包含柯萨奇病毒A10驯化株的病毒组合物及其应用

摘要

本发明专利申请公开了一株高滴度、传代稳定的柯萨奇病毒株A10驯化株TA151R‑1，该病毒株能够感染RD细胞、HEK293细胞、Vero细胞、MRC‑5细胞、Hep‑2细胞以及WI‑38细胞等多种细胞系，还可以用于制备单价或多价疫苗，制备得到的疫苗能够保护机体免受柯萨奇病毒的伤害，并且也能够完全保护其他异源病毒的攻毒，可有效的预防和/或治疗由柯萨奇病毒感染所致的疾病，具有广阔的应用前景。

权利要求

1.一种病毒组合物，其特征在于，所述病毒组合物包含柯萨奇A10病毒株和柯萨奇A6病毒株，所述A10病毒株的保藏编号为CGMCC No.13394，所述A6病毒株的保藏编号为CGMCC No.13393。

2.根据权利要求1所述的病毒组合物，其特征在于，所述A10和A6病毒株采用任意比例混合。

3.根据权利要求2所述的病毒组合物，其特征在于，A10和A6的比例为1:10-10:1。

4.根据权利要求3所述的病毒组合物，其特征在于，A10和A6等比例混合。

5.根据权利要求1或2所述的病毒组合物，其特征在于，所述病毒组合物还包括其他类型的柯萨奇病毒株。

6.根据权利要求5所述的病毒组合物，其特征在于，所述其他类型的柯萨奇病毒株选自EV71、A16、A2、A3、A4、A5、A7、A8、A12、A14病毒株或其任意组合。

7.根据权利要求6所述的病毒组合物，其特征在于，所述其他类型的柯萨奇病毒株选自EV71、A16病毒株或其任意组合。

8.根据权利要求1或2所述的病毒组合物，其特征在于，所述病毒株为灭活的病毒株。

9.根据权利要求8所述的病毒组合物，其特征在于，所述灭活采用加热或化学试剂处理灭活。

10.根据权利要求9所述的病毒组合物，其特征在于，所述化学试剂选自甲醛或β-丙内酯

11.根据权利要求10所述的病毒组合物，其特征在于，所述化学试剂为甲醛。

12.根据权利要求11所述的病毒组合物，其特征在于，甲醛的终浓度为1:10000-1:100(v/v)。

13.根据权利要求12所述的病毒组合物，其特征在于，甲醛的终浓度为1:5000-1:1000(v/v)。

14.根据权利要求13所述的病毒组合物，其特征在于，甲醛的终浓度为1:4000(v/v)。

15.一种用于预防和/或治疗柯萨奇病毒所致疾病的产品，其特征在于，由权利要求1-

14任一项所述的病毒组合物制备得到，所述产品选自纯化的病毒颗粒、灭活病毒、抗体、抗血清、疫苗、免疫原或其他免疫组合物。

16.根据权利要求15所述的产品，其特征在于，所述疫苗为灭活疫苗、亚单位疫苗、活载体疫苗、核酸疫苗、嵌合疫苗。

17.根据权利要求16所述的产品，其特征在于，所述疫苗为灭活疫苗。

18.根据权利要求15所述的产品，其特征在于，所述疾病为手足口病。

19.根据权利要求15所述的产品，其特征在于，所述产品还包括佐剂。

20.根据权利要求19所述的产品，其特征在于，所述佐剂选自弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂或铝盐。

21.根据权利要求20所述的产品，其特征在于，所述铝盐为氢氧化铝、磷酸铝。

22.根据权利要求20所述的产品，其特征在于，所述佐剂为弗氏完全佐剂。

23.根据权利要求20所述的产品，其特征在于，所述佐剂与病毒颗粒用量比例为1:5-5:

1。

24.根据权利要求23所述的产品，其特征在于，所述佐剂与病毒颗粒用量比例为1:2-2:

1。

25.根据权利要求24所述的产品，其特征在于，所述佐剂与病毒颗粒用量比例为1:1。

26.权利要求1-14任一项病毒组合物在制备预防和/或治疗柯萨奇病毒所致疾病的产品中的应用；所述产品选自纯化的病毒颗粒、灭活病毒、抗体、抗血清、疫苗、免疫原或其他免疫组合物。

27.根据权利要求26所述的应用，其特征在于，所述疫苗为灭活疫苗、亚单位疫苗、活载体疫苗、核酸疫苗、嵌合疫苗。

28.根据权利要求27所述的应用，其特征在于，所述疫苗为灭活疫苗。

29.根据权利要求26所述的应用，其特征在于，所述疾病为手足口病。

30.根据权利要求26所述的应用，其特征在于，所述产品还包括佐剂。

31.根据权利要求30所述的应用，其特征在于，所述佐剂选自弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂或铝盐。

32.根据权利要求31所述的应用，其特征在于，所述铝盐为氢氧化铝、磷酸铝。

33.根据权利要求31所述的应用，其特征在于，佐剂为弗氏完全佐剂。

34.根据权利要求31所述的应用，其特征在于，所述佐剂与病毒颗粒用量比例为1:5-5:

1。

35.根据权利要求34所述的应用，其特征在于，所述佐剂与病毒颗粒用量比例为1:2-2:

