一种酪蛋白磷酸肽的制备方法

摘要

本发明属于酶促反应生物工程技术领域，具体涉及一种酪蛋白磷酸肽的制备方法。本发明通过可行、经济且适用于工业化生产的制备方法，可以得到脱除乳糖(≤0.5％，以还原糖计)、灰分低(≤0.8％)、有效成分含量高(CPP含量≥92％)、味道纯正、无苦味及其他异味的CPP，且由于脱除了乳糖(特别是无定形乳糖)，使产品的性状稳定，加工性能优异，不会出现褐变、复溶、发粘、结块、产生焦味等变性现象，有利于各种类型补钙产品的添加应用及提高产品在保质期内的稳定性。此外，本发明制备的酪蛋白磷酸肽适用于各类型产品的添加生产，能够提高最终产品的稳定性，具有重要的现实意义。

权利要求

1.一种酪蛋白磷酸肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将干酪素与水混合均匀后，加入碱性溶液调节pH为5-10；其中水的用量为干酪素用量的2-10倍；

(2)加入水解酶进行水解；

(3)水解进行30-60min后，加入调节酶，继续进行水解；

(4)待水解完成后，加入浓度2-4mol/L酸调节溶液的pH至4-5，终止水解反应，得到水解液；

(5)加热水解液进行灭酶处理后，再加入吸附材料，搅拌5-10min后过滤，收集过滤液；

(6)调节过滤液的pH至5-7，用纳滤膜处理后，收集滤液；

(7)向滤液中加入酒精至溶液的酒精度为50-65％，静置后离心，收集沉淀物；

(8)用酒精洗涤沉淀物1-3次后，干燥粉碎过40-100目筛，即得酪蛋白磷酸肽；

步骤(2)中水解酶的用量为干酪素质量的0.1-2％，水解的温度为40-55℃，水解的时间为0.5-8h；

步骤(2)中水解酶包括胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、Alcalase蛋白酶的一种或多种；

步骤(3)中调节酶包括乳糖酶、风味蛋白酶、水解蛋白酶中的一种或多种，用量均为干酪素用量的0.05-0.2％；

水解时，用20-40KHz的超声发生器进行超声；

步骤(5)中吸附材料为400目硅藻土、800目硅藻土和活性白土中的一种或多种混合；

所述400目硅藻土为干酪素用量的20-30％，所述800目硅藻土为干酪素用量的2-5％，所述活性白土为干酪素用量的2-5％；

步骤(6)中纳滤膜为过滤精度为800-1000MWCO/截留分子量为800-1000的卷式纳滤膜；

步骤(7)中静置的温度为4-25℃，静置的时间为4-24h。

2.根据权利要求1所述的酪蛋白磷酸肽的制备方法，其特征在于，步骤(1)中碱性溶液的浓度为2-4mol/L，包括氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙和氨水中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的酪蛋白磷酸肽的制备方法，其特征在于，步骤(5)中加热水解液至78-100℃，加热时间为0.5-1h。

说明书

一种酪蛋白磷酸肽的制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于酶促反应生物工程技术领域，具体涉及一种酪蛋白磷酸肽的制备方法。

背景技术

[0002] 酪蛋白磷酸肽(CPP)为高效的促钙吸收剂，其与钙结合后，可防止钙离子与阴离子酸根结合生成不溶性钙沉淀而导致的钙无法吸收利用。与传统的补钙辅助物质维生素D相比，酪蛋白磷酸肽的钙结合利用率更高、专一性更强(专一促进钙、锌、铁等二价离子吸收，而维D除促钙吸收外还需参与人体多种复杂生理过程)、促钙吸收能力更强(维生素D主要促进小肠上部可饱和的钙的主动运输吸收，CPP除了主动吸收外，还可对小肠下部不可饱和被动扩散吸收，而且钙的被动扩散吸收远大于主动运输吸收，并且这种吸收不受年龄和钙摄入量变化的影响，故亦更利于主动吸收能力较差的婴幼儿童和老人吸收钙质)、性质更稳定(维生素D易氧化变性)、无毒副作用(维D摄入过多会对骨、肾造成损害)，是新一代的高效促钙吸收剂。

