引物有上海生工生物工程有限公司合成。

[0076] 表2扩增PPV全基因的引物

[0077]

[0078] 1.3病毒DNA的提取和全基因扩增

[0079] 用病毒DNA提取试剂盒提取病毒DNA。以DNA为模板进行PCR扩增。

[0080] 扩增体系：1μL DNA，各0.75μL上下游引物，1.0μL Mg2SO4，2.5μL dNTPs，2.5μL 10×KOD-plus buffer，0.5μL KOD-plus聚合酶，用灭菌超纯水补足25μL。

[0081] 反应过程：预变性94℃，2min；变性94℃，15s，退火51～59℃(表2)，30s，延伸68℃，60～150s(具体时间根据表2)，30～35个循环；终延伸68℃，7min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶(含6μL/100mL EB替代物)电泳检测。

[0082] 若PCR产物为阳性，将PCR产物回收纯化后与T载体连接，经转化、提取质粒等过程，将质粒送至上海生工生物股份有限公司。

[0083] 1.4 PPV全基因组序列的测定与分析

[0084] 将由上海生工生物有限公司成功测序后的5段序列拼接得到PPVGD全基因序列。用DNAstar软件将PPVGD全基因序列与Genbank上已发表的序列进行比较和分析。所选用毒株均为Genbank上收录的典型毒株(表3)。

[0085] 表3所用毒株的登录号

[0086] 毒株 登录号 来源 年份NADL-2 NC001718 美国 1976
Kresse U44978 美国 1985
VRI-1 AY390557 韩国 2003
BQ EU790641 中国 2009
Nanjing20080101 FJ822038 中国 2009
SR-1 DQ675456 中国 2006
J-PPV KF742500 中国 2014
HN-Z3 AY789534 中国 2004
ZJ EU790642 中国 2009
China AY583318 中国 2009
HN-K KF429255 中国 2013
Tornau AY684869 德国 2002
IDT AY684872 德国 2006
27a AY684871 德国 2001
106b AY684870 德国 2002
15a AY684865 德国 2001
21a AY684868 德国 2001
143a AY684867 德国 2002
225b AY684864 德国 2002

[0087] 2结果

[0088] 2.1猪细小病毒PPVGD各片段扩增结果

[0089] 对猪细小病毒PPVGD各片段进行扩增，5段重叠片段长度分别为2201bp、823bp、895bp、1065bp和754bp，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳测序结果如图3和图4，扩增产物大小与预期大小一致。

[0090] 2.2测序与拼接

[0091] 用DNAstar软件将5段重叠片段的测序结果进行拼接，得到猪细小病毒PPVGD全基因序列。拼接结果表明，该猪细小病毒分离株的全基因序列为4251bp，序列如SEQ ID NO：1所示。

[0092] 2.3 PPV不同毒株NS1和VP2基因的核苷酸序列同源性分析

[0093] 利用DNAstar序列分析软件对PPVGD株的NS1和VP2基因核苷酸序列分别与来自Genbank中的20株NS1基因核苷酸序列和18株VP2基因核苷酸序列进行同源性比较，如表4。由表可知，PPVGD NS1基因序列与其他PPV毒株的NS1基因序列同源性在98.4％～99.9％之间；PPVGD NS1基因序列与J-PPV、NADL-2、HN-K株的NS1基因序列同源性最高，与Tornau株的NS1基因序列的同源性最低。PPVGD VP2基因序列与其他PPV毒株的VP2基因序列同源性在
98.1％～99.6％之间，PPVGD VP2基因序列与HN-K株的VP2基因序列同源性最高，与Nanjing20080101株的VP2基因序列的同源性最低。

[0094] 表4 PPVGD与参考毒株的同源性比较

[0095]

[0096] 2.4 PPV NS1基因和VP2基因系统进化树的构建

[0097] 利用DNAstar序列分析软件对PPVGD分离株的NS1基因序列和VP2基因序列及来自Genbank中的20株NS1基因核苷酸序列和18株VP2基因核苷酸序列进行同源性比较，并分别生成PPVNS1基因和VP2基因系统进化树(如图5)。由图可知，PPVGD与HN-K株的关系最近，与IDT株的关系最远。

