一种两性离子磁性复合水凝胶固定化酶载体及制备方法

摘要

本发明涉及一种两性离子磁性复合水凝胶固定化酶载体及制备方法；固定化酶的载体是包埋有四氧化三铁纳米粒子的两性离子水凝胶；具有双功能基团的戊二醛，一端和两性离子水凝胶相连，一端和酶表面的氨基形成席夫碱，将酶共价连接在水凝胶载体的表面。将两性离子单体、交联剂、引发剂和溶剂混合形成混合液，并与四氧化三铁溶液按照体积比3：5～3：10的比例混合；将含有四氧化三铁的混合溶液进行紫外照射或者加热或常温放置，使单体通过交联聚合包埋四氧化三铁，形成包埋有四氧化三铁的两性离子磁性复合水凝胶固定化酶载体。本发明提供的酶固定化方法继承了传统共价结合法固定化酶的优点，酶活力回收率较高，具有较高的应用价值。

权利要求

1.一种两性离子磁性复合水凝胶固定化酶载体，其特征是包埋有四氧化三铁纳米粒子的两性离子水凝胶，具有双功能基团的戊二醛，一端和两性离子水凝胶相连，一端和酶表面的氨基形成席夫碱，将酶共价连接在水凝胶载体的表面；该水凝胶载体的制备步骤如下：(1)制备稳定分散的四氧化三铁溶液；

(2)将两性离子单体、交联剂、引发剂和溶剂混合形成混合液，并与步骤1)所制备的四氧化三铁溶液按照体积比3：5～3：10的比例混合；其中两性离子单体、交联剂、引发剂和溶剂质量范围为：两性离子单体10％～60％、交联剂0.01％～5％、引发剂0.01％～0.5％和溶剂余量；两性离子单体选自如下结构：羧基甜菜碱丙烯酰胺(CBAA)

羧基甜菜碱甲基丙烯酰胺(CBMAA)

羧基甜菜碱甲基丙烯酸酯-1(CBMA-1)

羧基甜菜碱甲基丙烯酸酯-2(CBMA-2)

磺基甜菜碱丙烯酰胺(SBAA)

磺基甜菜碱甲基丙烯酰胺(SBMAA)

磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯(SBMA)

(3)将含有四氧化三铁的混合溶液进行紫外照射或者加热或常温放置，使单体通过交联聚合包埋四氧化三铁，形成包埋有四氧化三铁的两性离子磁性复合水凝胶固定化酶载体。

2.如权利要求1所述的两性离子磁性复合水凝胶固定化酶载体，其特征是步骤1)中，将四氧化三铁粉末分散于超纯水中之后，加入表面活性剂Span、Tween、阿拉伯胶或柠檬酸钠，使四氧化三铁均匀分散。

3.如权利要求1所述的两性离子磁性复合水凝胶固定化酶载体，其特征是步骤3)中，采用模板法，将混合溶液加入到载玻片和聚四氟乙烯垫片制作的浇注模板中，进行紫外照射或常温放置或37±5℃加热放置5～60min，经过交联反应形成包埋有四氧化三铁的两性离子磁性复合水凝胶固定化酶载体。

4.如权利要求1所述的两性离子磁性复合水凝胶固定化酶载体，其特征是步骤3)中，采用微流控的方法，将含有四氧化三铁的混合溶液作为分散相，将玉米油、甘油或二氯甲烷油性溶液作为连续相；将分散相与连续相分别通过分散相与连续相进样孔通入微流控芯片；

分散相进样流速和连续相进样量流速的比为1:1；微流控芯片出口连接软管，并将软管出口处连接收集管，或直接在微流控芯片处进行紫外照射，经过交联反应在容器中收集得到包埋有四氧化三铁的两性离子磁性复合水凝胶固定化酶载体。

5.如权利要求1所述的两性离子磁性复合水凝胶固定化酶载体，其特征是所述交联剂包括烯基类、丙烯酸酯类和缩水甘油醚类中的一种或多种组合；烯基类交联剂为N,N'-亚甲基双丙烯酰胺、N,N'-二甲基丙烯酰胺胱氨酸、N-羟甲基丙烯酰胺、双丙烯酸羟乙酯或双丙烯酸羟丙酯；丙烯酸酯类交联剂为三乙二醇二甲基丙烯酸酯、乙二醇双丙烯酸酯、聚乙二醇双丙烯酸酯、一缩二乙醇双丙烯酸酯或丙三醇二丙烯酸酯；缩水甘油醚类交联剂为聚乙二醇二缩水甘油醚。

6.如权利要求1所述的两性离子磁性复合水凝胶固定化酶载体，其特征是所述的引发剂包括光引发剂、氧化还原引发剂和过氧化物引发剂中的一种或多种组合；光引发剂为2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮、二苯甲酮、苯甲酰甲酸甲酯、2-异丙基硫杂蒽酮或苯偶姻异丙醚；过氧化物引发剂为偶氮二异庚腈、偶氮二异丁腈或过氧化苯甲酰；氧化还原引发剂中氧化剂为过硫酸钾、过硫酸铵或过氧化氢，还原剂为四甲基乙二胺、亚铁盐或亚硫酸钠。

7.如权利要求1所述的两性离子磁性复合水凝胶固定化酶载体，其特征是所述的溶剂为蒸馏水、磷酸缓冲溶液、氯化钠溶液中的一种。

说明书

一种两性离子磁性复合水凝胶固定化酶载体及制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一类包埋有四氧化三铁的两性离子磁性复合水凝胶固定化酶载体。本发明涉及该载体的制备方法和应用。更具体的说，本发明涉及一类包埋有四氧化三铁的两性离子磁性复合水凝胶固定化酶载体的制备方法以及用所述方法制备的载体固定酶的用途。

背景技术

[0002] 酶是一类重要的生物催化剂，能够参与生物体内多种代谢反应，具有作用条件温和、高效性、专一性、来源广泛等优点。酶被人们广泛应用于酿造、医药、食品加工、化学分析、环境保护、能源开发等领域。但是天然酶多是蛋白质类，蛋白质类酶的高级结构对于环境十分敏感，多种因素(如物理、化学、生物等)都易使酶失活变性；并且酶在反应结束后混入产品中，难以分离纯化，不能重复利用。为了克服这些缺陷，酶的固定化技术应运而生。

[0003] 酶的固定化技术是重要的酶稳定化手段，与游离酶相比，固定化酶具有以下优点：1)稳定性提高；2)容易分离回收；3)可多次重复使用，降低成本；4)操作连续可控；5)相对于游离酶，固定化酶更适合于多酶反应。在酶的固定化技术中，用于酶固定的载体的性质会在很大程度上影响固定化酶的性质。用于酶固定化的载体通常要具有以下特性：1)具有能和酶反应的官能团；2)较好的渗透性和较大的比表面积；3)水和有机溶剂不溶性；4)热稳定性及化学稳定性；5)对微生物的抵抗性；6)可重复使用性；7)良好的生物相容性。张秋禹等固定化载体材料的最新研究进展(材料导报，2006)；罗贵民等酶工程(第三版，化学工业出版社，2016)。