1。

36.根据权利要求35所述的应用，其特征在于，所述佐剂与病毒颗粒用量比例为1:1。

37.根据权利要求26所述的应用，其特征在于，包含将病毒组合物进行培养的步骤。

38.一种制备预防和/或治疗柯萨奇病毒所致疾病的产品的方法，其特征在于，所述方法包括利用权利要求1或2所述的病毒组合物作为活性成分制备所述产品的步骤；所述产品选自纯化的病毒颗粒、灭活病毒、抗体、抗血清、疫苗、免疫原或其他免疫组合物。

39.根据权利要求38所述的方法，其特征在于，所述疫苗为灭活疫苗、亚单位疫苗、活载体疫苗、核酸疫苗、嵌合疫苗。

40.根据权利要求39所述的方法，其特征在于，所述疫苗为灭活疫苗。

41.根据权利要求38所述的方法，其特征在于，所述疾病为手足口病。

42.根据权利要求38所述的方法，其特征在于，所述产品还包括佐剂。

43.根据权利要求42所述的方法，其特征在于，所述佐剂选自弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂或铝盐。

44.根据权利要求43所述的方法，其特征在于，所述铝盐为氢氧化铝、磷酸铝。

45.根据权利要求42所述的方法，其特征在于，佐剂为弗氏完全佐剂。

46.根据权利要求43所述的方法，其特征在于，所述佐剂与病毒颗粒用量比例为1:5-5:

1。

47.根据权利要求46所述的方法，其特征在于，所述佐剂与病毒颗粒用量比例为1:2-2:

1。

48.根据权利要求47所述的方法，其特征在于，所述佐剂与病毒颗粒用量比例为1:1。

说明书

包含柯萨奇病毒A10驯化株的病毒组合物及其应用

技术领域：

[0001] 本申请涉及生物技术领域，尤其涉及包含柯萨奇病毒A10驯化株的病毒组合物及其应用。背景技术：

[0002] 手足口病(Hand,foot,and mouth disease，HFMD)是一种由小RNA病毒引起的肠道传染性疾病，发病者主要是5岁以下婴幼儿，主要引起粘膜疱疹、咽峡炎等轻微临床症状，也能够引起重症，导致严重的无菌性脑膜炎和急性弛缓性麻痹等神经系统疾病。自2009年流行以来，柯萨奇病毒A组6型(A6)和10型(A10)在西太平洋地区和欧洲某些国家其发病率逐年升高，包括新加坡、泰国、日本、西班牙、法国和中国大陆及台湾地区，使其成为引发HFMD的主要病原体。作为非-EV71和非-A16，A6和A10被认为是其它型肠道病毒中引起HFMD的主要病原体，并在引发HFMD的病原体中所占比例越来越大。例如，一份最近的流行病学调查报告显示2011～2015年间重庆21615名HFMD患儿中由A6和A10所引起的比例分别为62.33％和4.79％。

[0003] 目前为止，临床治疗A10重症患儿主要采取支持疗法的对症治疗，并未进行抗病毒治疗，更为关键的是还没有一种合适的A10疫苗预防接种儿童，另外，目前尚不明确A10的感染病理机制，获得一株稳定高效的A10病毒株是开发疫苗以及建立动物感染模型的关键。本发明人在之前的工作中筛选到了A6病毒株WF057R，并利用其进行了感染动物模型的建立以及抗A6药物的制备(CN106947745A、CN106867974A、CN106994182A)。

[0004] 现在对柯萨奇病毒的研究较多，但是，关于A10病毒株的报道较少。庄再成等人在CN106661102A中公开了A10病毒株M2014，但是，该病毒株仅能感染HEK293细胞，而不能感染其他用于疫苗生产的细胞株，如，Vero细胞、MRC-5细胞、MDCK细胞以及CHO细胞，病毒力价最高只能到2.5×108TCID50/mL，在很大程度上限制了该病毒株的应用。我们在前期的工作中筛选得到了A10病毒株TA151R，建立了A10的乳鼠感染模型，并制备了全病毒灭活疫苗(“Protective Efficacies of Formaldehyde-Inactivated Whole-Virus Vaccine and Antivirals in a Murine Model of Coxsackievirus A10Infection”，Zhenjie Zhang等，《Journal of Virology》，2017年第91卷，e00333-17)；但是，在后续研究过程中，我们发现TA151R病毒株在传代过程中会出现滴度降低、传代不稳定的问题，影响了该病毒株在实际应用时的效率。

[0005] 为了提高A10病毒株TA151R的滴度以及传代稳定性，我们对该毒株进行了驯化，筛选得到一株高滴度、传代稳定，并且能够感染多种细胞系的驯化株TA151R-1。此外，我们利用TA151R-1与A6型病毒株WF057R分别制备了单价疫苗以及二价疫苗，制备得到的疫苗能够保护机体免受柯萨奇病毒的伤害，并且也能够完全保护其他异源病毒的攻毒，可有效的预防和/或治疗由柯萨奇病毒感染所致的疾病。发明内容：

[0006] 本发明中所涉及的技术以及科学术语，如无特殊说明，均属于本领域技术人员所知的常规定义。

[0007] 本发明一方面提供了一株高滴度、传代稳定的A10型柯萨奇病毒驯化株TA151R-1，该驯化株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.13394，分类命名为柯萨奇病毒(Coxsackievirus)A10型，病毒株编号为TA151R-1，保藏日期为2016年12月26日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

[0008] 另一方面，本发明提供了利用TA151R-1制备得到的用于治疗和/或预防柯萨奇病毒所致疾病的产品。优选的，所述产品可以为纯化的病毒颗粒、灭活的病毒、抗体、抗血清、疫苗、免疫原或其他免疫组合物。优选的，所述疾病为手足口病。