[0098] 3讨论

[0099] 猪细小病毒是引起母猪繁殖障碍的主要病原之一，可以导致母猪发生流产、死胎、胎儿木乃伊化及新生胎儿死亡等症状。由于该病毒常与其他病毒和细菌混合感染或继发感染，使猪繁殖障碍情况加剧，危害更大。目前，我国预防猪细小病毒主要是免疫灭活疫苗，在一定程度上有效的控制猪细小病毒的感染，但是在部分地区仍然发生，给这些地区带来严重危害。所以，了解我国猪细小病毒的变异和流行状况是非常有必要的，有利于对猪细小病毒的防控。

[0100] 猪细小病毒全基因片段长度5000多bp，在3′端，形成“Y”型的发夹结构，5′端，形成“U”型的发夹结构，常规PCR无法扩增出两端部分。本研究根据NADL-2株的全基因序列利用Primer5.0引物设计软件设计5对引物，并且将引物经过优化，对PPV编码区部分的全基因序列分段进行扩增，通过序列拼接成功获的PPVGD编码区的全基因序列。利用DNAStar序列分析软件对PPVGD株NS1基因和VP2基因序列分别与其他毒株的NS1基因和VP2基因序列进行同源性比较和进化树分析，发现PPVGD NS1基因序列与J-PPV、NADL-2、HN-K株最近；PPVGDVP2基因序列与HN-K株最近。与其他PPV毒株NS1基因和VP2序列同源性高达98％以上。这对于今后在了解广东地区猪细小病毒的流行情况提供了一定的参考。

[0101] 实施例3猪细小病毒培养条件的优化

[0102] 1材料与方法

[0103] 1.1材料

[0104] ST细胞，购自广州速聚生物科技有限公司；PPVGD株：保藏编号为CCTCC NO：V201618。

[0105] 2方法

[0106] 2.1不同接毒的方式的选择

[0107] 异步接毒：将具有稳定血凝效价的病毒液，按照维持量的2％接种于长至60％左右的ST细胞中，置37℃，5％CO2培养箱中孵育1h后，补加培养液，使血清的终浓度为2％。置于37℃，5％CO2培养箱中观察48～72h左右，当80％的细胞出现病变时，反复冻融三次，置-80℃保存备用。

[0108] 同步接毒：常规培养ST细胞，用DMEM加10％的胎牛血清作为ST细胞的培养液；在细胞传代的同时接种第五代病毒液，置37℃，5％CO2培养箱中培养，培养24h后弃掉细胞培养上清液换成不含胎牛血清的DMEM培养液，继续培养，待贴壁细胞出现80％细胞病变时收获病毒。将收获病毒反复冻融三次，置-80℃保存备用。

[0109] 血凝试验：用HA试验，分别测病毒液的血凝效价。

[0110] 2.3细胞接毒剂量的优化

[0111] 将具有稳定血凝效价的病毒液，按照维持量的1％、2％、3％、5％分别接种于长至60％左右单层的ST细胞，在37℃，5％CO2培养箱中培养至80％左右细胞病变时将其收获，反复冻融三次，分别测血凝效价。结合血凝效价选择最佳的细胞接毒量。

[0112] 2.4接种时间的优化

[0113] 将具有稳定血凝效价的病毒液，按照维持液的2％病毒液接种于长至30％、60％、90％、100％单层的ST细胞中，在37℃，5％CO2培养箱中培养至80％左右细胞病变时将其同时收获，反复冻融三次，分别测血凝效价。结合血凝效价，选择最佳的接种时间。

[0114] 2.5收获病毒的时间优化

[0115] 将具有稳定血凝效价的病毒液，按照维持液的2％病毒液接种于长至60％左右的ST细胞分别在36h、48h、60h、72h、84h时收获病毒，反复冻融三次，分别测血凝效价。结合血凝效价及病变情况，选择最佳的收获病毒的时间。