[0004] 酶固定化载体从最初的天然高分子材料，到后来的合成高分子材料、无机材料，再到现在的复合材料，虽然已经得到了广泛的应用，但是仍具有或多或少的缺陷：1)天然高分子材料中应用较多的有壳聚糖、海藻酸钠、明胶、卡拉胶等。壳聚糖的强度不高，并且容易被酶降解；海藻酸钠和钙形成的凝胶在含有多价阴离子或者高浓度强电解质溶液中不稳定，钙离子容易脱离，从而使凝胶分解；明胶则具有较密实的内部结构，如果作为包埋酶的介质凝胶，会影响传质；卡拉胶则稳定性差、易降解。2)合成高分子材料的应用也非常广泛，如聚丙烯酰胺凝胶、聚乙烯醇凝胶等。合成高分子材料的生物相容性不高，比如丙烯酰胺单体对生物体有神经毒性。3)无机载体材料的结构不易调控，影响传质，键合酶的能力差，对酶活影响较大。以上提到的酶固定化材料还有一些共同的缺陷，如不能抗蛋白吸附，在表面固定酶时，容易使酶吸附在载体表面；生物相容性不高等等。杨勇，李彦锋等酶固定化技术用载体材料的研究进展(化学通报,2007(4):257-263)。

[0005] 在传统固定方法的基础上，开发研究性能优异的载体材料，已经成为固定化酶技术目前最为活跃的研究方向之一。目前，已经涌现出了许多用于酶固定化的新型载体材料，其中磁性材料和亲水性材料是两个重要的研究方向。1)磁性材料具有特殊的磁响应性，可以借助外部磁场从反应体系中快速简单地富集、分离、回收固定化酶，提高酶的使用效率。不足之处在于，磁性材料的生物相容性差，不能为蛋白提供良好的亲水性环境，不利于酶很好地发挥生物学活性；并且磁性材料不能抗蛋白吸附，当用于固定化酶载体时，容易引起酶蛋白的非特异性吸附从而使蛋白结构扭曲，造成一定程度的失活；2)亲水性载体具有良好的生物相容性，能够提高底物对酶的亲和力，有利于为酶促反应创造良好的微环境。已经有人将亲水性长链引入到酶固定化载体上，从而创造适宜酶活性构象的微环境，用这种方法已经使得环己酮单加氧酶、嗜热脂肪芽孢杆菌脂肪酶更加稳定。杨勇，李彦锋等酶固定化技术用载体材料的研究进展(化学通报,2007(4):257-263)；孙建华,戴荣继等酶固定化技术研究进展(化工进展,2010,29(4):715-721)。

[0006] 两性离子水凝胶具有许多非常明显的优势，最新研究表明，两性离子水凝胶具有超亲水的特性，能够很好的给酶创造一个亲水微环境，微环境的优化对于酶发挥催化活力具有十分重要的作用。两性离子水凝胶的生物相容性非常好，用两性离子修饰的蛋白质药物进入人体之后，能够提高药动学特性，降低免疫原性，提高蛋白的稳定性。在复杂的基质(如血清)中进行生物标记检测时，两性离子水凝胶具有超低的吸附特性和很高的抗体装载量。两性离子水凝胶还能在不降低蛋白质和作用物的亲和力以及生物活性的前提下，很好的提高蛋白质的稳定性。S.Jiang等Zwitterionic polymers  exhibiting high resistance to nonspecific protein adsorption from human serum and plasma(Biomacromolecules.9(2008)1357-1361)；S.Jiang等Functionalizable and ultra stable nanoparticles coated with zwitterionic poly(carboxybetaine)in undiluted blood serum(Biomaterials.30(2009)5617-5621)；S.Jiang等Zwitterionic gel encapsulation promotes protein stability,enhances pharmacokinetics,and reduces immunogenicity(P.Natl.Acad.Sci.USA.112(2015)12046-12051)；S.Jiang等Poly(zwitterionic)protein conjugates offer increased stability without sacrificing binding affinity or bioactivity(Nat.Chem.4(2012)60-64)；S.Y.Jiang等Superlow fouling sulfobetaine and carboxybetaine polymers on glass slides(Langmuir.22(2006)10072-10077)。

[0007] 两性离子材料的诸多优势，使其有望成为固定化酶的优良载体材料。但是至今未有人将其应用于酶固定化领域。并且，单纯使用两性离子材料作为酶固定化载体，不易从反应体系中分离，不具有可重复操作性。因此，迫切需要一种新型的兼具亲水性-磁性的酶固定化载体材料，使得其制备的固定化酶容易从体系中分离，并能保持良好的生物学活性，较高的稳定性和生物相容性、以及对底物较高的亲和性。

发明内容

[0008] 本发明针对现有用于酶固定化载体的不足，首先提供了一种超亲水-磁性酶固定化载体。

[0009] 如图1、图2所示：本载体的特征在于，载体的主要基质两性离子单体聚合而成的水凝胶(1)，水凝胶内包埋有四氧化三铁纳米颗粒(2)。一方面提供这种新型的酶固定化载体材料的制备方法。

[0010] 本发明另一方面提供了按照本发明方法生产的载体固定酶。这种固定化酶的载体是包埋有四氧化三铁纳米粒子(2)的两性离子水凝胶(1)。具有双功能基团的戊二醛(3)，一端和两性离子水凝胶(1)相连，一端和酶(4)表面的氨基形成席夫碱，将酶共价连接在水凝胶载体的表面。

[0011] 本发明提供的固定化载体，其特征在于该载体以两性离子水凝胶为主要基质(1)，通过包埋四氧化三铁纳米粒子(2)，使其具有磁响应性，便于从体系中分离。

[0012] 本发明的技术方案如下：

[0013] 一种两性离子磁性复合水凝胶固定化酶载体；固定化酶的载体是包埋有四氧化三铁纳米粒子的两性离子水凝胶；具有双功能基团的戊二醛，一端和两性离子水凝胶相连，一端和酶表面的氨基形成席夫碱，将酶共价连接在水凝胶载体的表面。