[0009] 另一方面，本发明的疫苗可以为灭活疫苗、亚单位疫苗、活载体疫苗、核酸疫苗、嵌合疫苗；优选的，所述疫苗为灭活疫苗；更优选的，所述灭活采用加热或化学试剂处理灭活；优选的，所述化学试剂选自甲醛或/β-丙内酯；更优选的，所述化学试剂为甲醛；优选的，甲醛的终浓度为1:10000-1:100(v/v)，更优选的1:5000-1:1000(v/v)，更优选的1:4000(v/v)。

[0010] 另一方面，TA151R-1病毒株还可以与其他类型的柯萨奇病毒株组合使用，从而制备用于治疗和/或预防柯萨奇病毒所致疾病的产品；优选的，所述其他类型的柯萨奇病毒株选自A6、EV71、A16、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A12、A14病毒株或其任意组合；更优选的，所述其他类型的柯萨奇病毒株选自A6、EV71、A16病毒株或其任意组合；更优选的，所述其他类型的柯萨奇病毒株选自A6病毒株。

[0011] 另一方面，在制备用于治疗和/或预防柯萨奇病毒所致疾病的疫苗时，单独使用TA151R-1病毒株可以制备单价疫苗，同时使用TA151R-1病毒株与其他类型的病毒株时，可以得到二价疫苗、三价疫苗、四价疫苗以及其他的多价疫苗。

[0012] 另一方面，本发明用于治疗和/或预防柯萨奇病毒所致疾病的产品还可以包括佐剂；优选的，所述佐剂为弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂或铝盐；优选的，所述铝盐选自氢氧化铝或磷酸铝；优选的，所述佐剂为弗氏完全佐剂；优选的，所述佐剂与病毒株的用量质量比为1:5-5:1，更优选1:2-2:1，更优选1:1。

[0013] 另一方面，本发明还提供了TA151R-1病毒株在制备上述用于预防和/或治疗柯萨奇病毒所致疾病的产品中的应用。

[0014] 另一方面，本发明还提供了制备上述用于预防和/或治疗柯萨奇病毒所致疾病的产品的方法，所述方法包括利用TA151R-1病毒株作为活性成分制备上述产品的步骤。

[0015] 另一方面，在制备上述用于预防和/或治疗柯萨奇病毒所致疾病的产品时，包含将TA151R-1病毒株进行培养的步骤；优选的，将所述病毒株在细胞株中进行培养；更优选的，所述细胞株选自RD细胞、HEK293细胞、Vero细胞、MRC-5细胞、Hep-2细胞、WI-38细胞或其任意组合。

[0016] 另一方面，本发明还提供了利用TA151R-1制备免疫组合物的方法，包括将病毒株进行培养的步骤；具体而言，该方法包括在细胞株中培养TA151R-1并收集培养物的步骤，所述细胞株包括但不限于RD细胞、HEK293细胞、Vero细胞、MRC-5细胞、Hep-2细胞以及WI-38细胞；利用病毒颗粒感染细胞株，将感染细胞培养一段时间后，确保可生产病毒颗粒；之后，收集培养的病毒颗粒，将其作为免疫原，即可对抗柯萨奇病毒的感染；优选的，还包括对细胞培养物进行灭活和/或纯化的步骤。

[0017] 另一方面，本发明的灭活采用加热或化学试剂处理灭活，化学试剂优选甲醛或/β-丙内酯；优选的，采用甲醛，甲醛的终浓度为1:10000-1:100(v/v)，更优选的1:5000-1:1000(v/v)，更优选的1:4000(v/v)；纯化优选采用密度梯度离心。

[0018] 另一方面，本发明提供了包含TA151R-1病毒株的免疫组合物；优选，灭活的病毒株；优选还包括佐剂，所述佐剂包括但不限于弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、铝盐等，所述铝盐优选氢氧化铝、磷酸铝；优选的，佐剂为弗氏完全佐剂；所述佐剂与病毒液的质量比为1:5-5:1，优选的1:2-2:1，更优选1:1。

[0019] 另一方面，本发明的免疫组合物还可以包括其他类型的柯萨奇病毒株，包括但不限于A6、EV71、A16、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A12、A14；优选A6、EV71和A16；更优选的，A6病毒株；更优选的，A6病毒株的保藏编号为CGMCC No.13393；所述病毒株优选灭活的病毒株。

[0020] 另一方面，本发明提供了制备抗血清的方法，包括利用病毒株感染细胞、培养、收获毒液、得到疫苗原液，用疫苗原液免疫动物，获得抗血清；所述动物优选猴、羊、兔；优选的，上述方法还包括灭活和/或纯化的步骤。

[0021] 另一方面，本发明还提供了利用TA151R-1病毒株制备的疫苗，包括但不限于灭活疫苗、亚单位疫苗、活载体疫苗、核酸疫苗、嵌合疫苗；优选灭活疫苗；灭活优选采用加热或化学试剂处理灭活，化学试剂优选甲醛或/β-丙内酯。

[0022] 另一方面，本发明的产品还可以包含药学上可接受的佐剂，所述佐剂包括但不限于弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、铝盐等，所述铝盐优选氢氧化铝、磷酸铝。

[0023] 另一方面，本发明的产品可被制成各种适用于哺乳动物给药的剂型，所述剂型包括但不限于：注射剂、胶囊剂、片剂、乳剂、栓剂，优选注射剂，所述哺乳动物优选人。