[0003] 酪蛋白磷酸肽的市场需求量极大。现有方法生产制备的酪蛋白磷酸肽普遍存在产品质量较低的问题，如水溶性差、味苦、异味重、灰分含量高、有效成分含量较低、杂质多、颜色深、粉末产品流动性差、稳定性差等。此外，生产制备的产品存放时间长容易出现颜色变深、褐变、复溶变黏、结块等问题。将现有方法生产制备的酪蛋白磷酸肽应用于各类产品的加工生产中，加工性能也有明显缺陷，如应用于片剂生产时，与CPP混合后物料容易发粘，混料、过筛等过程粘壁损耗较大，且压片容易粘模、脱模效果不好，影响生产效率及压片感官；压片干燥后容易出现裂片、硬度不足，并且容易在干燥及存放过程中出现药片(或糖片等)颜色变深、状态变粘等。应用于配方奶粉等乳制品或其他固体饮料等生产，长期存放及使用中容易导致产品粉末颜色变深、产生结块等。应用于乳制品饮料或其他饮料，存放一段时间后产品溶液逐渐出现凝絮、沉淀、分相分层等情况，产品稳定性受到制约，生产应用受到限制。

[0004] 还有一些生产制备方法，通过多重分离纯化工序得到高纯度甚至单体结构的酪蛋白磷酸肽，虽然可以解决上述问题，但生产工序繁复，需要应众多高精深的分离纯化设备，制备投入大、成本高，制备工艺难以实现工业化大生产，产品难以得到普及推广应用。

发明内容

[0005] 针对现有技术中的不足，本发明提供了一种酪蛋白磷酸肽的制备方法。本发明通过可行、更经济且适用于工业化生产的方法，制备得到了性质稳定、加工性能优越的酪蛋白磷酸肽，使酪蛋白磷酸肽适用于各类型产品的添加生产，提高最终产品的稳定性，具有重要的现实意义。

[0006] 本发明是通过以下技术方案实现的：

[0007] 一种酪蛋白磷酸肽的制备方法，包括以下步骤：

[0008] (1)将干酪素与水很合均匀后，加入碱性溶液调节pH为5-10；其中水的用量为干酪素用量的2-10倍；

[0009] (2)加入水解酶进行水解；

[0010] (3)水解进行30-60min后，加入调节酶，继续进行水解；

[0011] (4)待水解完成后，加入浓度2-4mol/L酸调节溶液的pH至4-5，终止水解反应，得到水解液；

[0012] (5)加热水解液进行灭酶处理后，再加入吸附材料，搅拌5-10min后过滤，收集过滤液；

[0013] (6)调节过滤液的pH至5-7，用纳滤膜处理后，收集滤液；

[0014] (7)向滤液中加入酒精至溶液的酒精度为50-65％，静置后离心，收集沉淀物；

[0015] (8)用酒精洗涤沉淀物1-3次后，干燥粉碎过40-100目筛，即得酪蛋白磷酸肽。

[0016] 优选地，步骤(1)中碱性溶液的浓度为2-4mol/L，包括氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙和氨水中的一种或多种。

[0017] 优选地，步骤(2)中水解酶的用量为干酪素质量的0.1-2％，水解的温度为40-55℃，水解的时间为0.5-8h。

[0018] 优选地，步骤(2)中水解酶包括胰蛋白酶、胰酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、Alcalase蛋白酶中的一种或多种。