[0014] 本发明的两性离子磁性复合水凝胶固定化酶载体的制备方法，包括如下步骤：

[0015] (1)按照0.1～0.12g四氧化三铁固体每300μl超纯水的比例，制备成稳定分散的四氧化三铁溶液；

[0016] (2)将两性离子单体、交联剂、引发剂和溶剂混合形成混合液，并与步骤1)所制备的四氧化三铁溶液按照体积比3：5～3：10的比例混合；

[0017] 其中两性离子单体、交联剂、引发剂和溶剂质量范围为：两性离子单体10％～60％、交联剂0.01％～5％、引发剂0.01％～0.5％和溶剂余量；

[0018] (3)将含有四氧化三铁的混合溶液进行紫外照射或者加热或常温放置，使单体通过交联聚合包埋四氧化三铁，形成包埋有四氧化三铁的两性离子磁性复合水凝胶固定化酶载体。

[0019] 所述步骤1)中，将四氧化三铁粉末分散于超纯水中之后，加入表面活性剂Span、Tween、阿拉伯胶或柠檬酸钠，使四氧化三铁均匀分散。

[0020] 所述步骤1)中按照0.1～0.12g四氧化三铁固体每300μl超纯水的比例，制备成稳定分散的四氧化三铁溶液。

[0021] 所述步骤3)中，采用模板法，将混合溶液加入到载玻片和聚四氟乙烯垫片制作的浇注模板中，进行紫外照射或常温放置或37±5℃加热放置5～60min，经过交联反应形成包埋有四氧化三铁的两性离子磁性复合水凝胶固定化酶载体。

[0022] 所述步骤3)中，采用微流控的方法，将含有四氧化三铁的混合溶液作为分散相，将玉米油、甘油或二氯甲烷油性溶液作为连续相；将分散相与连续相分别通过分散相与连续相进样孔通入微流控芯片；分散相进样流速和连续相进样量流速的比为1:1；微流控芯片出口连接软管，并将软管出口处连接收集管，或直接在微流控芯片处进行紫外照射，经过交联反应在容器中收集得到包埋有四氧化三铁的两性离子磁性复合水凝胶固定化酶载体。

[0023] 所述的两性离子单体包括羧基甜菜碱类、磺基甜菜碱类中的一种或多种两性离子分子。

[0024] 所述的两性离子材料载体羧基甜菜碱类两性离子单体包括如下结构：

[0025] 羧基甜菜碱丙烯酰胺(CBAA)

[0026] 羧基甜菜碱甲基丙烯酰胺(CBMAA)

[0027] 羧基甜菜碱甲基丙烯酸酯-1(CBMA-1)

[0028] 羧基甜菜碱甲基丙烯酸酯-2(CBMA-2)

[0029] 所述的磺基甜菜碱类两性离子单体包括：

[0030] 磺基甜菜碱丙烯酰胺(SBAA)

[0031] 磺基甜菜碱甲基丙烯酰胺(SBMAA)

[0032] 磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯(SBMA)

[0033] 所述交联剂包括烯基类、丙烯酸酯类和缩水甘油醚类中的一种或多种组合物；烯基类交联剂为N,N'-亚甲基双丙烯酰胺、N,N'-二甲基丙烯酰胺胱氨酸、N-羟甲基丙烯酰胺、双丙烯酸羟乙酯或双丙烯酸羟丙酯；丙烯酸酯类交联剂为三乙二醇二甲基丙烯酸酯、乙二醇双丙烯酸酯、聚乙二醇双丙烯酸酯、一缩二乙醇双丙烯酸酯或丙三醇二丙烯酸酯；缩水甘油醚类交联剂为聚乙二醇二缩水甘油醚。

[0034] 所述的引发剂包括光引发剂、氧化还原引发剂和过氧化物引发剂中的一种或多种组合物；光引发剂为2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮、二苯甲酮、苯甲酰甲酸甲酯、2-异丙基硫杂蒽酮或苯偶姻异丙醚；过氧化物引发剂为偶氮二异庚腈、偶氮二异丁腈或过氧化苯甲酰；氧化还原引发剂中氧化剂为过硫酸钾、过硫酸铵或过氧化氢，还原剂为四甲基乙二胺、亚铁盐或亚硫酸钠。

[0035] 所述的溶剂为蒸馏水、磷酸缓冲溶液、氯化钠溶液中的一种。

[0036] 单体发生聚合，形成两性离子水凝胶，包括如下结构：

[0037]

[0038] 本发明相对于现有技术，有以下优点：

[0039] (1)本发明提供的亲水性磁性载体安全无毒，具有良好的机械性能，耐热性好，具有良好的物理、化学稳定性，并且能够抗微生物分解和抗蛋白吸附，是极具利用价值的固定化酶的良好载体；

[0040] (2)本发明提供的酶固定化方法继承了传统共价结合法固定化酶的优点，酶活力回收率较高，具有较高的应用价值；

[0041] (3)本发明制备的酶具有较好的稳定性和重复利用性，并且由于载体具有磁性，使得产物与酶易于分离回收；

[0042] (4)本发明制备的固定化酶具有比游离酶更高的底物亲和力和更高的催化效率。

附图说明

[0043] 图1载体示意图，表示的是载体的结构特征。

[0044] 图2固定化酶示意图，表示固定化酶的结构特征。

[0045] 其中：1-两性离子水凝胶基质、2-四氧化三铁纳米颗粒、3-戊二醛、4-酶。

具体实施方式

[0046] 下面给出实施例，以对本发明作进一步的详细说明，但它们不对本发明作任何限制。

[0047] 实施例1

[0048] 模板法制备羧基甜菜碱丙烯酰胺(CBAA)两性离子磁性水凝胶载体

[0049] (1)在1.5ml离心管中加入300μl的超纯水，称取0.1g的四氧化三铁2置于离心管中，并向其中加入复配的表面活性剂：20μl Span+20μl Tween，在涡旋振荡器上振荡数秒，使四氧化三铁2分散，制成稳定的复配表面活性剂分散的四氧化三铁分散体系。

[0050] (2)称取0.006g N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(MBAA)，0.6g羧基甜菜碱丙烯酰胺(CBAA)单体，0.0016g过硫酸铵(APS)，2μl的四甲基乙二胺(TEMED)溶于1ml蒸馏水中，上述组分质量百分含量如下：

[0051] 羧基甜菜碱丙烯酰胺(CBAA)单体 37.35％

[0052] N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(交联剂) 0.37％

[0053] 过硫酸铵-四甲基乙二胺(引发剂) 0.02％

[0054] 蒸馏水(溶剂) 62.26％

[0055] 将上述溶液中加入300μl的四氧化三铁分散液；将成胶前驱体混合溶液置于涡旋振荡器上混合均匀。

[0056] 采用模板法制备羧基甜菜碱丙烯酰胺(CBAA)两性离子磁性水凝胶载体，制备过程为：

[0057] 将含有四氧化三铁的混合溶液加入用载玻片和聚四氟乙烯垫片制作的浇注模板中，在37℃烘箱中加热30min，使羧基甜菜碱丙烯酰胺(CBAA)单体交联形成水凝胶1，包埋四氧化三铁2，得到厚度为0.5mm的包埋有四氧化三铁磁性粒子的两性离子固定化酶载体。