[0024] 另一方面，本发明提供了利用免疫组合物治疗和/或预防由柯萨奇病毒所致疾病的方法，所述疾病优选手足口病。

[0025] 另一方面，本发明提供了利用TA151R-1感染动物模型的建立方法以及建立的动物模型，其能够提供稳定的动物模型，为柯萨奇病毒疫苗的研制以及抗病毒药物的筛选和A10型病毒感染机制的研究提供基础；具体而言，利用病毒培养液感染动物，从而制备动物模型；优选的，所述动物为小鼠。

[0026] 另一方面，本发明利用TA151R-1建立的感染动物模型可用于筛选药物、评价疫苗效果，疫苗安全性和有效性，研究致病机理。

[0027] 另一方面，本发明的TA151R-1病毒株还可以用于评价疫苗的保护效果。

[0028] 另一方面，本发明还提供了TA151R-1病毒株的驯化筛选方法，其包括由初始菌株TA151R驯化筛选得到。

[0029] 另一方面，本发明还提供了利用TA151R-1病毒株和其他类型的柯萨奇病毒制备的多价疫苗，其他类型的柯萨奇病毒包括但不限于A6、EV71、A16、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A12、A14，优选A6、EV71和A16，更优选的，与A6制备成二价疫苗，更优选的A6病毒株的保藏编号为CGMCC No.13393。

[0030] 另一方面，本发明还提供了包含A10病毒株TA151R-1和柯萨奇A6病毒株的病毒组合物；优选，保藏号为CGMCC No.13393的A6病毒株；A10和A6可以采用任意比例混合，优选的，A10和A6的比例可以为1:10-10:1，更优选的，A10和A6等比例混合，上述比例为病毒颗粒的比例；优选，所述病毒为灭活的病毒。

[0031] 另一方面，本发明的病毒组合物还包括其他类型的柯萨奇病毒株；优选的，所述其他类型的柯萨奇病毒株选自EV71、A16、A2、A3、A4、A5、A7、A8、A12、A14病毒株或其任意组合；更优选的，所述其他类型的柯萨奇病毒株选自EV71、A16病毒株或其任意组合。

[0032] 另一方面，本发明所述的病毒组合物中所述病毒株为灭活的病毒株；优选的，所述灭活采用加热或化学试剂处理灭活；优选的，所述化学试剂选自甲醛或/β-丙内酯；更优选的，所述化学试剂为甲醛；优选的，甲醛的终浓度为1:10000-1:100(v/v)，更优选的1:5000-1:1000(v/v)，更优选的1:4000(v/v)。

[0033] 另一方面，本发明还提供了利用上述病毒组合物制备得到的用于预防和/或治疗柯萨奇病毒所致疾病的产品，所述产品选自纯化的病毒颗粒、灭活病毒、抗体、抗血清、疫苗、免疫原或其他免疫组合物；优选的，所述疫苗为灭活疫苗、亚单位疫苗、活载体疫苗、核酸疫苗、嵌合疫苗；更优选的，所述疫苗为灭活疫苗；优选的，所述疾病为手足口病。更优选的，所述疫苗为二价疫苗、三价疫苗、四价疫苗、五价疫苗或更多价的疫苗。

[0034] 另一方面，本发明的产品还包括佐剂；优选的，所述佐剂选自弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂或铝盐；所述铝盐优选氢氧化铝、磷酸铝；更优选的，佐剂为弗氏完全佐剂；优选的，所述佐剂与病毒颗粒用量比例为1:5-5:1，更优选1:2-2:1，更优选1:1。

[0035] 另一方面，本发明还提供了上述病毒组合物在制备预防和/或治疗柯萨奇病毒所致疾病的产品中的应用。所述应用包括将病毒株进行培养的步骤；优选的，将所述病毒株在细胞株中进行培养。

[0036] 另一方面，本发明还提供了制备预防和/或治疗柯萨奇病毒所致疾病的产品的方法，所述方法包括利用上述病毒组合物作为活性成分制备所述产品的步骤。

[0037] 另一方面，本发明还提供了利用上述病毒组合物制备二价疫苗的用途以及制备得到的二价疫苗，优选还包含佐剂。

[0038] 另一方，本发明还提供了制备二价疫苗的方法，其包括用上述病毒组合物生产疫苗的步骤；优选的还包括感染、纯化、灭活的步骤。

[0039] 有益效果：本发明通过驯化筛选到一株高滴度、传代稳定的柯萨奇病毒株A10驯化株TA151R-1，该病毒株滴度可高达6.4×109TCID50/ml，能够感染RD细胞、HEK293细胞、Vero细胞、MRC-5细胞、Hep-2细胞以及WI-38细胞等多种细胞系，具有广阔的应用前景。本发明利用TA151R-1制备得到了单价疫苗，还可以与其他类型的病毒株制备得到多价疫苗，制备得到的疫苗能够保护机体免受柯萨奇病毒的伤害，并且也能够完全保护其他异源病毒的攻毒，可有效的预防和/或治疗由柯萨奇病毒感染所致的疾病。附图说明：

[0040] 图1驯化株XH01-08传代结果图；XH01、XH02、XH05、XH06、XH08在传代过程中分别呈现出不同的滴度降低或者滴度不稳定的情形，而XH03、XH04、XH07在传代过程中稳定性较好。

[0041] 图2驯化株XH03/XH04/XH07抗体滴度图；与TA151R相比，XH03和XH07的抗体滴度明显降低，而XH04的抗体滴度则与TA151R抗体滴度相当。

