一类N-苄基取代的4-氨基水杨酸衍生物与Tubastatin A的孪药及其应用

摘要

一类N‑苄基取代的4‑氨基水杨酸衍生物与Tubastatin A的孪药及其应用，结构符合通式(I)其中:R1,R2为‑Cl、‑Br或‑C(CH3)3，R3为1‑6个碳原子的烷基。该类药物对脑梗塞具有良好的药效，可用于制备治疗脑卒中的药物。

权利要求

1.一类N-苄基取代的4-氨基水杨酸衍生物与Tubastatin A的孪药，其特征在于结构如

001所示：

2.权利要求1所述孪药或其药学上可接受的盐在制备治疗脑卒中药物中的应用。

3.一种制备治疗脑卒中的药物，其特征在于有效成分为权利要求1所述的孪药。

说明书

一类N-苄基取代的4-氨基水杨酸衍生物与Tubastatin A的孪

药及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于制药领域，提供一类N-苄基取代的氨基水杨酸衍生物与Tubastatin A的孪药及其药物用途。

背景技术

[0002] 脑卒中具有高死亡率、高复发率、高致残率的特点，严重危害人类健康，目前缺乏满意的治疗药物。神经保护剂能够缓解缺血进展，减轻缺血再灌注损伤，促进受损神经功能的恢复，受到广泛重视。

[0003] 脑缺血后组蛋白乙酰化水平降低，是脑损伤的重要病因。组蛋白去乙酰化酶(HDACs) 抑制剂能够上调组蛋白乙酰化水平，产生细胞保护作用。HDACs有多种亚型，选择性HDACs 抑制剂相对更安全。研究显示：Tubastatin A可以降低缺血损伤(J Am Chem Soc.2010， 132:10842-10846)，但其分子内存在极性很大的羟肟酸结构，不容易进入中枢。因此，Tubastatin A在大鼠中动脉阻塞模型中没有显示出显著的抗卒中效果(见附图2)。

[0004]

[0005] 脑缺血后NMDAR激活，通过NMDAR-突触后密度蛋白95(PSD95)-神经元型一氧化氮合酶(nNOS)通路过度释放一氧化氮(NO)，产生神经毒性。由于NMDAR和nNOS均具有非常重要的生理功能，对它们的直接干预往往导致严重的副作用。nNOS-PSD95解偶联剂4-N- (2-羟基-3,5-二氯苄基)氨基水杨酸(ZL006)，对脑缺血损伤安全有效(Nature Medicine,2010, 16:1439-1443)。ZL006主要通过其羧基葡萄糖醛酸化代谢，其羧基酯化的前药可以延缓代谢，增加中枢分布(Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters,2016,26:2152-2155)。但是，无论是 ZL006还是其羧基酯化的前药，在大鼠中动脉阻塞模型中只是显示出有限的抗卒中效果。

[0006] 脑卒中的发生发展存在多个病理环节，不同的机制交织在一起导致了最终破坏性的结果，同时干预脑卒中不同机制的药物将更有效。我们设计合成了以氨基甲酸酯键为连接基的ZL006 和Tubastatin A的孪药，该孪药能够明显增加ZL006和Tubastatin A在脑组织中的分布，显示了良好的抗脑卒中作用,并且具有较大的治疗窗。

发明内容

[0007] 解决的技术问题：一类N-苄基取代的氨基水杨酸衍生物与Tubastatin A的孪药及其应用，可用于制备治疗脑卒中的药物。

[0008] 技术方案：一类N-苄基取代的4-氨基水杨酸衍生物与Tubastatin A的孪药，结构如通式 (I)所示：

[0009]

[0010] 其中:R1,R2为-Cl,-Br或-C(CH3)3，R3为1-6个碳原子的烷基。

[0011] 一类N-苄基取代的4-氨基水杨酸衍生物与Tubastatin A的孪药，其特征在于化合物结构为以下001～003中的任意一种：

[0012]