[0058] (3)先将步骤(2)得到的充分溶胀之后的水凝胶用美工刀切成约1mm*1mm*0.5mm的立方体状，置于真空干燥箱中，90℃干燥12h。待其充分干燥之后，再进一步用研钵将其研碎成细碎的粉末状。

[0059] 实施例2

[0060] 模板法制备羧基甜菜碱甲基丙烯酰胺(CBMAA)两性离子磁性水凝胶载体[0061] (1)在1.5ml离心管中加入600μl的超纯水，称取0.2g的四氧化三铁2置于离心管中，并向其中加入0.05g阿拉伯胶，在涡旋振荡器上振荡数秒，使四氧化三铁2分散，制成稳定的阿拉伯胶分散的四氧化三铁分散体系。

[0062] (2)称取0.041g N,N’-二甲基丙烯酰胺胱氨酸，0.194g羧基甜菜碱甲基丙烯酰胺(CBMAA)单体，0.005g偶氮二异庚腈，溶于1.7ml蒸馏水中，上述组分的质量百分含量如下：

[0063] 羧基甜菜碱甲基丙烯酰胺(CBMAA)单体 10.00％

[0064] N,N’-二甲基丙烯酰胺胱氨酸(交联剂) 2.09％

[0065] 偶氮二异庚腈(引发剂) 0.26％

[0066] 蒸馏水(溶剂) 87.65％

[0067] 将上述溶液中加入600μl的四氧化三铁分散液。将成胶前驱体混合溶液置于涡旋振荡器上混合均匀。

[0068] 采用模板法制备羧基甜菜碱甲基丙烯酰胺(CBMAA)两性离子磁性水凝胶载体，制备过程为：

[0069] 将含有四氧化三铁的混合溶液加入用载玻片和聚四氟乙烯垫片制作的浇注模板中，在37℃烘箱中加热30min，使羧基甜菜碱甲基丙烯酰胺(CBMAA)单体交联形成水凝胶1，包埋四氧化三铁2，得到厚度为0.5mm的包埋有四氧化三铁磁性粒子的两性离子固定化酶载体。

[0070] (3)先将步骤(2)得到的充分溶胀之后的水凝胶用美工刀切成约1mm*1mm*0.5mm的立方体状，置于真空干燥箱中，90℃干燥12h。待其充分干燥之后，再进一步用研钵将其研碎成细碎的粉末状。

[0071] 实施例3

[0072] 模板法制备羧基甜菜碱甲基丙烯酸酯-1(CBMA-1)两性离子磁性水凝胶载体[0073] (1)在1.5ml离心管中加入300μl的超纯水，称取0.1g的四氧化三铁2置于离心管中，并向其中加入0.039g柠檬酸钠，在涡旋振荡器上振荡数秒，使四氧化三铁2分散，制成稳定的柠檬酸钠分散的四氧化三铁分散体系。

[0074] (2)取4.29μL聚乙二醇二缩水甘油醚，0.692g羧基甜菜碱甲基丙烯酸酯-1(CBMA-1)单体，0.001g过硫酸铵(APS)，2μl的四甲基乙二胺(TEMED)溶于1ml 1M氯化钠溶液中。上述组分的质量百分含量如下：

[0075]

[0076] 将上述溶液中加入300μl的四氧化三铁分散液。将成胶前驱体混合溶液置于涡旋振荡器上混合均匀。

[0077] 采用模板法制备羧基甜菜碱甲基丙烯酸酯-1(CBMA-1)两性离子磁性水凝胶载体，制备过程为：

[0078] 将含有四氧化三铁的混合溶液加入用载玻片和聚四氟乙烯垫片制作的浇注模板中，在37℃烘箱中加热30min，使羧基甜菜碱甲基丙烯酸酯-1(CBMA-1)单体交联形成水凝胶基质1，包埋四氧化三铁2，得到厚度为0.5mm的包埋有四氧化三铁磁性粒子的两性离子固定化酶载体。

[0079] (3)先将步骤(2)得到的充分溶胀之后的水凝胶用美工刀切成约1mm*1mm*0.5mm的立方体状，置于真空干燥箱中，90℃干燥12h。待其充分干燥之后，再进一步用研钵将其研碎成细碎的粉末状。

[0080] 实施例4

[0081] 模板法制备羧基甜菜碱甲基丙烯酸酯-2(CBMA-2)两性离子磁性水凝胶载体[0082] (1)在1.5ml离心管中加入300μl的超纯水，称取0.12g的四氧化三铁2置于离心管中，并向其中加入复配的表面活性剂：20μl Span+20μl Tween，在涡旋振荡器上振荡数秒，使四氧化三铁2分散，制成稳定的复配表面活性剂分散的四氧化三铁分散体系。

[0083] (2)取0.17μl三乙二醇二甲基丙烯酸酯，0.852g羧基甜菜碱甲基丙烯酸酯-2(CBMA-2)单体，6.46mg偶氮二异庚腈溶于1ml蒸馏水中，上述组分质量百分含量如下：

[0084]

[0085] 将上述溶液中加入300μl的四氧化三铁分散液。将成胶前驱体混合溶液置于涡旋振荡器上混合均匀。

[0086] 采用模板法制备羧基甜菜碱甲基丙烯酸酯-2(CBMA-2)两性离子磁性水凝胶载体，制备过程为：

[0087] 将含有四氧化三铁的混合溶液加入用载玻片和聚四氟乙烯垫片制作的浇注模板中，在37℃烘箱中加热30min，使羧基甜菜碱甲基丙烯酸酯-2(CBMA-2)单体交联水凝胶基质1，包埋四氧化三铁2，得到厚度为0.5mm的包埋有四氧化三铁磁性粒子的两性离子固定化酶载体。

[0088] (3)先将步骤(2)得到的充分溶胀之后的水凝胶用美工刀切成约1mm*1mm*0.5mm的立方体状，置于真空干燥箱中，90℃干燥12h。待其充分干燥之后，再进一步用研钵将其研碎成细碎的粉末状。

[0089] 实施例5

[0090] 模板法制备磺基甜菜碱丙烯酰胺(SBAA)两性离子磁性水凝胶载体

[0091] (1)在1.5ml离心管中加入300μl的超纯水，称取0.11g的四氧化三铁2置于离心管中，并向其中加入复配的表面活性剂：20μl Span+20μl Tween，在涡旋振荡器上振荡数秒，使四氧化三铁2分散，制成稳定的复配表面活性剂分散的四氧化三铁分散体系。

[0092] (2)称取0.092g N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(MBAA)，0.7g磺基甜菜碱丙烯酰胺(SBAA)单体，5μl 2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮溶于1ml 1M氯化钠溶液中，上述组分质量百分含量如下：

