2-萘巯基-5,8-二甲氧基-1,4-萘醌化合物及其制备方法和含其的药物

摘要

2‑萘巯基‑5,8‑二甲氧基‑1,4‑萘醌化合物及其制备方法和含其的药物；属于医药技术领域。本发明化合物结构式为：本发明方法：5,8‑二甲氧基‑1,4‑萘醌(DMNQ)溶解于甲醇中，加入2‑萘巯基，搅拌4h，加入浓硫酸和Na2Cr2O7·2H2O，搅拌2min，用饱和NaCl和CHCl3萃取，无水硫酸钠脱水，浓缩干燥，柱层析提纯。本发明的化合物和药物组合物在制备治疗胃癌的药物中的应用。

权利要求

1.2-萘巯基-5,8-二甲氧基-1,4-萘醌化合物的结构式为：

2.权利要求1化合物的制备方法，该方法是按下述步骤进行的：

5,8-二甲氧基-1,4-萘醌(DMNQ)溶解于甲醇中，加入2-萘巯基，搅拌4h，加入浓硫酸和Na2Cr2O7·2H2O，搅拌5min，用饱和NaCl和CHCl3萃取，无水硫酸钠脱水，浓缩干燥，柱层析提纯，获得2-萘巯基-5,8-二甲氧基-1,4-萘醌化合物。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述5,8-二甲氧基-1,4-萘醌与2-萘巯基的摩尔比为1:1.65。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述Na2Cr2O7·2H2O与5,8-二甲氧基-1,

4-萘醌的摩尔比为0.76：1。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述浓硫酸与5,8-二甲氧基-1,4-萘醌的摩尔比为0.23:1。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述浓硫酸的浓度为98％(质量)。

7.用于治疗胃癌的药物组合物，其中含有治疗有效量的权利要求1化合物和药学上可接受的载体。

8.权利要求1的所述化合物在制备治疗胃癌的药物中的应用。

说明书

2-萘巯基-5,8-二甲氧基-1,4-萘醌化合物及其制备方法和含

其的药物

技术领域

[0001] 本发明属于医药技术领域；具体涉及一种2-萘巯基-5,8-二甲氧基-1,4-萘醌化合物，其制备方法和以该化合物为活性成分的药物组合物。

背景技术

[0002] 传统的新药开发途径是以天然产物中有效成分作为先导化合物开发并研究新药的。紫草是药用历史悠久、药理作用广泛的传统中药，其主要药效成分紫草素是非常具有发展潜力的先导化合物。紫草素为代表的萘醌类化合物具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗疟疾、抗肿瘤等多种生理活性。特别是在抗癌研究中，已报道其具有抑制肿瘤细胞生长，诱导细胞凋亡，抑制DNA拓扑异构酶，抑制蛋白酪氨酸激酶，抗血管生成等多种作用机制。因此，萘醌类一直是很多研究者感兴趣的一类化合物。

[0003] 临床治疗胃癌的药物按作用机理的不同分为氟尿嘧啶类药物(替加氟、优福定、5- 氟尿嘧啶等)、细胞周期特异性药物(丝裂霉素、顺铂、阿霉素等)、分子靶向药物(曲妥珠单抗、贝伐珠单抗、西妥昔单抗等)。目前，临床上治疗癌症是以杀死癌细胞为目的，但化疗没有辨别能力，往往在杀死癌细胞的同时，杀死大量的正常细胞，多次化疗后患者出现头发脱落，身体消瘦，肠胃功能紊乱，恶心呕吐，低烧不退等症状，这些均为临床上胃癌治疗药物普遍的缺陷。

发明内容

[0004] 本发明提供了一种2-萘巯基-5,8-二甲氧基-1,4-萘醌化合物，其制备方法和以该化合物为活性成分的药物组合物。本发明降低了化合物本身的毒副作用，且刺激性和毒性均低。对癌细胞还具有一定的靶向性，对正常细胞的杀伤作用较低。