[0042] 图3单价苗和二价苗诱导乳鼠的体液免疫应答结果图

[0043] 图4单价苗和二价苗诱导乳鼠的细胞免疫应答结果图

[0044] 图5主动免疫单价苗和二价苗对乳鼠感染CVA6或CVA10的保护

[0045] 图6被动免疫单价苗和二价苗对乳鼠感染CVA6或CVA10的保护

[0046] 图7单价苗和二价苗免疫后乳鼠外周血中总IgG和中和抗体滴度

[0047] 图8母传抗体(MA)对CVA6或CVA10在乳鼠体内致病作用的抵抗

[0048] 图9母传抗体对CVA6或CVA10诱导乳鼠炎性细胞因子的抵抗

[0049] 图10母传抗体对WF057R(CVA6)或TA151R-1(CVA10)攻毒体内保护结果

[0050] 图11二价苗对异源病毒CVA6/WH15066和CVA10/WH21R攻毒的保护结果

[0051] 图12单价苗和二价苗母传抗体感染乳鼠病毒核酸qRT-PCR检测图具体实施方式：

[0052] 下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的描述，给出的实施例仅为阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均是本领域的常规技术方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

[0053] 本发明的“柯萨奇病毒A10”，也可称为柯萨奇病毒CVA10型，也可称为柯萨奇A10病毒，也可称为A10型柯萨奇病毒，也可称为柯萨奇CVA10病毒，也可称为柯萨奇病毒A组10型。

[0054] 实施例1柯萨奇病毒A10型毒株的分离、筛选与驯化

[0055] 本发明人在前期进行了大量的分离、筛选工作，于2015年从山东省一名4岁患儿的粪便样本中分离获得柯萨奇病毒A10型毒株TA151R，并利用该毒株建立了感染动物模型，制备了全病毒灭活疫苗，并研究了疫苗的免疫保护效果(“Protective Efficacies of Formaldehyde-Inactivated Whole-Virus Vaccine and Antivirals in a Murine Model of Coxsackievirus A10Infection”，Zhenjie Zhang等，《Journal of Virology》，2017年第91卷，e00333-17)。在后续的研究过程中，我们发现TA151R在传代过程中会出现滴度降低、传代不稳定的问题，严重制约了该毒株的应用；为了解决这一问题，我们对TA151R进行了驯化筛选。

[0056] 将TA151R病毒接种于含2％胎牛血清及1％青霉素链霉素混合液的MEM维持液中的单层RD细胞(ATCC,CCL-136)上，至细胞出现致细胞病变效应(Cytopathic effect，CPE)面积超过80％时，反复冻融3次，收集病毒液，进行连续传代驯化，筛选到了滴度增加的病毒驯化株XH01-08，各病毒株在RD细胞中的滴度如下表1所示；扩增不同代次CVA10的VP1基因，并送上海生工进行测序，测序后进行序列比对，发现传至各代次病毒VP1核苷酸与毒株TA151R同源性趋近于99.8％，氨基酸同源性由99.5％趋近于100％。

[0057] 表1：TA151R病毒株与不同驯化株在RD细胞中的病毒滴度(109TCID50/mL)

[0058] 毒株 TA151R XH01 XH02 XH03 XH04 XH05 XH06 XH07 XH08滴度 0.81 2.5 2.1 4.5 6.4 4.8 4.0 4.1 8.5

[0059] 实施例2高滴度驯化株XH01-08的传代稳定性

[0060] 利用RD细胞对实施例1中的高滴度驯化株XH01-08进行连续传代培养，至细胞出现致细胞病变效应面积超过80％时，反复冻融3次，收集第一代病毒液，并测定病毒滴度；采用相同的方法将收获的第一代病毒连续传代30次，每代次收集病毒并测定滴度，比较不同代次病毒滴度的高低。如图1所示，XH01、XH02、XH05、XH06、XH08在传代过程中分别呈现出不同的滴度降低或者滴度不稳定的情形，而XH03、XH04、XH07在传代过程中稳定性较好且能产生高滴度的病毒。

[0061] 实施例3驯化株XH03/XH04/XH07的抗血清试验

[0062] 将0.4％甲醛灭活的TA151R、XH03、XH04和XH07抗原分别与完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂按体积1:1混合，超声完全乳化后，6周龄ICR小鼠(n＝6)经腹腔注射完全弗氏佐剂与抗原乳化液300ul，间隔7天后，再经腹腔注射不完全弗氏佐剂与抗原乳化液300ul，20天后从免疫小鼠眼眶静脉丛取外周血离心取血清。将免疫血清自1:8开始进行2倍系列稀释后，分别与100CCID50(Cell culture infective dose 50％)的CVA10混合，置37℃中和2h，5
混合液加入单层RD细胞的96孔板(1×10/孔)中，置CO2培养箱中于37℃培养48h，观察细胞CPE，以能抑制50％细胞病变的最高稀释度的倒数作为中和抗体效价。同时设病毒回滴试验，回滴值为32～320CCID50/孔时抗体滴度判为准确。

[0063] 不同病毒免疫成年ICR鼠后20天后采集外周血，微量中和实验检测各组实验组中和抗体滴度，发现实验组之间抗体滴度有差异。如图2所示，与TA151R相比，XH03和XH07的抗体滴度明显降低，而XH04的抗体滴度则与TA151R抗体滴度相当。

[0064] 基于上述驯化、筛选的结果，我们得到了一株高滴度、传代稳定并且抗体滴度较高的柯萨奇病毒A10型驯化株XH04，将其命名为TA151R-1，并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13394。