[0116] 3结果

[0117] 3.1不同接毒的方式的选择

[0118] 异步接毒收获的病毒液的血凝效价为29；同步接毒收获的病毒液的血凝效价为27。综上，确定病毒的接种方式为异步接种。

[0119] 3.2细胞接毒剂量的优化

[0120] 将具有稳定血凝效价的第五代病毒液，分别以不同的剂量接种于ST细胞，接毒剂量越大，病毒滴度不一定越高。如表5，确定2％的为最佳的接毒剂量。

[0121] 表5在不同接毒剂量的条件下的病毒传代收获病毒液的血凝效价

[0122]病毒量 1％ 2％ 3％ 5％
8 9 7 5
HA 2 2 2 2

[0123] 3.3接种时间的优化

[0124] 将具有稳定血凝效价的第五代病毒液，分别以2％接种剂量接种于不同的ST细胞量，其他条件相同，测得血凝效价。如表6，确定当细胞长至约60％时接毒最佳。

[0125] 表6在不同的ST细胞量的条件下病毒传代收获病毒液的血凝效价

[0126]细胞量 30％ 60％ 90％ 满层
HA 24 29 25 22

[0127] 3.4收获病毒的时间优化

[0128] 将具有稳定血凝效价的第五代病毒液，按照维持液的2％病毒液接种于长至60％左右的ST细胞，分别选择5个时间点收获病毒，测得的病毒血凝效价(表7)。细胞在24小时开始产生细胞病变，36h时约60％细胞处于正常生长状态，48h时50％～60％细胞变圆，破碎，部分脱落，84h时100％细胞产生细胞病变，绝大部分脱落，且60h时收获病毒血凝效价最高。因此，确定接毒后的60h为最佳的收获病毒时间，病变程度为80％～90％。

[0129] 表7在不同收获病毒时间的条件下病毒传代收获病毒液的血凝效价

[0130]收毒时间 36h 48h 60h 72h 84h
HA 25 27 29 28 27

[0131] 3讨论

[0132] PPV的复制需要借助于宿主细胞蛋白质和核酸的合成体系，所以PPV在处于分裂期的细胞中才能增殖，主要是利用细胞源的DNA合成酶。文献中，使用ST和PK15传代细胞增殖PPV的最多，还有牛的肾原代细胞以及人的某些传代细胞也可以繁殖PPV，但是PPV在不同细胞上的适应性有差异。本实验还发现这两种细胞非常容易培养，而且病毒在这两种细胞上的适应性也比较好，有文献将ST细胞和PK15进行PPV的增殖做进一步比较，发现两者不仅培养猪细小病毒的过程中都出现较为明显的细胞病变，而且在30h左右时开始产生细胞病变，并能获得较高的病毒血凝效价，但是ST细胞增殖病毒血凝效价比在PK15上高2log。

[0133] 由于PPV的增殖是在细胞周期的晚S期和早G2期，即细胞生长的旺盛期，因此必须是在细胞长至60％左右进行。本发明表明PPVGD株的异步接毒比同步接毒所获得的血凝效价较高，可能正如有的文献描述的原因：在病毒吸附过程中，与异步接毒相比，同步接毒的病毒被培养液稀释，不利于病毒的吸附。因此本发明选用长至约60％的ST细胞进行接毒，即异步接毒。

[0134] 本发明在接毒剂量优化中得出接毒剂量越大，病毒滴度不一定越高。由于接毒量多，造成细胞过早产生细胞病变，不能使细胞加大程度的分裂，故而所增殖的病毒量就会降低，本发明将不同的接毒剂量分别接种于约60％的ST细胞，在保证其他条件一致的情况下收获病毒分别测血凝效价，再结合病变情况，进而得到2％为最佳的接毒剂量。