[0005] 为解决上述技术问题，本发明的2-萘巯基-5,8-二甲氧基-1,4-萘醌化合物的结构式为： 其制备方法是按下述步骤进行的：

[0006] 5,8-二甲氧基-1,4-萘醌(DMNQ)溶解于甲醇中，加入2-萘巯基，搅拌4h，加入浓硫酸和Na2Cr2O7·2H2O，搅拌2min，用饱和NaCl和CHCl3萃取，无水硫酸钠脱水，浓缩干燥，柱层析提纯，获得2-萘巯基-5,8-二甲氧基-1,4-萘醌。

[0007] 进一步地限定，所述5,8-二甲氧基-1,4-萘醌与2-萘巯基的摩尔比为1:1.65。

[0008] 进一步地限定，所述Na2Cr2O7·2H2O与5,8-二甲氧基-1,4-萘醌的摩尔比为0.76：1。

[0009] 进一步地限定，所述浓硫酸与5,8-二甲氧基-1,4-萘醌的摩尔比为0.23:1；所述浓硫酸的浓度为98％(质量)。

[0010] 本发明的药物组合物含有治疗有效量的权利要求1化合物和药学上可接受的载体。

[0011] 本发明的化合物和药物组合物在制备治疗胃癌的药物中的应用。

[0012] 上文所述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂如水等，填充剂如淀粉浆、羟丙甲纤维素、聚维酮、糖浆等，湿润剂如乙醇、水等，崩解剂如干淀粉，羟甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、泡腾崩解剂、交联聚维酮等，吸收促进剂如硫酸钙、磷酸氢钙、轻质氧化镁、碳酸钙等，吸附载体如壳聚糖等，润滑剂如硬脂酸镁、聚二乙醇、滑石粉、氢化植物油、微粉硅胶等，着色剂如二氧化钛、日落黄、亚甲蓝、药用氧化铁红等，包衣材料如丙烯酸树脂、羟甲纤维素、聚维酮、纤维醋法酯等。另外还可以在组合物中加入其它辅料如香味剂和甜味剂等。

[0013] 本发明的药用组合物可通过口服、直肠或肠胃外给药的方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、胶囊、粉剂、颗粒剂等，制成液体制剂如水或油悬浮剂或其它液体制剂如糖浆、口服液、酏剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、粉针、水或油性悬浮剂等。优选的形式是片剂、包衣片剂、胶囊、颗粒剂、口服液和注射剂。

[0014] 本发明的药用组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如使本化合物活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。

[0015] 本发明的药用组合物优选含有摩尔比为0.1％-99.5％的活性成分，最优选含有摩尔比为0.5％-95％的活性成分。

[0016] 本发明的药用组合物的施用量可根据用药途径、患者年龄、体重、体表面积、所治疗的疾病的类型和严重程度等变化，其日剂量可以是0.01-100mg/m2体表面积，优选10-100 mg/m2体表面积。可以一次或多次施用。

[0017] 本发明提供一种新的化合物2-萘巯基-5,8-二甲氧基-1,4-萘醌，该化合物的5，8位经甲基化由羟基改为甲氧基，降低了细胞毒性，且通过迈克尔加成反应，将2-萘巯基加成到5,8-二甲氧基-1,4-萘醌上，从而表现出更优越的抗癌活性。本发明通过上调胃癌AGS 细胞内活性氧(ROS)的水平，从而上调JNK和p38的磷酸化水平，下调ERK、Akt和 STAT3的磷酸化水平，使促凋亡蛋白Bax、cleaved-caspase-3和cleaved-PARP表达量逐渐升高，抗凋亡蛋白Bcl-xl表达量逐渐降低，进而诱导人胃癌AGS细胞发生凋亡。同时，本发明通过上调肝癌HepB细胞内活性氧(ROS)的水平，从而上调p38的磷酸化水平，下调Akt和STAT3的磷酸化水平，使促凋亡蛋白Bad和cleaved-PARP表达量逐渐升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表达量逐渐降低，进而诱导人肝癌Hep3细胞发生凋亡。