[0065] 我们对TA151R-1进行了不同细胞系感染试验，如表2所示，TA151R-1能够感染RD、HEK293、Vero、MRC-5、Hep-2以及WI-38细胞系，尤其是对RD细胞和Vero细胞表现了良好的感染效率，相对于CN106661102A中的A10病毒株M2014来说，具有更广阔的应用前景。

[0066] 表2TA151R-1对不同细胞系的感染结果

[0067]

[0068]

[0069] 注：+表示可以感染，-表示不能感染

[0070] CPE的观察记录格式：0～25％的细胞出现病变记录为“+”；25％～50％的细胞出现病变记录为“++”；50％～75％的细胞出现病变记录为“+++”；75％～100％的细胞出现病变记录为“++++”

[0071] 实施例4柯萨奇病毒A组10型、6型单价疫苗和二价疫苗的制备

[0072] 4.1细胞和病毒

[0073] 利用柯萨奇病毒A组10型病毒株TA151R-1(A10)和柯萨奇病毒A组6型病毒株WF057R(A6)(保藏编号：CGMCC No.13393，详见专利申请：CN106947745A)制备单价疫苗和二价疫苗。TA151R-1和WF057R经RD细胞体外扩增3次后测定病毒滴度为6.4×109TCID50/ml和9.6×109TCID50/ml，病毒株存放于-80℃超低温冰箱备用。

[0074] TA151R-1和WF057R病毒液中分别加入浓度37％、终浓度为1/4,000的甲醛(国药，北京)以灭活病毒。灭活的TA151R-1和WF057R按体积1:1.5的比例混合制备成蛋白含量相等的灭活二价疫苗悬液。10ml的TA151R-1、WF057R和两者混合悬液分别加入等体积的弗氏完全佐剂(Sigma，英国)形成病毒乳化液制备单价苗(CVA10单价苗、CVA6单价苗)和二价苗(CVA6/CVA10二价苗)。取适量的乳化液分别接种于RD细胞上连续传代并培养3周，以无明显的RD细胞病变(CPE)且荧光定量PCR无核酸检出为准。

[0075] 4.2小鼠感染实验

[0076] 参照表3皮下接种1日龄乳鼠(9～10只/组)50ul灭活的CVA6单价苗、CVA6/CVA10二价苗和75ul CVA10单价苗，间隔5天后相同剂量加强免疫一次，阴性对照组注射等体积PBS。5.5
不同实验组10日龄乳鼠肌肉途径分别注射致死剂量的病毒：CVA6 10 TCID50、CVA101.5×
103TCID50和CVA6/CVA10 105.5/1.5×103TCID50。每组乳鼠隔离饲养，每天观察其临床症状、记录乳鼠体重变化和统计死亡率直到感染后20天。感染乳鼠分别于感染后5、7、9天处死取脑、心、肺脏和对侧骨骼肌，采用Real-time PCR检测病毒载量动态变化。

[0077] 为评价病毒株对乳鼠致病的严重程度，对不同的临床表现赋予不同的分值，本研究参考Mao(Mao et al.,2012)和Liu(Liu et al.,2014)等人在建立肠道病毒CVA16乳鼠模型时所采用的临床评分标准(表4)。

[0078] 表3感染与分组

[0079]

[0080] 表4临床标准评分

[0081]

[0082] 4.3评价系统抗体应答

[0083] 新生乳鼠免疫接种灭活单价苗和二价苗后，实验组和对照组乳鼠5、10和15日龄时通过眼球摘除收集外周血，血清分离后采用ELISA试剂盒(联科生物，杭州)检测血中总IgG含量。中和抗体的几何平均滴度(GMT)通过微量中和实验检测。将免疫血清自1:8开始进行2倍系列稀释后，分别与100CCID50(细胞培养半数感染量)的CVA6、CVA10或共感染，接种于96孔板中，置37℃中和2小时，RD细胞(1×105/孔)铺96-孔板，置CO2培养箱中于37℃培养7天，观察CPE，以能抑制50％细胞病变的最高稀释度的倒数作为中和抗体效价。同时设病毒回滴试验，回滴值为32～320CCID50/孔时抗体滴度判为准确。

[0084] 4.4T淋巴细胞增殖和ELISPOT

[0085] 1日龄乳鼠免疫接种灭活单价苗和二价苗后，分别于10和15日龄时无菌取脾脏和胸腺，将脾脏和胸腺用0.25％的含EDTA胰蛋白酶消化成单个细胞后加入96孔培养板中，每孔加入细胞105个，向实验组中加入相对应的灭活病毒104.5TCID50作为刺激物，混合感染组每孔加入CVA6/CVA10各104TCID50。培养板于细胞培养箱中37℃、5％CO2条件下培养3天。采用ELISA BrdU试剂盒(罗氏诊断，德国)参照其说明书检测T淋巴细胞增殖。ELISPOT实验中，将培养板中病毒激活的分泌IFN-γ或IL-4的T淋巴细胞置于CO2培养箱中培养16～20小时。弃去上清液，并向培养版中加满冰冷的去离子水(冰水混合物中的水)，4摄氏度低渗裂解10～15分钟。加入辣根过氧化酶标记的抗体和底物显色后，采用酶联免疫斑点读板仪(ImmunoSpot Series 3Analyzer)进行斑点形成计数并记录。