[0135] 实施例4猪细小病毒灭活疫苗的制备及免疫效力检测

[0136] 1材料与方法

[0137] 1.1材料

[0138] ST细胞，购自广州速聚生物科技有限公司；PPVGD株：保藏编号为CCTCC NO：V201618。

[0139] 豚鼠(350g左右)：购自南方医科大学；四月龄的猪细小病毒抗体阴性的后备母猪：深圳农牧实业有限公司。

[0140] 灭活剂：甲醛

[0141] 乳化剂：白油佐剂，佐剂为油佐剂，来自广东省永顺有限公司。其中，白油为杭州炼油厂产品；硬脂酸铝为温州市化学用料厂产品；司本80和吐温-80为上海申宇医药化工有限公司产品。

[0142] 0.6％豚鼠红细胞的制备

[0143] 按常规方法心脏采集健康豚鼠血液(3.8％柠檬酸钠)：豚鼠血液＝1:9)，将血液注入离心管中，2000rpm，离心10min，弃去上清，用生理盐水清洗沉淀的红细胞，如此反复清洗三次之后，加生理盐水制成0.6％的豚鼠红细胞悬液。

[0144] 1.2方法

[0145] 1.2.1病毒增殖

[0146] 将病毒液，按照维持液的2％接种于长至60％左右ST细胞，置37℃，5％CO2培养箱中培养，细胞病变达约80％(48～72h)收毒，反复冻融三次，-20保存备用。

[0147] 1.2.2细菌检验：酪胨琼脂(G.A)4支，硫乙醇酸盐培养基(T.G)4支，葡萄糖蛋白胨(G.P)2支，T.G，G.A分别置37℃和25℃环境中，G.P置25℃。每支接种待测病毒0.2mL，同时作阴性对照。在上述环境中连续观察7d，每天观察有无细菌和霉菌生长。

[0148] 所述的酪胨琼脂(G.A)：胰酪蛋白胨15g葡萄糖5g、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g、酵母浸出粉5g、琼脂粉10g、NaCl 2.5g、0.2％美兰溶液0.5mL、蒸馏水加至900mL，将以上成分混匀，加热溶解，NaOH溶液调整PH7.0～7.2，定容至1000mL分装于中性容器中，121℃灭菌30min，4℃保存备用。

[0149] 所述的硫乙醇酸盐培养基(T.G)：胰酪蛋白胨15g、葡萄糖5g、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g、琼脂粉0.5g、NaCl 2.5g、酵母浸出粉5g、硫乙醇酸钠0.5g、0.2％美兰溶液0.5mL、蒸馏水加至900mL，将以上成分混匀，加热溶解，NaOH溶液调整PH7.0～7.2，定容至1000mL分装于中性容器中，121℃灭菌30min，4℃保存备用。

[0150] 所述的葡萄糖蛋白胨(G.P)：葡萄糖20g、蛋白胨1g、酵母浸出粉2.5g、KH2PO4 1g、MgSO40.5g、琼脂粉0.4g、蒸馏水加至900mL，将以上成分混匀，加热溶解，NaOH溶液调整PH7.0～7.2，定容至1000mL分装于中性容器中，121℃灭菌30min，4℃保存备用。

[0151] 1.2.3血凝效价的测定

[0152] 在96孔V型反应板上加入25μL生理盐水于反应板第1孔至第12孔，再加25μL PPVGD细胞培养物于第一孔，按倍比稀释至第11孔，第11孔弃去25μL，第12孔，作阴性对照。每孔加0.6％的豚鼠红细胞25μL，在微量震荡器上震荡30s，置于37℃温箱，静置60min后观察结果。
结果判定在阴性对照孔不发生凝集的条件下，即可对实验组进行结果判定。待检病毒的血凝效价为红细胞发生100％凝集的最高病毒稀释倍数。

[0153] 1.2.4病毒灭活及灭活检验

[0154] 1.2.4.1灭活时间的确定

[0155] 病毒液中加入终浓度为0.2％的甲醛，混匀，37℃进行灭活期间，每隔2小时摇动病毒悬液一次。分别于24h、36h、48h取出病毒液进行灭活检验，同时设阳性对照。

[0156] 1.2.4.2灭活病毒液的检测

[0157] 病毒灭活效果检验：将不同时间段取出的病毒液分别种ST细胞上，连续盲传三代，期间观察细胞情况；盲传三代后将细胞反复冻存3次，检测培养液的血凝活性，判断灭活效果。