[0018] 本发明优点：

[0019] 本发明的化合物活性高，使用较低浓度的化合物时就能够很好地杀伤癌细胞。

[0020] 本发明的化合物对正常细胞毒性较低。

[0021] 本发明的化合物药效强。

[0022] 本发明的化合物几乎没有副产物，产品纯度98％。

[0023] 本发明的化合物制作方法较简单，易操作。

[0024] 本发明的化合物成本较廉。

附图说明

[0025] 图1是NTDMNQ对人AGS胃癌细胞的杀伤作用；

[0026] 图2是NTDMNQ对人MKN-28胃癌细胞的杀伤作用；

[0027] 图3是NTDMNQ对人MKN-45胃癌细胞的杀伤作用；

[0028] 图4是NTDMNQ对人NCI-N87胃癌细胞的杀伤作用；

[0029] 图5是NTDMNQ对人SNU-216胃癌细胞的杀伤作用；

[0030] 图6是NTDMNQ对人SNU-484胃癌细胞的杀伤作用；

[0031] 图7是NTDMNQ对人YCC-1胃癌细胞的杀伤作用；

[0032] 图8是NTDMNQ对人YCC-6胃癌细胞的杀伤作用；

[0033] 图9是NTDMNQ对人YCC-16胃癌细胞的杀伤作用；

[0034] 图10A是NTDMNQ处理AGS细胞后，利用荧光显微镜观察细胞凋亡情况图；

[0035] 图10B是图10A的定量分析图；

[0036] 图11A是用NTDMNQ处理AGS细胞后，利用流式细胞术检测细胞凋亡情况图；

[0037] 图11B是图11A的定量分析图；

[0038] 图12A是用NTDMNQ处理AGS细胞后，利用蛋白质免疫印迹法检测凋亡相关蛋白的表达情况图；

[0039] 图12B是图12A蛋白的定量分析图；

[0040] 图13A是用NTDMNQ处理AGS细胞后，利用蛋白质免疫印迹法检测上游相关蛋白的表达情况图；

[0041] 图13B是图13A蛋白的定量分析图；

[0042] 图14A是用NTDMNQ处理AGS细胞后，利用流式细胞术仪检测细胞内ROS水平的变化情况图；

[0043] 图14B是图14A的定量分析图；

[0044] 图15是NTDMNQ对人肝癌Hep3B细胞的杀伤作用；

[0045] 图16是NTDMNQ对人肝癌HepG2细胞的杀伤作用；

[0046] 图17是NTDMNQ对人肝癌Huh7细胞的杀伤作用；

[0047] 图18A是NTDMNQ处理HepG2细胞后，利用荧光显微镜观察细胞凋亡情况图；

[0048] 图18B是图18A的定量分析图；

[0049] 图19A是用NTDMNQ处理HepG2细胞后，利用流式细胞术检测细胞凋亡情况图；

[0050] 图19B是图19A的定量分析图；

[0051] 图20A是用NTDMNQ处理HepG2细胞后，利用蛋白质免疫印迹法检测凋亡相关蛋白的表达情况图；

[0052] 图20B是图20A蛋白的定量分析图；

[0053] 图21A是用NTDMNQ处理HepG2细胞后，利用蛋白质免疫印迹法检测上游相关蛋白的表达情况图；

[0054] 图21B是图21A蛋白的定量分析图；

[0055] 图22A是用NTDMNQ处理HepG2细胞后，利用流式细胞术仪检测细胞内ROS水平的变化情况图；

[0056] 图22B是图22A的定量分析图。

具体实施方式

[0057] 下面结合附图及具体的实施例对本发明做进一步的说明：

[0058] 实施例：本实施例中2-萘巯基-5,8-二甲氧基-1,4-萘醌化合物的制备：