[0086] 4.5被动免疫对乳鼠的保护

[0087] 5日龄乳鼠静脉注射50ul CVA6单苗、CVA10单苗和二价苗抗血清。24小时后，乳鼠分别肌肉接种致死剂量的CVA6/WF057R(105.5TCID50)、CVA10/TA151R-1(1.5×103TCID50)。每组乳鼠隔离饲养，每天观察其临床症状、记录乳鼠体重变化和统计死亡率直到感染后14天。

[0088] 4.6母传抗体对乳鼠的保护

[0089] 为研究二价苗诱导成年母鼠免疫应答通过母传抗体传递对新生乳鼠的保护作用，8周龄母鼠皮下多位点注射200μl单价苗或者二价苗，间隔2周后以同样的方式加强免疫一次。第一次免疫后雌鼠和雄鼠交配，第二次免疫后一周左右乳鼠分娩。采用ELISA试剂盒和微量中和实验检测分娩乳鼠外周血中总IgG和CVA6或CVA10中和抗体滴度。母传抗体组5日龄乳鼠分别经肌肉途径注射致死剂量的CVA6 105.5TCID50、CVA10 1.5×103TCID50、CVA6/CVA10105.5/1.5×103TCID50，异源病毒CVA6/WH15066(GenBank no.KY126092)1.5×
103TCID50和CVA10/WH21R(GenBank no.KY272007)1.5×103TCID50，同时设置阳性感染对照组。病毒接种后1、3、5和7天，采集外周血离心血清，利用炎性细胞因子检测试剂盒(联科生物，杭州)检测TNF-α和IL-6的变化，细胞因子的检测下限分别为：TNF-α(1.63pg/ml)和IL-6(1.17pg/ml)。于感染后6天采集各组乳鼠的肺脏和骨骼肌进行HE染色进行病理分析，一抗分别采用抗CVA6或CVA10多克隆抗体进行免疫组化分析。乳鼠接种病毒后连续观察12天并记录其临床评分和生存率。

[0090] 4.7二价苗诱导乳鼠的体液免疫应答

[0091] 为了评价疫苗接种乳鼠后能否诱导体液免疫应答，实验组乳鼠分别皮下两次接种单价苗和二价苗。首先，采用ELISA试剂盒检测免疫后乳鼠血清中IgG含量，如图3所示，乳鼠第一次免疫单价苗和二价苗后均能检测到外周血中IgG升高，但是二免后IgG抗体高达4～5×104pg/ml，显著高于一免和对照组(P<0.01)。二价苗组总IgG略高于单价苗组，差异不显著(图3A)。通过微量中和试验检测二免后10天乳鼠外周血中CVA6和CVA10中和抗体滴度，发现单价苗和二价苗免疫组抗体滴度GMT均为16(图3B)。结果表明，二剂量皮下免疫二价苗能够显著诱导乳鼠的抗体应答。

[0092] 4.8二价苗诱导乳鼠的细胞免疫应答

[0093] 我们采用BrdU法检测了脾脏和胸腺中病毒特异的T淋巴细胞免疫应答。如图4A所示，相比对照组，ICR乳鼠首次免疫单价苗或者二价苗后T细胞增殖水平显著低于第二次免疫后增殖水平(P<0.05)，第二次免疫后5天脾脏和胸腺中特异T淋巴细胞增殖显著。脾脏中T细胞增殖水平显著高于胸腺(P<0.05)，二价苗组T淋巴细胞增殖水平略高于单价苗组(P>0.05)。

[0094] 与BrdU法检测数据相一致，IFN-γ和IL-4ELISPOT分析发现乳鼠第一次免疫疫苗后脾脏和胸腺中分泌IFN-γT淋巴细胞多达35个斑点形成细胞(SFC)/106细胞(图4B)。第二次免疫后5天，脾脏中分泌IFN-γT细胞升高到80～100SFC/106细胞，二价苗诱导分泌型T细胞SFC略高于单价苗(P>0.05)。IL-4ELISPOT分析表明在脾脏和胸腺中二价苗诱导的分泌IL-4T细胞增殖水平高达190SFC/106细胞，显著高于分泌IFN-γT细胞的SFC频率(P<0.05)。以上数据表明，二剂量免疫单价苗和二价苗均能诱导强烈的T细胞免疫应答，且T淋巴细胞经特异性抗原刺激后以分泌细胞因子IL-4的Th2途径诱发体液免疫为主。

[0095] 4.9主动免疫对乳鼠感染CVA6或CVA10的保护

[0096] 我们通过主动免疫乳鼠后接种致死剂量的CVA6和CVA10，观察乳鼠临床症状的变化。如图5所示，发现两次主动免疫CVA6或CVA10单价苗的小鼠在感染病毒后，相对于仅攻毒组临床症状出现的时间延缓2-3天，阳性对照组在感染后4-5天开始出现症状，而主动免疫组在感染病毒后7-8天才开始出现临床症状；CVA6和CVA10单价苗对乳鼠的保护率均为80％，而未免疫组的生存率分别为40％和0(图5A-B)。同样地，二价苗主动免疫组乳鼠临床症状出现时间也延缓3-4天，且体重下降幅度显著小于未免疫组(P<0.05)；最终生存率为
60％，而未免疫组乳鼠全部死亡(图5C)。交叉免疫保护实验发现CVA6和CVA10之间无交叉保护能力，与病毒单独感染组乳鼠生存率无显著性差异(P>0.05)。同时，通过Real-time荧光定量检测发现主动免疫组各脏器病毒载量均显著低于同期阳性感染组，交叉免疫保护组乳鼠体内病毒载量与阳性感染组无显著性差异(图5D)。数据表明，二价苗能提供给乳鼠一定水平的免疫保护作用，CVA6和CVA10之间无交叉保护能力。