[0013]

[0014] 上述孪药或其药学上可接受的盐在制备治疗脑卒中药物中的应用。

[0015] 一种制备治疗脑卒中的药物，有效成分为上述的孪药。

[0016] 有益效果：该类药物为nNOS-PSD-95解偶联剂ZL006和Tubastatin A的多靶点孪药，能够明显增加ZL006和Tubastatin A在脑组织中的分布，具有比nNOS-PSD-95解耦联剂、 Tubastatin A单靶点药物更好的治疗脑卒中的作用，可用于制备治疗脑卒中的药物。

附图说明

[0017] 图1为目标化合物的脑中药物以及代谢产物浓度测定图；给药后15分钟(0.1mmol/kg)，大鼠大脑中的药物浓度和ZL006，Tubastatin A的浓度，孪药明显改善了ZL006，Tubastatin A 在大鼠大脑中的分布。

[0018] 图2为目标化合物001对大鼠脑梗死面积的影响图，大鼠大脑中动脉阻断实验(MCAO模型)中，目标化合物001(30mg/kg)给药后的梗死体积比较。

具体实施方式

[0019] 下面的实施例可使本专业技术人员可全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

[0020] 实施例1 目标化合物的合成:

[0021] 实施例中涉及的化合物001-003合成路线：

[0022]

[0023] 化合物001的合成：

[0024]

[0025] 将三光气(150mg，0.5mmol)在无水无氧条件下以10mL二氯甲烷溶解，冷却至零下78℃，搅拌下加入10mL吡啶与二氯甲烷的混合溶剂(吡啶:二氯甲烷体积比＝1:9)，溶液由无色透明逐渐呈现淡黄色并逐渐有淡黄色沉淀生成。继续搅拌15分钟后，将2-羟基-4-(2-羟基-3,5-氯苯甲基)氨基苯甲酸甲酯(ZL006甲酯，合成方法：Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters, 2016,26:2152-2155，342mg，1mmol)以10mL二氯甲烷溶解后于30分钟内加入反应瓶中。待加入完毕后继续于零下78℃下搅拌30分钟，然后升至室温反应8小时。8小时后，将 Tubastatin A(671mg，2mmol)以10mL二氯甲烷稀释后加入体系，加入三乙胺(400mg， 6mmol)。室温下继续反应24小时后旋干制砂，柱层析得到产物001。

[0026] 1H NMR(300MHz,CDCl3)7.96(d,1H),7.65(d,2H),7.45(s,1H),7.39-7.34(m,2H),7.11 (s,1H),7.06-6.96(m,6H),5.38(s,2H),4.86(s,2H),3.80(s,3H),3.55(s,2H),2.72(s,4H),2.42(s, 3H)。

[0027] 化合物002的合成：

[0028]

[0029] 参考化合物001方法，以2-羟基-4-(2-羟基-3,5-二叔丁基苯甲基)氨基苯甲酸乙酯(参考 Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters,2016,26:2152-2155，ZL006甲酯合成方法合成)、Tubastatin A为原料合成。1H NMR(300MHz,CDCl3)7.99(d,1H),7.66(d,2H),7.48(s,1H), 7.42-7.36(m,2H),7.18(s,1H),7.12-6.71(m,6H),5.41(s,2H),4.89(s,2H),
4.42-4.39(m,2H), 3.58(s,2H),2.75(s,4H),1.45(s,9H),1.42(t,3H),1.29(s,9H)。

[0030] 化合物003的合成：

[0031]

[0032] 参考化合物001方法，以2-羟基-4-(2-羟基-3-氯-5-溴-苯甲基)氨基苯甲酸乙酯(参考 Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters,2016,26:2152-2155，ZL006甲酯合成方法合成)、 Tubastatin A为原料合成。1H NMR(300MHz,CDCl3)7.94(d,1H),7.62(d,2H),7.41(s,1H), 7.36-7.32(m,2H),7.08(s,1H),7.03-6.93(m,6H),5.35(s,2H),4.83(s,2H),
4.25-4.16(m, 1H),3.53(s,2H),2.70(s,4H),1.68-1.61(m,2H),1.36-1.27(m,6H),0.86-
0.83(m,2H)。