[0059] 在250ml圆底烧瓶中加入5,8-二甲氧基-1,4-萘醌(1mmol)218.21mg，使用60ml 甲醇将其溶解，加入取代基2-萘巯基(1.65mmol)188.24μl，搅拌4h，加98％(质量) 的H2SO4(0.23mmol)24.90μl、Na2Cr2O7·2H2O(0.76mmol)27.45μl，搅拌2min，使用饱和NaCl和CHCl3萃取，无水硫酸钠脱水，浓缩干燥，柱层析将化合物提纯，(产品的性状：橙黄色晶体)。产品的结构式:

[0060] 产品纯度98％。

[0061] 采用下述试验验证发明效果：

[0062] 一、NTDMNQ对癌细胞的杀伤作用

[0063] 实验方法：(MTT实验)

[0064] ①接种细胞：用含10％胎小牛血清的培养液配成单个细胞悬液，以每孔10000个细胞接种到96孔板，每孔体积为200μl；

[0065] ②培养细胞：5％CO2，37℃孵育24h，至细胞单层铺满孔底；

[0066] ③血清饥饿：加药2h以前换培养液(含1％FBS的培养液)；

[0067] 药物处理：将制备出的NTDMNQ分别取终浓度为0.1、0.3、1、3及30μM处理人胃癌 AGS、MKN-28、MKN-45、NCI-N87、SNU-216、SNU-484、YCC-1、YCC-6和YCC-16 细胞24h；分别取终浓度为0.01、0.03、0.1、0.03、1、3及10μM处理人肝癌Hep3B、 HepG2和Huh7细胞24h。

[0068] ④呈色反应：每孔加MTT溶液(5mg/ml，用PBS配制，pH 7.4)20μl继续孵育 2-4h后，小心吸弃孔内培养上清液，小心用PBS洗涤2次，然后每孔加100μl二甲基亚砜(DMSO)，震荡10min，使结晶充分溶解；

[0069] ⑤比色：选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以浓度为横坐标，存活率为纵坐标绘制细胞生长柱状图，结果见图1-9、图15-17及表1 和2。

[0070] 结果分析：

[0071] 在图1-9中可以看出NTDMNQ(IC50：0.42μM)对人9种胃癌细胞都具有良好的杀伤能力；图15-17中可以看出NTDMNQ(IC50：0.874μM)同时对肝癌Hep3B、HepG2 和Huh7都具有良好的杀伤能力，其杀伤强度随药物浓度的增加而逐渐升高。

[0072] 由下表1和2也可以看出，NTDMNQ(IC50：0.42μM)对人9种胃癌细胞都具有良好的杀伤能力；同时NTDMNQ(IC50：0.874μM)对肝癌Hep3B、HepG2和Huh7都具有良好的杀伤能力，其杀伤强度随药物浓度的增加而逐渐升高。

[0073] 表1 NTDMNQ对人胃癌细胞杀伤作用的IC50值

[0074]

[0075] 表2 NTDMNQ对人肝癌细胞杀伤作用的IC50值

[0076]

[0077] NTDMNQ对癌细胞的凋亡作用

[0078] 实验方法：(体外实验-Annexin-V染色法)

[0079] ①接种细胞：用含10％胎小牛血清的培养液配成单个细胞悬液，以每孔10,000个细胞接种到12孔板，每孔体积为1ml；

[0080] ②培养细胞：5％CO2，37℃孵育24h，至细胞单层铺满孔底；

[0081] ③药物处理：胃癌AGS细胞中加入制备出的NTDMNQ(IC50：0.42μM)，处理不同时间(3、6、12及24h)；肝癌HepG2细胞中加入制备出的NTDMNQ(IC50：0.874μM)，处理不同时间(3、6、12及24h)；