[0019] 优选地，步骤(3)中调节酶包括乳糖酶、风味蛋白酶、水解蛋白酶中的一种或多种，用量均为干酪素用量的0.05-0.2％。

[0020] 优选地，步骤(5)中加热水解液至78-100℃，加热时间为0.5-1h。

[0021] 优选地，步骤(5)中吸附材料为400目硅藻土、800目硅藻土和活性白土中的一种或多种混合。

[0022] 进一步优选地，所述400硅藻土为干酪素用量的20-30％，所述800目硅藻土为干酪素用量的2-5％，所述活性白土为干酪素用量的2-5％。

[0023] 优选地，步骤(6)中纳滤膜为过滤精度为800-1000MWCO/截留分子量为800-1000的卷式纳滤膜。

[0024] 优选地，步骤(7)中静置的温度为4-25℃，静置时间为4-24h。

[0025] 乳糖残留是影响酪蛋白磷酸肽成品稳定性的关键因素，因为乳制品中所含的一般为无定形乳糖，容易吸湿，导致产品粉末变粘、结块；进一步地，在温度和湿度较高的环境下，乳糖容易与伯胺化合物、氨茶碱、苯丙胺、异烟肼、酒石酸盐、枸橼酸盐或醋酸盐、蛋白质、多肽、氨基酸等物质发生美拉德(Maillard)反应，产生棕黄色至棕黑色的物质(类黑素)，碱性条件下则进一步加速该变色反应。反应后酪蛋白磷酸肽粉末呈复溶、结块板结状态，颜色变深、失去流动性，并产生一种焦香的气味，物性产生了巨大变化，不利于各类产品的添加应用；或在各种产品添加酪蛋白磷酸肽后的生产过程中逐渐反应，导致物料变粘、设备粘料严重，增加处理时间、增加加工过程的物料损耗，影响片剂、散剂、胶囊剂等药品、保健食品的制剂成型，或固体饮料、配方乳粉、面粉、杂粮、糖果等食品产品的成型及包装、灌装、定量装量等，又或添加到各类产品后再发生美拉德反应，导致产品颜色变深、性状变粘、或风味发酵乳、调制乳、液体饮料等溶液产生凝絮、沉淀物质析出、出现分层等现象，影响产品稳定性。本发明中，加入乳糖酶能够分解酪蛋白中所含的乳糖，降低水解液中乳糖的含量，实现酪蛋白磷酸肽成品中乳糖残留的最小化或无乳糖残留。

[0026] 本发明中加入风味蛋白酶或水解蛋白酶(枯草杆菌蛋白酶)，能够对反应过程产生的苦味肽等进行酶解，减轻水解产物的苦味及金属味、骚味等不良异味。在本发明的条件下，酪蛋白磷酸肽结构上具有Ser(P)-Ser(P)-Ser(P)-Glu-Glu片段(这些成簇排列的磷酸丝氨酸残基肽段也是CPP与钙、锌等二价离子结合的功能部位)能够抵抗风味蛋白酶、水解蛋白的降解作用，不会导致CPP降解，CPP的这种稳定性也是酪蛋白磷酸肽能在人体环境中发挥持钙促钙吸收作用的重要基础。

[0027] 水解时，还可以用20-40KHz的超声发生器进行超声，辅助水解过程，使水解反应更彻底，提高水解过程脱出乳糖及苦味、异味的效果。

[0028] 本发明中加入800目硅藻土、活性白土能够吸附异味小分子肽、部分未水解完全的乳糖及包合于巨肽团胶体中的乳糖，进一步降低水解液中异味肽、乳糖的残留，同时吸附水解过程中产生的色素，使滤液颜色变浅，有利于后续分离纯化得到颜色纯白的CPP。同时加入400目、800目硅藻土及活性白土，能够使过滤效果更好，提高过滤效率，使滤液更澄清，充分滤除不溶物杂质，使最终成品CPP的水溶性好，溶解后无杂质沉淀，且溶液澄清透亮。本发明的方法中，通过吸附材料吸附处理、纳滤膜处理以及加入酒精处理，能够保证得到颜色洁白的成品。

[0029] 本发明中，在纳滤后的滤液中加入酒精后，体系中残余的少量色素、异味肽、乳糖等小分子杂质主要存在于醇溶液中，CPP则以沉淀的形式析出。

[0030] 本发明的有益效果：

[0031] 目前一般的CPP产品颜色不纯正，带浅黄色至棕黄色等杂色，粉末流动性差，灰分高(≥8％)，有效成分含量低(CPP含量≤30％)，苦味等异味重，水溶性差，溶液有杂质甚至呈浑浊状态，且由于没有考虑到残留的无定形乳糖对产品稳定性的影响，导致产品稳定性差，容易出现褐变、结块、复溶等变性现象，影响产品的添加使用。本发明通过可行、经济且适用于工业化生产的制备方法，可以得到脱除乳糖(≤0.5％，以还原糖计)、灰分低(≤0.8％)、有效成分含量高(CPP含量≥92％)、味道纯正、无苦味及其他异味的CPP，且由于脱除了乳糖(特别是无定形乳糖)，使产品的性状稳定，加工性能优异，不会出现褐变、复溶、发粘、结块、产生焦味等变性现象，有利于各种类型补钙产品的添加应用及提高产品在保质期内的稳定性。此外，本发明制备的酪蛋白磷酸肽适用于各类型产品的添加生产，能够提高最终产品的稳定性，具有重要的现实意义。