[0158] 细菌检验：酪胨琼脂(G.A)4支，硫乙醇酸盐培养基(T.G)4支，葡萄糖蛋白胨(G.P)2支，T.G，G.A分别置37℃和25℃环境中，G.P置25℃。每支接种待测灭活病毒0.2mL，同时作阴性对照。在上述环境中连续观察7d，每天观察有无细菌和霉菌生长。

[0159] 1.2.4乳化：

[0160] PPVGD灭活疫苗的制备

[0161] 油相制备：白油(94％)、硬脂酸铝(2％)、司本80(6％)，具体步骤如下：先倒少量油于桶中，边搅拌边加入硬脂酸铝，充分混匀(不可产生团块)，将剩余的油全部加入其中，放置液化气炉上加热，边搅拌边加入司本80。不断加热和搅拌(触底)，期间出现大量泡沫，继续搅拌直至白沫消失，液面上有烟出现。不可过分加热，易糊，稍作冷却后，用6层纱布加1层细孔滤筛趁热过滤，冷却。次日，高压灭菌(121℃，40min)，备用。

[0162] 水相制备(15mL)：首先将灭活好的PPVGD病毒液冷却至室温，再将已经温热的吐温-80(4％)加入灭活后的PPVGD病毒液(96％)中，即14.4mL灭活病毒液中加入0.6mL吐温，充分摇匀。

[0163] 乳化(100mL)：水相：油相＝1：2；即15mL水相和30mL油相。取白油(油相)30mL于100mL烧杯中，用乳化机10000rpm，乳化1min后，向烧杯中缓慢加入制备好的水相，再
16000rpm，乳化5min。最后1min，加入1％硫柳汞液，使其终浓度为0.01％，乳化结束。检验合格后，定量分装，加塞密封4℃保存。

[0164] 1.2.4.1灭活疫苗的检验

[0165] 1.2.4.2外观检验：肉眼观察制备的猪细小病毒灭活疫苗的外观。

[0166] 1.2.4.3冷水表面检验：取制备的灭活疫苗，缓慢的滴一滴于冷水中，观察油滴是否扩散。

[0167] 1.2.4.4粘稠度检验：取口径为1.2mm的1mL吸管于室温下吸满1mL乳化剂，计时以吸管呈垂直状态自然流出0.4mL油乳剂所用的时间作为判定标准。

[0168] 1.2.4.5稳定性检验：将乳化剂加满5mL离心管，3000rpm离心15min，以不分层为稳定性良好；37℃放置21d，观察是否有破乳、分层现象。

[0169] 1.2.4.6无菌检验：酪胨琼脂(G.A)4支，硫乙醇酸盐培养基(T.G)4支，葡萄糖蛋白胨(G.P)2支，T.G，G.A分别置37℃和25℃环境中，G.P置25℃。每支接种待测病毒0.2mL，作阴性对照。在上述环境中连续观察7d，每天观察有无细菌和霉菌生长。

[0170] 1.2.4.7疫苗的安全性检验

[0171] 将制备的猪细小病毒灭活疫苗接种350g左右的猪细小病毒抗体阴性(HI<＝1:8)豚鼠14只，每只肌肉注射0.5mL，观察14d。

[0172] 1.3疫苗效力检验：

[0173] 1.3.1豚鼠免疫试验

[0174] 将15只豚鼠(HI<＝1:8)分为乳化剂注射组、阳性对照组、阴性对照组三组，每组5只，注射组每只注射0.5mL猪细小病毒乳化剂；阴性对照组每只豚鼠注射生理盐水0.5mL；阳性对照组每组注射市场灭活疫苗(所述的市场灭活疫苗为猪细小病毒灭活疫苗，购自武汉科前动物生物制品有限责任公司)0.5mL。28d后采血进行HI检测。