[0093]

[0094] 将上述溶液中加入300μl的四氧化三铁分散液。将成胶前驱体混合溶液置于涡旋振荡器上混合均匀。

[0095] 采用模板法制备磺基甜菜碱丙烯酰胺(SBAA)两性离子磁性水凝胶载体，制备过程为：

[0096] 将含有四氧化三铁的混合溶液加入用载玻片和聚四氟乙烯垫片制作的浇注模板中，在37℃烘箱中加热30min，使磺基甜菜碱丙烯酰胺(SBAA)单体交联水凝胶基质1，包埋四氧化三铁2，得到厚度为0.5mm的包埋有四氧化三铁磁性粒子的两性离子固定化酶载体。

[0097] (3)先将步骤(2)得到的充分溶胀之后的水凝胶用美工刀切成约1mm*1mm*0.5mm的立方体状，置于真空干燥箱中，90℃干燥12h。待其充分干燥之后，再进一步用研钵将其研碎成细碎的粉末状。

[0098] 实施例6

[0099] 模板法制备磺基甜菜碱甲基丙烯酰胺(SBMAA)两性离子磁性水凝胶载体[0100] (1)在1.5ml离心管中加入300μl的超纯水，称取0.1g的四氧化三铁2置于离心管中，并向其中加入复配的表面活性剂：20μl Span+20μl Tween，在涡旋振荡器上振荡数秒，使四氧化三铁2分散，制成稳定的复配表面活性剂分散的四氧化三铁分散体系。

[0101] (2)称取0.012g N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(MBAA)，0.2989g磺基甜菜碱甲基丙烯酰胺(SBMAA)单体，3μl 2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮溶于0.5ml 1M氯化钠溶液中，上述组分质量百分含量如下：

[0102]

[0103] 将上述溶液中加入300μl的四氧化三铁分散液。将成胶前驱体混合溶液置于涡旋振荡器上混合均匀。

[0104] 采用模板法制备磺基甜菜碱甲基丙烯酰胺(SBMAA)两性离子磁性水凝胶载体，制备过程为：

[0105] 将含有四氧化三铁的混合溶液加入用载玻片和聚四氟乙烯垫片制作的浇注模板中，在37℃烘箱中加热30min，使磺基甜菜碱甲基丙烯酰胺(SBMAA)单体交联水凝胶基质1，包埋四氧化三铁2，得到厚度为0.5mm的包埋有四氧化三铁磁性粒子的两性离子固定化酶载体。

[0106] (3)先将步骤(2)得到的充分溶胀之后的水凝胶用美工刀切成约1mm*1mm*0.5mm的立方体状，置于真空干燥箱中，90℃干燥12h。待其充分干燥之后，再进一步用研钵将其研碎成细碎的粉末状。

[0107] 实施例7

[0108] 模板法制备磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯(SBMA)两性离子磁性水凝胶载体[0109] (1)在1.5ml离心管中加入300μl的超纯水，称取0.1g的四氧化三铁2置于离心管中，并向其中加入复配的表面活性剂：20μl Span+20μl Tween，在涡旋振荡器上振荡数秒，使四氧化三铁2分散，制成稳定的复配表面活性剂分散的四氧化三铁分散体系。

[0110] (2)称取0.008g N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(MBAA)，1.6g磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯(SBMA)单体，6μl 2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮，溶于1ml 1M氯化钠溶液中，上述组分质量百分含量如下：

[0111]

[0112] 将上述溶液中加入300μl的四氧化三铁分散液。将成胶前驱体混合溶液置于涡旋振荡器上混合均匀。

[0113] 采用模板法制备磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯(SBMA)两性离子磁性水凝胶载体，制备过程为：

[0114] 将含有四氧化三铁的混合溶液加入用载玻片和聚四氟乙烯垫片制作的浇注模板中，在37℃烘箱中加热30min，使磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯(SBMA)单体交联水凝胶基质1，包埋四氧化三铁2，得到厚度为0.5mm的包埋有四氧化三铁磁性粒子的两性离子固定化酶载体。

[0115] (3)先将步骤(2)得到的充分溶胀之后的水凝胶用美工刀切成约1mm*1mm*0.5mm的立方体状，置于真空干燥箱中，90℃干燥12h。待其充分干燥之后，再进一步用研钵将其研碎成细碎的粉末状。

[0116] 实施例8

[0117] 微流控法制备羧基甜菜碱丙烯酰胺(CBAA)两性离子磁性水凝胶载体[0118] (1)在1.5ml离心管中加入300μl的超纯水，称取0.1g的四氧化三铁2置于离心管中，并向其中加入复配的表面活性剂：20μl Span+20μl Tween，在涡旋振荡器上振荡数秒，使四氧化三铁2分散，制成稳定的复配表面活性剂分散的四氧化三铁分散体系。

[0119] (2)(2)称取0.006g N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(MBAA)，0.6g羧基甜菜碱丙烯酰胺(CBAA)单体，0.0016g过硫酸铵(APS)，2μl的四甲基乙二胺(TEMED)溶于1ml蒸馏水中，上述组分质量百分含量如下：

[0120]

[0121] 将上述溶液中加入300μl的四氧化三铁分散液。将成胶前驱体混合溶液置于涡旋振荡器上混合均匀。

[0122] 采用微流控方法制备羧基甜菜碱丙烯酰胺(CBAA)两性离子磁性水凝胶载体，制备过程为将含有四氧化三铁的混合溶液作为分散相，将玉米油(含有体积比为1％的四甲基乙二胺)作为连续相；分散相进样流量为10μL/min，连续相进样量为100μL/min，分别通过分散相进样孔和连续相进样孔通入微流控芯片。在微流控芯片出口处连接2m长的聚四氟乙烯管，浸泡于37℃水浴中，使羧基甜菜碱丙烯酰胺(CBAA)交联聚合形成水凝胶基质1，包埋四氧化三铁2，在出口处收集得到直径为700-1000μm的包埋有四氧化三铁磁性粒子的两性离子固定化酶载体。

[0123] 实施例9

[0124] 微流控法制备羧基甜菜碱甲基丙烯酰胺(CBMAA)两性离子磁性水凝胶载体[0125] (1)在1.5ml离心管中加入600μl的超纯水，称取0.2g的四氧化三铁2置于离心管中，并向其中加入复配的表面活性剂：20μl Span+20μl Tween，在涡旋振荡器上振荡数秒，使四氧化三铁2分散，制成稳定的复配表面活性剂分散的四氧化三铁分散体系。

[0126] (2)称取0.041g N,N’-二甲基丙烯酰胺胱氨酸，0.194g羧基甜菜碱甲基丙烯酰胺(CBMAA)单体，0.005g偶氮二异庚腈，溶于1.7ml蒸馏水中，上述组分的质量百分含量如下：