附图说明

[0032] 图1是本发明生产制备的酪蛋白磷酸肽成品。

具体实施方式

[0033] 以下结合具体实施例进一步说明本发明。

[0034] 实施例1

[0035] 一种酪蛋白磷酸肽的制备方法，包括以下步骤：

[0036] 将30kg干酪素和300kg纯净水混合，边搅拌边加入2mol/L的氢氧化钠溶液，调节pH至7.2；加入干酪素用量0.5％的胰蛋白酶进行酪蛋白的水解，期间保持搅拌并不断加入2mol/L氢氧化钠维持溶液pH7.2±0.1；45min后，加入干酪素用量0.2％的乳糖酶和干酪素用量0.2％的风味蛋白酶，继续进行水解，共进行4h；水解完成后，加入2mol/L的盐酸溶液调节pH至4.2，终止水解反应得到水解液；将水解液升温至90℃并保温30min，进行灭酶处理；
然后加入干酪素用量25％的400目硅藻土、2％的800目硅藻土及2％的活性白土，搅拌8min后过滤，收集澄清过滤液；在澄清过滤液中加入2mol/L氢氧化钠溶液调节pH至5.0，然后用截留分子量为800纳滤卷式膜处理；将截留分子量800以上的滤液在系统内循环，用电导仪进行监测，至滤液电导率为878μs/cm，收集滤液；在滤液中加入酒精至溶液酒精度为60％，在冷却温度10℃下充分搅拌混合后静置12h；离心处理后收集沉淀物CPP，用与沉淀物量等量的酒精洗2次，在温度60-70℃及压力-0.07～-0.098MPa条件下真空干燥12h后，粉碎过80目筛网处理，得酪蛋白磷酸肽粉末成品。

[0037] 酪蛋白磷酸肽粉末成品中乳糖含量为0.38％(以还原糖计)、灰分含量为0.62％、有效成分CPP含量为92.87％。

[0038] 实施例2

[0039] 一种酪蛋白磷酸肽的制备方法，包括以下步骤：

[0040] 将600kg纯净水和100kg干酪素混合，边搅拌边加入2.5mol/L的氢氧化钾溶液，调节pH至8.5；加入干酪素用量0.65％的碱性蛋白酶，进行酪蛋白的水解，期间保持搅拌并不断加入2.5mol/L氢氧化钾维持溶液pH8.5±0.1；30min后，加入干酪素用量0.05％的乳糖酶和干酪素用量0.08％的水解蛋白酶，在超声条件下继续进行水解，共进行2h；水解完成后，加入2.5mol/L的硫酸溶液调节pH至4.0，终止水解反应得到水解液；将水解液升温至80℃并保温45min，进行灭酶处理；然后加入干酪素用量20％的400目硅藻土、5％的800目硅藻土及5％的活性白土，搅拌10min后过滤，收集澄清过滤液；在澄清过滤液中加入2.5mol/L氢氧化钾溶液调节pH至5.0，然后用截留分子量为1000的纳滤卷式膜处理，；将截留分子量1000以上的滤液在系统内循环，用电导仪进行监测，至滤液电导率为628μs/cm，收集滤液；在滤液中加入酒精至溶液酒精度为55％，在冷却温度20℃下充分搅拌混合后静置12h；离心处理后收集沉淀物CPP，用与沉淀物量等量的酒精洗一次，在温度60-70℃及压力-0.07～-
0.098MPa条件下真空干燥10h后，粉碎过60目筛网处理，得到酪蛋白磷酸肽粉末成品。

[0041] 酪蛋白磷酸肽粉末成品中乳糖含量为0.16％(以还原糖计)、灰分含量为0.42％、有效成分CPP含量为94.25％。

[0042] 实施例3

[0043] 一种酪蛋白磷酸肽的制备方法，包括以下步骤：

[0044] 将800kg纯净水和150kg干酪素混合，边搅拌边加入3.0mol/L的氢氧化钠溶液，调节pH至7.5；加入干酪素用量0.6％的中性蛋白酶和干酪素用量0.6％的木瓜蛋白酶，进行酪蛋白的水解，期间保持搅拌并不断加入3.0mol/L氢氧化钾维持溶液pH7.5±0.1；60min后，加入干酪素用量2％的乳糖酶、干酪素用量0.3％的水解蛋白酶和干酪素用量0.3％的风味蛋白酶，在超声条件下继续进行水解，共进行3h；水解完成后，加入3mol/L的硫酸溶液调节pH至4.5，终止水解反应得到水解液；将水解液升温至85℃并保温30min，进行灭酶处理；然后加入干酪素用量30％的400目硅藻土、2％的800目硅藻土及3％的活性白土，搅拌6min后过滤，收集澄清过滤液；在澄清过滤液中加入3mol/L氢氧化钾溶液调节pH至6.8，然后用截留分子量为1000的纳滤卷式膜处理；将截留分子量1000以上的滤液在系统内循环，用电导仪进行监测，至滤液电导率为480μs/cm，收集滤液；在收集的滤液中加入酒精至溶液酒精度为50％，在冷却温度4℃下充分搅拌混合后静置24h；离心处理后收集沉淀物CPP，用与沉淀物量等量的酒精洗一次，在温度60-70℃及压力-0.07～-0.098MPa条件下真空干燥8h后，粉碎过60目筛网处理，得到酪蛋白磷酸肽粉末成品。