[0175] 1.3.2猪免疫试验

[0176] 将15头猪细小病毒抗体阴性(HI<＝1:8)的后备母猪分为乳化剂注射组、阴性对照组和阳性对照组三组，每组5头，注射组每头注射2mL猪细小病毒灭活疫苗；阴性对照组每头注射2mL生理盐水；阳性对照组注射市场灭活疫苗(所述的市场灭活疫苗为猪细小病毒灭活疫苗，购自武汉科前动物生物制品有限责任公司)，每头2mL。接种后28d采血进行HI检测。

[0177] 1.4抗体水平检测

[0178] 1.4.1血液处理：37℃，静置1h，3000rpm，离心10min，取血清分装，-20℃保存备用。

[0179] 高岭土混合液：待检血清＝1:1混匀，室温静置20min，期间摇动2～3次，2500rpm离心10min，取上清，向上清，加20％～50％的豚鼠红细胞，37℃水浴30min，期间摇动2～3次，2500rpm，离心10min，取上清，即为血凝抑制试验的使用血清。

[0180] 1.4.2血凝及血凝抑制试验

[0181] 1.4.2.1血凝试验：在96孔V型反应板上加入25μL生理盐水于反应板第1孔至第12孔，再加25μL病毒细胞培养物于第一孔，倍比稀释至第11孔，第11孔弃去25μL，第12孔作为阴性对照。每孔加0.6％的豚鼠红细胞25μL，在微量震荡器上震荡30s，置于37℃温箱，静置30min～60min后观察结果。结果判定在阴性对照孔不发生凝集的条件下，即可对实验组进行结果判定。待检病毒的血凝效价为红细胞发生100％凝集的最高病毒稀释倍数。

[0182] 1.4.2.2四单位病毒的配制及检验

[0183] 根据HA实验结果，确定病毒的血凝价，配成四单位病毒溶液。

[0184] 对四单位病毒进行HA试验，最佳结果前两孔100％凝集，第三孔50％凝集，后面不凝集。

[0185] 1.4.2.3血凝抑制试验

[0186] 在96孔V形微量板上进行，用固定病毒稀释血清方法，从第1孔至第12孔各加25μL PBS，11孔和12孔，分别为四单位病毒液和抗病毒血清对照。第1孔，加待检血清25μL，混合均匀做倍连续稀释，即吸25μL至第二孔直至第10孔。然后每孔加入已稀释的4单位血凝抗原，最后一孔作为阴性对照。于振荡器上振荡30s，放于37℃温箱孵育20～30min，之后每孔加25μL 0.6％豚鼠红细胞，于振荡器上振荡30s，放于37℃温箱放置60min。结果判定：以能抑制100％红细胞凝集的血清最高稀释倍数作为被检血清的血凝抑制抗体效价。

[0187] 2结果

[0188] 2.1猪细小病毒血凝效价的测定

[0189] PPVGD株在ST细胞上增殖HA稳定在29。

[0190] 2.2无菌检测

[0191] 酪胨琼脂(G.A)、硫乙醇酸盐培养基(T.G)、葡萄糖蛋白胨(G.P)均无细菌和霉菌生长。

[0192] 2.3病毒灭活、检验及灭活疫苗的检验

[0193] 2.3.1细胞观察

[0194] 用0.2％甲醛灭活病毒，分别在灭活24h、36h、48h时取出病毒液，在ST细胞上盲传3代，同时观察细胞病变情况，灭活24h、36h、48h灭活的病毒在ST细胞上均没有产生细胞病变，且细胞生长情况良好。

[0195] 2.3.2血凝性检验

[0196] 灭活24h、36h、48h的病毒液在ST细胞上盲传3代后血凝效价均为20。

[0197] 2.3.3细菌检验

[0198] 酪胨琼脂(G.A)、硫乙醇酸盐培养基(T.G)、葡萄糖蛋白胨(G.P)均无细菌和霉菌生长。

[0199] 2.3.4外观检验

[0200] 肉眼观察制备的猪细小病毒灭活疫苗的外观是乳白色的均质乳剂。

[0201] 2.3.5冷水表面检验

[0202] 取一支洁净的吸管，吸少量疫苗滴于冷水表面，除第一滴外，均应30s内不扩散。

[0203] 2.3.6粘稠度检验

[0204] 取口径为1.2mm的1mL吸管于室温下吸满1mL乳化剂，吸管呈垂直状态自然流出0.4mL油乳剂所用的时间需要4s，在2～6s范围内，说明粘度合格，适合于注射。