[0127]

[0128] 将上述溶液中加入600μl的四氧化三铁分散液。将成胶前驱体混合溶液置于涡旋振荡器上混合均匀。

[0129] 采用微流控方法制备羧基甜菜碱甲基丙烯酰胺(CBMAA)两性离子磁性水凝胶载体，制备过程为将含有四氧化三铁的混合溶液作为分散相，将玉米油(含有体积比为1％的四甲基乙二胺)作为连续相；分散相进样流量为10μL/min，连续相进样量为100μL/min，分别通过分散相进样孔和连续相进样孔通入微流控芯片。在微流控芯片出口处连接2m长的聚四氟乙烯管，浸泡于37℃水浴中，使羧基甜菜碱甲基丙烯酰胺(CBMAA)单体交联聚合形成水凝胶基质1，包埋四氧化三铁2，在出口处收集得到直径为700-1000μm的包埋有四氧化三铁磁性粒子的两性离子固定化酶载体。

[0130] 实施例10

[0131] 微流控法制备羧基甜菜碱甲基丙烯酸酯-1(CBMA-1)两性离子磁性水凝胶载体[0132] (1)在1.5ml离心管中加入300μl的超纯水，称取0.1g的四氧化三铁2置于离心管中，并向其中加入复配的表面活性剂：20μl Span+20μl Tween，在涡旋振荡器上振荡数秒，使四氧化三铁2分散，制成稳定的复配表面活性剂分散的四氧化三铁分散体系。

[0133] (2)取4.29μL聚乙二醇二缩水甘油醚，0.692g羧基甜菜碱甲基丙烯酸酯-1(CBMA-1)单体，0.001g过硫酸铵(APS)，2μl的四甲基乙二胺(TEMED)溶于1ml 1M氯化钠溶液中。上述组分的质量百分含量如下：

[0134]

[0135] 将上述溶液中加入300μl的四氧化三铁分散液。将成胶前驱体混合溶液置于涡旋振荡器上混合均匀。

[0136] 采用微流控方法制备羧基甜菜碱甲基丙烯酸酯-1(CBMA-1)两性离子磁性水凝胶载体，制备过程为将含有四氧化三铁的混合溶液作为分散相，将玉米油(含有体积比为1％的四甲基乙二胺)作为连续相；分散相进样流量为10μL/min，连续相进样量为100μL/min，分别通过分散相进样孔和连续相进样孔通入微流控芯片。在微流控芯片出口处连接2m长的聚四氟乙烯管，浸泡于37℃水浴中，使羧基甜菜碱甲基丙烯酸酯-1(CBMA-1)单体交联聚合形成水凝胶基质1，包埋四氧化三铁2，在出口处收集得到直径为700-1000μm的包埋有四氧化三铁磁性粒子的两性离子固定化酶载体。

[0137] 实施例11

[0138] 微流控法制备羧基甜菜碱甲基丙烯酸酯-2(CBMA-2)两性离子磁性水凝胶载体[0139] (1)在1.5ml离心管中加入300μl的超纯水，称取0.1g的四氧化三铁2置于离心管中，并向其中加入复配的表面活性剂：20μl Span+20μl Tween，在涡旋振荡器上振荡数秒，使四氧化三铁2分散，制成稳定的复配表面活性剂分散的四氧化三铁分散体系。

[0140] (2)取0.17μl三乙二醇二甲基丙烯酸酯，0.852g羧基甜菜碱甲基丙烯酸酯-2(CBMA-2)单体，6.46mg偶氮二异庚腈溶于1ml蒸馏水中，上述组分质量百分含量如下：

[0141]

[0142] 将上述溶液中加入300μl的四氧化三铁分散液。将成胶前驱体混合溶液置于涡旋振荡器上混合均匀。

[0143] 采用微流控方法制备羧基甜菜碱甲基丙烯酸酯-2(CBMA-2)两性离子磁性水凝胶载体，制备过程为将含有四氧化三铁的混合溶液作为分散相，将玉米油(含有体积比为1％的四甲基乙二胺)作为连续相；分散相进样流量为10μL/min，连续相进样量为100μL/min，分别通过分散相进样孔和连续相进样孔通入微流控芯片。在微流控芯片出口处连接2m长的聚四氟乙烯管，浸泡于37℃水浴中，使羧基甜菜碱甲基丙烯酸酯-2(CBMA-2)单体交联聚合形成水凝胶基质1，包埋四氧化三铁2，在出口处收集得到直径为700-1000μm的包埋有四氧化三铁磁性粒子的两性离子固定化酶载体。

[0144] 实施例12

[0145] 微流控法制备磺基甜菜碱丙烯酰胺(SBAA)两性离子磁性水凝胶载体[0146] (1)在1.5ml离心管中加入300μl的超纯水，称取0.1g的四氧化三铁2置于离心管中，并向其中加入复配的表面活性剂：20μl Span+20μl Tween，在涡旋振荡器上振荡数秒，使四氧化三铁2分散，制成稳定的复配表面活性剂分散的四氧化三铁分散体系。

[0147] (2)称取0.092g N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(MBAA)，0.7g磺基甜菜碱丙烯酰胺(SBAA)单体，5μl 2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮溶于1ml 1M氯化钠溶液中，上述组分质量百分含量如下：

[0148]

[0149] 将上述溶液中加入300μl的四氧化三铁分散液。将成胶前驱体混合溶液置于涡旋振荡器上混合均匀。

[0150] 采用微流控方法制备磺基甜菜碱丙烯酰胺(SBAA)两性离子磁性水凝胶载体，制备过程为将含有四氧化三铁的混合溶液作为分散相，将玉米油(含有体积比为1％的四甲基乙二胺)作为连续相；分散相进样流量为10μL/min，连续相进样量为100μL/min，分别通过分散相进样孔和连续相进样孔通入微流控芯片。在微流控芯片出口处连接2m长的聚四氟乙烯管，浸泡于37℃水浴中，使磺基甜菜碱丙烯酰胺(SBAA)单体交联聚合形成水凝胶基质1，包埋四氧化三铁2，在出口处收集得到直径为700-1000μm的包埋有四氧化三铁磁性粒子的两性离子固定化酶载体。

[0151] 实施例13

[0152] 微流控法制备磺基甜菜碱甲基丙烯酰胺(SBMAA)两性离子磁性水凝胶载体[0153] (1)在1.5ml离心管中加入300μl的超纯水，称取0.1g的四氧化三铁2置于离心管中，并向其中加入复配的表面活性剂：20μl Span+20μl Tween，在涡旋振荡器上振荡数秒，使四氧化三铁2分散，制成稳定的复配表面活性剂分散的四氧化三铁分散体系。