[0082] ④用PBS洗涤2次，加入195μl Annexin V-FITC结合液，再加入5μL Annexin V-FITC 轻轻混匀；

[0083] ⑤加入10μ1碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)染色液，轻轻混匀；

[0084] ⑥室温(20-25℃)避光孵育15分钟；

[0085] ⑦(A)在荧光显微镜下观察细胞的形态及颜色的改变，绿色荧光为Annexin V-FITC 染色阳性细胞，红色荧光为碘化丙啶阳性细胞。仅被绿色荧光染色，且体积较小的细胞为凋亡细胞；被红色或绿色和红色双染，且体积较大的细胞为坏死细胞；未被染色的细胞为正常细胞。随机观察200个细胞，求得各种细胞所占的百分比，每个样本计数3次取平均；

[0086] (B)同时，也利用流式细胞术方法检测NTDMNQ对人胃癌AGS细胞和肝癌HepG2 细胞的凋亡。

[0087] 1、用NTDMNQ处理人胃癌AGS细胞，检测NTDMNQ对人胃癌AGS细胞的凋亡。

[0088] 采用上述实验方法，得到的实验结果见图10A、图10B、图11A及图11B，其中图 10A是用NTDMNQ处理AGS细胞后，利用荧光显微镜观察细胞凋亡情况图，5-FU为阳性对照组；图10B是图10A的定量分析图。图11A是用NTDMNQ处理AGS细胞后，利用流式细胞术检测细胞凋亡情况图；图11B是图11A的定量分析图。

[0089] 结果分析

[0090] 用NTDMNQ(终浓度为0.42μM)处理人胃癌AGS细胞3、6、12及24h后，进行 Annexin V-FITC/PI双染实验，井在荧光显微镜观察。从图10B中可以看出，随着药物处理时间的不断增加，Annexin V-FITC荧光强度也逐渐增强，其细胞凋亡程度也显著增加。尤其当时间为24h时，细胞的荧光强度最高。结果说明，NTDMNQ可以有效诱导AGS 细胞的凋亡，并呈现时间依赖性。

[0091] 用NTDMNQ(终浓度为0.42μM)处理人胃癌AGS细胞3、6、12及24h后，进行 Annexin V-FITC和PI进行标记，通过流式细胞术检测细胞凋亡情况。从图11B中可以看出，随着药物处理时间的不断增加，胃癌AGS细胞凋亡的程度也随之增加，尤其当药物处理时间达到24h时，细胞的凋亡水平明显增加。这一结果说明，NTDMNQ可以有效诱导AG细胞的凋亡，并呈现时间依赖性。

[0092] 2、用NTDMNQ处理人肝癌HepG2细胞，检测NTDMNQ对人肝癌HepG2细胞的凋亡[0093] 采用上述实验方法，得到的实验结果见图18A、图18B、图19A及图19B，其中18A 是用NTDMNQ处理HepG2细胞后，利用荧光显微镜观察细胞凋亡情况图；图18B是图18A的定量分析图。图19A是用NTDMNQ处理HepG2细胞后，利用流式细胞术检测细胞凋亡情况图；图19B是图19A的定量分析图。

[0094] 结果分析

[0095] 用NTDMNQ(终浓度为0.874μM)处理人肝癌HepG2细胞3、6、12及24h后，进行Annexin V-FITC/PI双染实验，并在荧光显微镜观察。从图18B中可以看出，随着药物处理时间的不断增加，Annexin V-FITC荧光强度也逐渐增强，其细胞凋亡程度也显著增加。尤其当时间为24h时，细胞的荧光强度最高。结果说明，NTDMNQ可以有效诱导HepG2细胞的凋亡，并呈时间依赖性。

[0096] 用NTDMNQ(终浓度为0.874μM)处理人肝癌HepG2细胞3、6、12及24h后，进行Annexin V-FITC和PI进行标记，通过流式细胞术检测细胞凋亡情况。从19B中可以看出，随着药物处理时间的不断增加，肝癌HepG2细胞凋亡的程度也随之增加，尤其当药物处理时间达到24h时，细胞的凋亡水平明显增加。这一结果说明，NTDMNQ可以有效诱导HepG2细胞的凋亡，并呈现时间依赖性。