[0205] 2.3.7稳定性检验

[0206] 将乳化剂加满5mL离心管，3000rpm离心15min，无分层和破乳现象；37℃放置21d，观察也无破乳和分层现象，说明其具有一定的稳定性。

[0207] 2.3.8疫苗的安全性检测

[0208] 将制备的猪细小病毒灭活疫苗免疫豚鼠后，观察14d，豚鼠均健康生长，无不良反应。

[0209] 2.3.9猪细小病毒血凝抑制抗体效价(HI)测定结果

[0210] 表8豚鼠免疫试验结果

[0211]  1 2 3 4 5 几何平均数
阳性对照(HI) 128 128 64 128 256 128
乳化剂注射组(HI) 128 256 512 128 256 194

[0212] 如表8所示，豚鼠在注射猪细小病毒灭活疫苗后28d，HI方法检测其抗体效价结果：阳性对照组的抗体效价的几何平均为1：128，而试验组(乳化剂注射组)的抗体效价的几何平均为1：194。阴性对照组豚鼠抗体水平呈阴性(<＝1：8)。

[0213] 表9猪免疫试验结果

[0214]   1 2 3 4 5 几何平均数阳性对照(HI) 128 64 64 128 256 111
乳化剂注射组(HI) 64 128 128 256 256 147

[0215] 如表9所示，后备母猪在注射猪细小病毒灭活疫苗后28d，HI方法检测抗体效价结果：阳性对照组的抗体效价几何平均约为1：111，而试验组(乳化剂注射组)的抗体效价的几何平均约为1：147。阴性对照组的猪的猪细小病毒抗体水平呈阴性(<＝1：8)。

[0216] 本发明中的豚鼠和猪免疫实验表明，实验室制备的猪细小病毒灭活疫苗能够刺激机体产生高水平的抗体，并且较高于商品化的灭活疫苗。

[0217] 3讨论

[0218] 猪细小病毒作为主要的繁殖障碍病之一，对养猪业造成严重的损失。现在对该病主要的措施预防接种。而免疫灭活疫苗是对该病最主要的预防手段，相比弱毒疫苗，灭活疫苗主要有安全有等优点，因此在国内被广泛应用。

[0219] 本发明采用的猪细小病毒是本发明分离和鉴定的毒株，经发明证明，本毒株有良好的特异性、稳定性、免疫性等，可用于灭活疫苗的制备。经ST细胞分离培养，传代第5代血凝效价基本稳定，经测定血凝效价为29。

[0220] 本发明采用甲醛作为灭活剂，有文献介绍甲醛对动物体的影响较小。本发明采用0.2％的甲醛，24h来灭活猪细小病毒液。将灭活的病毒液接种ST细胞经盲传3代测血凝效价为0，ST细胞未出现CPE。所以最终确定0.2％甲醛，24h小时用来灭活猪细小病毒液。

[0221] 在豚鼠的免疫发明中，选用了350g左右的健康豚鼠。在实际饲养过程中，要注意豚鼠的饲养，豚鼠自身不能合成维生素C，所以每天要饲喂含维生素C的食料或者在水中添加维生素C；还有环境方面，比如经常打扫、经常换水、注意通风等。本发明证明在免疫豚鼠28d后，采血测HI抗体效价可1：128以上，几何平均为1：194。在猪的免疫试验中，我们选择在肇庆市的某猪场进行免疫抗体水平检测试验。免疫之前，我们对猪细小病毒抗体阴性的后备母猪进行采血进行HI检测，筛选出猪细小病毒抗体阴性的猪进行试验。本发明证明，在免疫28d后，采血测HI，抗体效价可达1：64以上，几何平均约为1：147。综上所诉，本发明表明了以广东分离株PPVGD株制备的灭活疫苗接种豚鼠和后备母猪后具有良好的免疫原性。

[0222] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。