[0097] 4.10被动免疫对乳鼠感染CVA6或CVA10的保护

[0098] 为了评估二价苗通过被动免疫对乳鼠的保护作用，5日龄新生乳鼠注射100ul抗血清，24小时后，接种致死剂量的CVA6或CVA10，连续观察乳鼠的生存率和临床症状14天。如图6A-B所示，未注射抗血清的对照组乳鼠CVA6或CVA10感染后4-5天出现临床症状，例如单或双后肢无力、瘫痪，感染后9天乳鼠全部死亡。单价苗免疫抗血清注射组能够抵抗CVA6或CVA10的感染，但是CVA6或CVA10抗血清相互之间无交叉保护作用。相比之下，二价苗均能够保护乳鼠对CVA6或CVA10的共感染，乳鼠均无明显的临床症状，生存率为100％。

[0099] 4.11新生乳鼠外周血中总IgG和CVA6、CVA10中和抗体的滴度

[0100] 通过检测新生乳鼠外周血中母传抗体的滴度衡量单价苗和二价苗诱导成年母鼠的免疫应答效应。6周龄的ICR母鼠三次免疫单价苗和二价苗以及PBS(阴性对照)后，通过ELISA检测发现各组母鼠分娩的1、5和10日龄乳鼠外周血中有极高浓度的免疫球蛋白IgG，含量高达1.3～1.5×105pg/ml；二价苗组新生乳鼠外周血中IgG高达1.6×105pg/ml(图7A)。微量中和实验表明CVA6和CVA10单价苗组母鼠分娩的1日龄乳鼠外周血中抗体滴度均高达
1098和870(均值±SD，n＝6)，二价苗免疫组乳鼠体内中和抗体高达975(图7B)。结果表明，相比单价苗来说，二价苗中CVA6和CVA10免疫原性相互之间无干扰或拮抗现象存在，其诱导母鼠CVA6或CVA10抗体滴度与单价苗组抗体无显著性差异(P>0.05)。

[0101] 4.12母传抗体(MA)对CVA6或CVA10在乳鼠体内致病作用的抵抗

[0102] 通过组织病理学和免疫组化衡量乳鼠感染病毒后组织病变程度。H.E.染色显示，无母传抗体组(MA-)乳鼠共感染CVA6和CVA10后导致严重的病毒性肺炎，表现为弥漫性肺实质、肺泡和间质纤维化及大量淋巴细胞浸润(图8A)；后肢肌肉组织出现大量淋巴细胞浸润、间质水肿及纤维组织增生范围扩大，并且开始出现骨骼肌纤维坏死和肌束断裂现象(图8B)；而有母传抗体组(MA+)乳鼠肺脏和后肢肌无明显的病理变化(图8C-D)。IHC可见CVA6和CVA10病毒抗原弥漫性分布于肺泡组织(图8E-F)和骨骼肌纤维(图8G-H)，且病毒含量非常高，这与后肢肌严重的病理损伤和病毒性肺炎相一致。相反，二价苗母传抗体组乳鼠的肌肉和肺脏组织均未发现脏器损伤和炎症反应。结果表明，从组织病理学角度母传抗体能提供乳鼠对致死剂量CVA6和CVA10共感染的免疫保护。

[0103] 4.13母传抗体对CVA6或CVA10诱导乳鼠炎性细胞因子的抵抗

[0104] 动态检测新生乳鼠攻毒后外周血中炎性细胞因子的表达水平。如图9所示，CVA6和CVA10单价苗或二价苗免疫母鼠，其分娩的乳鼠攻毒后与重症发生有关的炎性细胞因子TNF-α和IL-6的表达与阴性对照无差异(P>0.05)，检测值低于7pg/ml和60pg/ml。而未免疫组母鼠分娩的乳鼠在病毒单独或共感染后IL-6表现出增加先升高后降低的趋势，其中IL-6表达峰值高达2000pg/ml；TNF-α同样在感染后期表达量升高到100～120pg/ml。数据表明，母传抗体能抵抗CVA6和CVA10的单独或共感染，并无高水平炎性细胞因子的表达。

[0105] 4.14母传抗体对乳鼠攻毒的体内保护实验

[0106] 我们进行了母传抗体对乳鼠攻毒的保护实验。将制备的单价苗和二价苗间隔2周免疫8周龄乳鼠两次后，对其分娩的5日龄乳鼠接种致死剂量的WF057R或TA151R-1，图10显示无母传抗体的乳鼠在接种病毒后2-4天出现临床症状，体重几乎没有增加，第6天开始死亡，第9～10天全部死亡。有母传抗体的乳鼠单独或者共感染致死剂量的CVA6或CVA10后均无临床症状出现(图10A)，其体重变化与未接毒组乳鼠无差异(P>0.05)，最终生存率均为100％(图10B)。令人意外的是，二价苗也能提供乳鼠对致死剂量异源病毒CVA6/WH15066和CVA10/WH21R的完全保护，乳鼠未表现出任何临床症状(图11A)，生存率同为100％(图11B)。
有母传抗体组乳鼠感染后3、5和7天在各组织器官中qRT-PCR均未检出病毒核酸(图12)。数据表明，相比单价苗，二价苗能够诱导成年母鼠强烈的免疫应答，其母传抗体能提供乳鼠对致死剂量同源或异源CVA6和CVA10单独或者共感染的完全抵抗。