[0154] (2)称取0.012g N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(MBAA)，0.2989g磺基甜菜碱甲基丙烯酰胺(SBMAA)单体，3μl 2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮溶于0.5ml 1M氯化钠溶液中，上述组分质量百分含量如下：

[0155]

[0156] 将上述溶液中加入300μl的四氧化三铁分散液。将成胶前驱体混合溶液置于涡旋振荡器上混合均匀。

[0157] 采用微流控方法制备磺基甜菜碱甲基丙烯酰胺(SBMAA)两性离子磁性水凝胶载体，制备过程为将含有四氧化三铁的混合溶液作为分散相，将玉米油(含有体积比为1％的四甲基乙二胺)作为连续相；分散相进样流量为10μL/min，连续相进样量为100μL/min，分别通过分散相进样孔和连续相进样孔通入微流控芯片。在微流控芯片出口处连接2m长的聚四氟乙烯管，浸泡于37℃水浴中，使磺基甜菜碱甲基丙烯酰胺(SBMAA)单体交联聚合形成水凝胶基质1，包埋四氧化三铁2，在出口处收集得到直径为700-1000μm的包埋有四氧化三铁磁性粒子的两性离子固定化酶载体。

[0158] 实施例14

[0159] 微流控法制备磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯(SBMA)两性离子磁性水凝胶载体[0160] (1)在1.5ml离心管中加入300μl的超纯水，称取0.1g的四氧化三铁2，置于离心管中，并向其中加入复配的表面活性剂：20μl Span+20μl Tween，在涡旋振荡器上振荡数秒，使四氧化三铁2分散，制成稳定的复配表面活性剂分散的四氧化三铁分散体系。

[0161] (2)称取0.008g N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(MBAA)，1.6g磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯(SBMA)单体，6μl 2-羟基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮，溶于1ml 1M氯化钠溶液中，上述组分质量百分含量如下：

[0162]

[0163] 将上述溶液中加入300μl的四氧化三铁分散液。将成胶前驱体混合溶液置于涡旋振荡器上混合均匀。

[0164] 采用微流控方法制备磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯(SBMA)两性离子磁性水凝胶载体，制备过程为将含有四氧化三铁的混合溶液作为分散相，将玉米油(含有体积比为1％的四甲基乙二胺)作为连续相；分散相进样流量为10μL/min，连续相进样量为100μL/min，分别通过分散相进样孔和连续相进样孔通入微流控芯片。在微流控芯片出口处连接2m长的聚四氟乙烯管，浸泡于37℃水浴中，使磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯(SBMA)单体交联聚合形成水凝胶基质1，包埋四氧化三铁2，在出口处收集得到直径为700-1000μm的包埋有四氧化三铁磁性粒子的两性离子固定化酶载体。

[0165] 实施例15

[0166] 模板法制备羧基甜菜碱丙烯酰胺(CBAA)和羧基甜菜碱甲基丙烯酰胺(CBMAA)混合两性离子磁性水凝胶载体

[0167] (1)在1.5ml离心管中加入300μl的超纯水，称取0.1g的四氧化三铁2置于离心管中，并向其中加入复配的表面活性剂：20μl Span+20μl Tween，在涡旋振荡器上振荡数秒，使四氧化三铁2分散，制成稳定的复配表面活性剂分散的四氧化三铁分散体系。

[0168] (2)称取0.29g的羧基甜菜碱丙烯酰胺、0.31g的羧基甜菜碱甲基丙烯酰胺，6mg的N,N'-亚甲基双丙烯酰胺、0.16mg偶氮二异丁氰溶于1mL蒸馏水中，上述组分质量百分含量如下：

[0169]

[0170] 将上述溶液中加入300μl的四氧化三铁分散液。将成胶前驱体混合溶液置于涡旋振荡器上混合均匀。

[0171] 采用模板法制备羧基甜菜碱丙烯酰胺(CBAA)、羧基甜菜碱甲基丙烯酰胺(CBMAA)混合两性离子磁性水凝胶载体，制备过程为：

[0172] 将含有四氧化三铁的混合溶液加入用载玻片和聚四氟乙烯垫片制作的浇注模板中，在37℃烘箱中加热30min，使羧基甜菜碱丙烯酰胺(CBAA)、羧基甜菜碱甲基丙烯酰胺(CBMAA)混合单体交联形成水凝胶基质1，包埋四氧化三铁2，得到厚度为0.5mm的包埋有四氧化三铁磁性粒子的两性离子固定化酶载体。

[0173] (3)先将步骤(2)得到的充分溶胀之后的水凝胶用美工刀切成约1mm*1mm*0.5mm的立方体状，置于真空干燥箱中，90℃干燥12h。待其充分干燥之后，再进一步用研钵将其研碎成细碎的粉末状，备用。

[0174] 实施例16

[0175] 制备羧基甜菜碱丙烯酰胺(CBAA)和羧基甜菜碱甲基丙烯酰胺(CBMAA)混合两性离子磁性水凝胶载体

[0176] (1)在1.5ml离心管中加入300μl的超纯水，称取0.1g的四氧化三铁2置于离心管中，并向其中加入复配的表面活性剂：20μl Span+20μl Tween，在涡旋振荡器上振荡数秒，使四氧化三铁2分散，制成稳定的复配表面活性剂分散的四氧化三铁分散体系。

[0177] (2)称取0.29g的羧基甜菜碱丙烯酰胺、0.31g的羧基甜菜碱甲基丙烯酰胺，6mg的N,N'-亚甲基双丙烯酰胺、0.16mg偶氮二异丁氰溶于1mL蒸馏水中，上述组分质量百分含量如下：

[0178]

[0179]

[0180] 将上述溶液中加入300μl的四氧化三铁分散液。将成胶前驱体混合溶液置于涡旋振荡器上混合均匀。

[0181] 采用微流控方法制备羧基甜菜碱丙烯酰胺(CBAA)，羧基甜菜碱甲基丙烯酰胺(CBMAA)混合两性离子磁性水凝胶载体，制备过程为将含有四氧化三铁的混合溶液作为分散相，将玉米油(含有体积比为1％的四甲基乙二胺)作为连续相；分散相进样流量为10μL/min，连续相进样量为100μL/min，分别通过分散相进样孔和连续相进样孔通入微流控芯片。在微流控芯片出口处连接2m长的聚四氟乙烯管，浸泡于37℃水浴中，使羧基甜菜碱丙烯酸酰胺(CBAA)，羧基甜菜碱甲基丙烯酰胺(CBMAA)混合单体交联聚合形成水凝胶基质1，包埋四氧化三铁2，在出口处收集得到直径为700-1000μm的包埋有四氧化三铁磁性粒子的两性离子固定化酶载体。