[0097] 三、NTDMNQ对癌细胞的凋亡相关蛋白以及上游信号通路的作用

[0098] 实验方法：(蛋白质免疫印迹法)

[0099] ①接种细胞：用含10％胎小牛血清的培养液配成单个细胞悬液，以每孔10,000个细胞接种到6孔板，每孔体积为2ml；

[0100] ②培养细胞：5％CO2，37℃孵育24h，至细胞单层铺满孔底；

[0101] ③药物处理：胃癌AGS细胞中加入制备出的NTDMNQ(IC50：0.42μM)，处理不同时间(3、6、12及24h)；肝癌HepG2细胞中加入制备出的NTDMNQ(IC50：0.874μM)，处理不同时间(3、6、12及24h)；

[0102] ④用紫外分光光度计测定OD值，对蛋白质进行定量；

[0103] ⑤8-12％SDS-PAGE电泳，将蛋白质转移至NC膜上，脱脂乳封闭1h，TBST溶液洗涤5遍；

[0104] ⑥分别与ERK、JNK、p38、AKT、Bcl-xl、Bad、PARP、Caspase-3、Bcl-2、Bax及α-tubulin结合，4℃摇床过夜孵育；

[0105] ⑦TBST洗5次，以HRP标记山羊抗兔IgG、HRP标记山羊抗鼠IgG为二抗，室温孵育2h；

[0106] ⑧加入电化学发光试剂显色，利用AI600多功能成像仪成像；

[0107] 1、用NTDMNQ处理人胃癌AGS细胞，检测NTDMNQ对人胃癌AGS细胞凋亡相关蛋白的影响

[0108] 采用上述实验方法，得到的实验结果见图12A、图12B、图13A及图13B，其中图 12A是用NTDMNQ处理AGS细胞后，通过蛋白质免疫印迹法检测凋亡相关蛋白的变化情况；图12B是图12A的定量分析图。图13A是用NTDMNQ处理AGS细胞后，通过蛋白质免疫印迹法检测上游相关蛋白的变化情况；图13B是图13A的定量分析图。

[0109] 结果分析

[0110] 用NTDMNQ(终浓度为0.42μM)处理人胃癌AGS细胞3、6、12及24h后，进行蛋白质免疫印迹法实验，AI600多功能成像仪成像。从图12B中可以看出，随着药物处理时间的不断增加，促凋亡的Bax、cleaved-caspase-3及cleaved-PARP表达量增加，抗凋亡的Bcl-xl表达量降低。结果说明，NTDMNQ可以有效诱导AGS细胞发生凋亡。

[0111] 用NTDMNQ(终浓度为0.42μM)处理人胃癌AGS细胞3、6、12及24h后，进行蛋白质免疫印迹法实验，AI600多功能成像仪成像。从图13B中可以看出，随着药物处理时间的不断增加，p-JNK和p-p38表达量增加，p-ERK，p-STAT3及p-AKT表达量降低。结果说明，NTDMNQ通过调控MAPKs，AKT及STAT3信号通路来诱导AGS细胞发生凋亡。

[0112] 2、用NTDMNQ处理人肝癌HepG2细胞，检测NTDMNQ对人肝癌HepG2细胞凋亡相关蛋白的影响

[0113] 采用上述实验方法，得到的实验结果见图20A、图20B、图21A及图21B，其中20A 是用NTDMNQ处理HepG2细胞后，通过蛋白质免疫印迹法检测凋亡相关蛋白的变化情况；图20B是图20A的定量分析图。图21A是用NTDMNQ处理HepG2细胞后，通过蛋白质免疫印迹法检测上游相关蛋白的变化情况；图21B是图22A的定量分析图。