[0045] 酪蛋白磷酸肽粉末成品中乳糖含量为0.23％(以还原糖计)、灰分含量为0.38％、有效成分CPP含量为94.72％。

[0046] 实施例4

[0047] 一种酪蛋白磷酸肽的制备方法，包括以下步骤：

[0048] 将800kg纯净水和120kg干酪素混合，边搅拌边加入2.5mol/L的氢氧化钠溶液，调节pH至7.0；加入干酪素用量1％的胰蛋白酶和干酪素用量0.5％的Alcalase蛋白酶，进行酪蛋白的水解，期间保持搅拌并不断加入2.5mol/L氢氧化钠维持溶液pH7.0±0.1；30min后，加入干酪素用量0.1％的乳糖酶和干酪素用量0.2％的风味蛋白酶，在超声条件下继续进行水解，共进行3h；水解完成后，加入2.5mol/L的盐酸溶液调节pH至4.6，终止水解反应得到水解液；将水解液升温至82℃并保温30min，进行灭酶处理；然后加入干酪素用量28％的400目硅藻土、3％的800目硅藻土及2％的活性白土，搅拌8min后过滤，收集澄清过滤液；在澄清过滤液中加入2.5mol/L氢氧化钾溶液调节pH至6.0，然后用截留分子量为800的纳滤卷式膜处理；将截留分子量800以上的滤液在系统内循环，用电导仪进行监测，至滤液电导率为797μs/cm，收集滤液；在收集的滤液中加入酒精至溶液酒精度为62％，在冷却温度10℃下充分搅拌混合后静置20h；离心处理后收集沉淀物CPP，用与沉淀物量等量的酒精洗一次，在温度60-70℃及压力-0.07～-0.098MPa条件下真空干燥10h后，粉碎过80目筛网处理，得到酪蛋白磷酸肽粉末成品。

[0049] 酪蛋白磷酸肽粉末成品中乳糖含量为0.36％(以还原糖计)、灰分含量为0.40％、有效成分CPP含量为92.81％。

[0050] 实施例5

[0051] 一种酪蛋白磷酸肽的制备方法，包括以下步骤：

[0052] 将700kg纯净水和120kg干酪素混合，边搅拌边加入2.5mol/L的氢氧化钠溶液，调节pH至7.8；加入干酪素用量0.7％的胰蛋白酶和干酪素用量0.3％的菠萝蛋白酶，进行酪蛋白的水解，期间保持搅拌并不断加入2.5mol/L氢氧化钠维持溶液pH7.8±0.1；30min后，加入干酪素用量0.2％的乳糖酶和干酪素用量0.4％的风味蛋白酶，在超声条件下继续进行水解，共进行2h；水解完成后，加入2.5mol/L的盐酸溶液调节pH至4.8，终止水解反应得到水解液；将水解液升温至86℃并保温40min，进行灭酶处理；然后加入干酪素用量25％的400目硅藻土、3％的800目硅藻土及3％的活性白土，搅拌8min后过滤，收集澄清滤液；在滤液中加入2.5mol/L氢氧化钾溶液调节pH至5.5，然后用截留分子量为1000的纳滤卷式膜处理；将截留分子量1000以上的滤液在系统内循环，用电导仪进行监测，至滤液电导率为774μs/cm，收集滤液；在收集的滤液中加入酒精至溶液酒精度为60％，在冷却温度8℃下充分搅拌混合后静置20h；离心处理后收集沉淀物CPP，用与沉淀物量等量的酒精洗一次，在温度60-70℃及压力-0.07～-0.098MPa条件下真空干燥10h后，粉碎过80目筛网处理，得到酪蛋白磷酸肽粉末成品。

[0053] 酪蛋白磷酸肽粉末成品中乳糖含量为0.28％(以还原糖计)、灰分含量为0.65％、有效成分CPP含量为93.08％。

[0054] 对比例

[0055] 参照酪蛋白磷酸肽国家标准(GB 31617)，将本发明的方法生产的CPP与普通方法(酪蛋白溶液酶解后喷雾干燥)制备的CPP进行比较，结果列在表1中。

[0056] 表1对比结果

[0057]

[0058] 由上表可知，本发明制备的CPP成品的各个指标均符合国标的规定，且各个指标明显好于普通方法制备的CPP，表明本发明的方法能够生产性质更好的CPP产品，适用性更好。