[0033] 实施例2 目标化合物的脑中药物以及代谢产物浓度测定

[0034] 给药溶液配制：称取目标化合物001、002、003、ZL006、Tubastatin A各20mg，溶于极少量DMSO中(少于总体积1％)，加入吐温80(少于总体积5％)，于热水浴中后加入生理盐水定容至20mL，配制成浓度为1mg·mL-1溶液。

[0035] 试验方法

[0036] 取ICR小鼠30只，体重20g左右，随机分成5组，每组6只，尾静脉给药，剂量为20mg·kg-1。小鼠禁食不禁水12h，实验期间自由饮水。给药后分别于15min处死小鼠。用生理盐水漂洗干净脑组织表面的血渍，滤纸吸干表面水分，称重。加入重量比1:3的生理盐水(即1g脑组织加入3mL生理盐水)，电动匀浆器将组织制备成匀浆液。超声10min，排除气泡。

[0037] 于1.5mL的离心管中精密吸取100μL脑组织匀浆液，随后加入精密吸取的10μL内标溶液(氟西汀，5μg·mL-1)以及300μL甲醇作为沉淀剂，于涡旋振荡器上混匀涡1min，于离心机中12000r·min-1，离心10min，精密吸取上清液150μL加入50μL超纯水，取10μL溶液进样，记录其色谱图像，试验结果见图1。

[0038] 实施例3 目标化合物抗脑卒中作用

[0039] 采用大鼠MCAO模型，以ZL006、Tubastatin A为对照，考察了化合物001的抗脑卒中药效。

[0040] 给药方案：所有组于再灌注后立即iv给药1次，共给药1次。脑缺血后24小时处死动物，取脑，染色，计算脑梗死面积。

[0041] 大鼠MCAO模型：大鼠用7％水合三氯乙醛(6mL/kg)麻醉后，俯卧位固定于手术台上，消毒皮肤，颈部正中切开，分离右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，轻轻剥离迷走神经，结扎并剪断颈外动脉，循颈内动脉向前，结扎翼腭动脉。夹闭颈总动脉近心端，从颈外动脉的结扎线的远端作一切口，插入外径为0.285mm的尼龙线，进过颈总动脉分叉进入颈内动脉，然后徐徐插入至有轻微阻力为止(自分叉处约20mm)，阻断大脑中动脉的所有血供，右侧脑缺血2.0h后，轻轻拔出尼龙线，恢复血供进行再灌注，缝合皮肤，消毒。

[0042] 脑梗死程度的测定

[0043] 动物处死后，断头取脑，去除嗅球、小脑和低位脑干，用生理盐水冲洗大脑表面血迹，吸去表面残留水迹，于-20℃放置20min，取出后立即于视线交叉平面垂直向下作冠状切面，并向后每隔2mm切一片，将脑片置于1％TTC染液中孵育(37℃90min)，正常脑组织染成深红色，缺血脑组织则呈苍白色，用生理盐水冲洗后，迅速将脑片从前向后按顺序排成一排，吸干表面残留水迹，拍照。

[0044] 照片用Image J软件处理，根据公式计算左脑相应的面积以及梗死灶面积，求出梗死灶百分比。

[0045] 梗死体积计算法：

[0046] V＝t(A1+A2+A3+………+An)

[0047] t为切片厚度，A为梗死面积。

[0048] ％I＝100％×(VC-VL)/VC

[0049] ％I为梗死体积百分比，VC为对照侧(左脑半球)脑体积，VL为梗死侧(右脑半球)非梗死区域体积。

[0050] 各组对脑梗塞面积的影响见图2。