[0114] 结果分析

[0115] 用NTDMNQ(终浓度为0.874μM)处理人肝癌HepG2细胞3、6、12及24h后，进行蛋白质免疫印迹法实验，AI600多功能成像仪成像。从图20B中可以看出，随着药物处理时间的不断增加，促凋亡的Bad和cleaved-PARP表达量增加，抗凋亡的Bcl-2表达量降低。结果说明，NTDMNQ可以有效诱导HepG2细胞发生凋亡。

[0116] 用NTDMNQ(终浓度为0.874μM)处理人肝癌HepG2细胞3、6、12及24h后，进行蛋白质免疫印迹法实验，AI600多功能成像仪成像。从图21B中可以看出，随着药物处理时间的不断增加，p-p38表达量增加，p-STAT3及p-AKT表达量降低。结果说明， NTDMNQ通过调控p38，AKT及STAT3信号通路来诱导HepG2细胞发生凋亡。

[0117] 四、NTDMNQ对癌细胞内ROS水平的影响

[0118] 实验方法：(DCFH-DA染色)

[0119] ①接种细胞：用含10％胎小牛血清的培养液配成单个细胞悬液，以每孔10,000个细胞接种到6孔板，每孔体积为2ml；

[0120] ②培养细胞：5％CO2，37℃孵育24h，至细胞单层铺满孔底；

[0121] ③药物处理：胃癌AGS细胞中加入制备出的NTDMNQ(IC50：0.42μM)，处理不同时间(3、6、12及24h)；肝癌HepG2细胞中加入制备出的NTDMNQ(IC50：0.874μM)，处理不同时间(3、6、12及24h)；

[0122] ④用PBS重悬，加入100μl PBS，再加入1μLDCFH-DA，37℃避光孵育15min；

[0123] ⑤5000rpm离心，500μL PBS重悬，吹混；

[0124] ⑥流式细胞仪检测NTDMNQ对胃癌AGS细胞和肝癌HepG2细胞内ROS水平的影响；

[0125] 1、用NTDMNQ处理人胃癌AGS细胞，检测NTDMNQ胃癌AGS细胞内ROS水平的影响[0126] 采用上述实验方法，得到的实验结果见图14A和图14B，其中图14A是用NTDMNQ 处理AGS细胞后，通过流式细胞术检测细胞内ROS水平变化情况；图14B是图14A的定量分析图。

[0127] 结果分析

[0128] 用NTDMNQ(终浓度为0.42μM)处理人胃癌AGS细胞3、6、12及24h后，进行 DCFH-DA染色实验，用流式细胞术检测。从图14B中可以看出，随着药物处理时间的不断增加，AGS细胞内ROS水平不断升高。结果说明，NTDMNQ可以通过调控ROS的水平来诱导AGS细胞发生凋亡。

[0129] 2、用NTDMNQ处理人肝癌HepG2细胞，检测NTDMNQ肝癌HepG2细胞内ROS 水平的影响[0130] 采用上述实验方法，得到的实验结果见图22A和图22B，其中22A是用NTDMNQ 处理HepG2细胞后，通过流式细胞术检测细胞内ROS水平变化情况；图22B是图22A 的定量分析图。

[0131] 结果分析

[0132] 用NTDMNQ(终浓度为0.874μM)处理人肝癌HepG2细胞3、6、12及24h后，进行DCFH-DA染色实验，用流式细胞仪检测。从图22B中可以看出，随着药物处理时间的不断增加，细胞内ROS水平不断升高。结果说明，NTDMNQ可以通过调控ROS的水平来诱导HepG2细胞发生凋亡。

[0133] 综上所述，NTDMNQ(终浓度为0.42μM)可以通过升高ROS的水平来调控MAPKs， AKT和STAT3信号通路来诱导胃癌AGS细胞发生凋亡；NTDMNQ(终浓度为0.874)可以通过提高ROS的水平来调控AKT和STAT3信号通路来诱导人肝癌HepG2细胞发生凋亡。