[0182] 实施例17

[0183] 固定脲酶

[0184] (1)酶4溶液的制备：称取5mg的脲酶粉末，溶解于10ml的0.01M pH7.2的PBS水溶液中，得到澄清的脲酶溶液(浓度500μg/ml)。

[0185] (2)载体的预处理：将实施例1-7、15中得到的粉末，置于20ml的取样瓶中，加入2ml的0.01M PBS缓冲液，使其充分溶胀；约1h之后，加入1ml 0.5％戊二醛3水溶液，于摇床中37℃，220rpm处理30min。结束后，用磁铁吸引分离载体，去除上清。再次将载体置于烘箱中，60℃干燥12h，以除去未反应的戊二醛3。或将实施例8-14、16得到的微球，置于20ml的取样瓶中，加入2ml的0.01M PBS缓冲液，使其充分溶胀；约1h之后，加入1ml 0.5％戊二醛3水溶液，于摇床中37℃，220rpm处理30min。结束后，用磁铁吸引分离载体，去除上清。

[0186] (3)酶4的固定化：称取步骤(2)制备的干燥载体20mg或微球200μL，加入步骤(1)中制备的脲酶溶液4ml，在摇床中37℃，220rpm处理4h。结束之后，用磁铁分离固定化脲酶。

[0187] 实施例18

[0188] 固定辣根过氧化物酶

[0189] (1)酶4溶液的制备：称取5mg的辣根过氧化物酶粉末，溶解于10ml的0.01M pH7.2的PBS水溶液中，得到棕黄色的辣根过氧化物酶溶液(浓度500μg/ml)。

[0190] (2)载体的预处理：将实施例1-7、15中得到的粉末，置于20ml的取样瓶中，加入2ml的0.01M PBS缓冲液，使其充分溶胀；约1h之后，加入1ml 0.5％戊二醛3水溶液，于摇床中37℃，220rpm处理30min。结束后，用磁铁吸引分离载体，去除上清。再次将载体置于烘箱中，60℃干燥12h，以除去未反应的戊二醛3。或将实施例8-14、16得到的微球，置于20ml的取样瓶中，加入2ml的0.01M PBS缓冲液，使其充分溶胀；约1h之后，加入1ml 0.5％戊二醛3水溶液，于摇床中37℃，220rpm处理30min。结束后，用磁铁吸引分离载体，去除上清。

[0191] (3)酶4的固定化：称取步骤(2)制备的干燥载体20mg或微球200μL，加入步骤(1)中制备的辣根过氧化物酶溶液4ml，在摇床中37℃，220rpm处理4h。结束之后，用磁铁分离固定化辣根过氧化物酶。

[0192] 实施例19

[0193] 固定脂肪酶

[0194] (1)酶4溶液的制备：称取50mg的脂肪酶粉末(上海源叶公司)溶解于100ml的0.01M pH7.2的PBS水溶液中，1000rpm磁力搅拌1h。结束之后，9500rpm离心10min除去少许未溶解的杂质，并将上清用化学纯分离滤纸过滤，得到澄清的脂肪酶溶液。

[0195] (2)载体的预处理：将实施例1-7、15中得到的粉末，置于20ml的取样瓶中，加入2ml的0.01M PBS缓冲液，使其充分溶胀；约1h之后，加入1ml 0.5％戊二醛3水溶液，于摇床中37℃，220rpm处理30min。结束后，用磁铁吸引分离载体，去除上清。再次将载体置于烘箱中，60℃干燥12h，以除去未反应的戊二醛3。或将实施例8-14、16得到的微球，置于20ml的取样瓶中，加入2ml的0.01M PBS缓冲液，使其充分溶胀；约1h之后，加入1ml 0.5％戊二醛3水溶液，于摇床中37℃，220rpm处理30min。结束后，用磁铁吸引分离载体，去除上清。

[0196] (3)酶4的固定化：称取步骤(2)制备的干燥载体20mg或微球200μL，加入步骤(1)中制备的脂肪酶溶液4ml，在摇床中37℃，220rpm处理4h。结束之后，用磁铁分离固定化脂肪酶。

[0197] 实施例20

[0198] 固定条件优化

[0199] (1)戊二醛3处理时间优化：用一定浓度的戊二醛3对载体进行处理不同时间(0h，0.5h，2.5h，4.5h，6.5h，8.5h)，测定装载量，确定最优的戊二醛处理时间为0.5h。

[0200] (2)戊二醛3浓度优化：选取不同浓度(0％，1％，2.5％，5％，15％，25％)的戊二醛3对载体进行处理，测定装载量，确定最优的戊二醛3浓度为1％。

[0201] (3)固定时间优化：将戊二醛3处理并干燥后的载体，加入一定体积一定浓度的酶4溶液，固定不同时间(2h，4h，6h，8h，10h)，测定装载量，确定最优的固定时间4h。

[0202] (4)给酶4量优化：固定20mg载体不变，分别加入不同质量的酶4(2mg，3mg，4mg，5mg，通过控制加入酶溶液的体积控制)，测定装载量和酶活力，确定最佳的给酶量1：10(即酶/载体质量之比)。

[0203] 实施例21

[0204] 脂肪酶酶活性测定

[0205] (1)绘制标准曲线：

[0206] 1)称取0.03g pNP溶于1000ml无水乙醇中，制成0.03g/L浓度的pNP溶液A；

[0207] 2)从溶液A中吸取0，200，300，400，600，800μl，用1M氢氧化钠溶液稀释至4ml；

[0208] 3)以1M氢氧化钠为空白对照，测OD410，以pNP浓度为横坐标，相应的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

[0209] (2)测定酶活的反应步骤：

[0210] 将固定酶后的载体加入到9ml磷酸盐缓冲液(0.01M pH＝7.2)，再加入1ml pNPP溶液(0.01M，溶剂为无水乙醇)，在一定温度下水浴反应5min，磁场分离，将反应液倒入10ml氢氧化钠溶液(1M)中终止反应。将混合液过滤，吸取澄清液体稀释5倍后在410nm处进行吸光度测定，将载体用PBS反复冲洗并用磁铁分离，进行下一次反应。根据标准曲线，计算得到酶活性。

[0211] 实施例22

[0212] 固定化脂肪酶和游离脂肪酶最适温度和最适pH测定

[0213] (1)最适温度：取一定质量且等量的游离酶和固定化酶(20mg载体所固定的酶量)，在不同温度(25℃，35℃，45℃，55℃，65℃，75℃)下测定酶活力。经测定，固定化酶的最适温度为45℃，游离酶最适温度为35℃，并且游离酶活性受温度影响较大，变化幅度较大，固定酶的活性则较为稳定，随温度变化较小。

[0214] (2)最适pH：取一定质量且等量的游离酶和固定化酶(20mg载体所固定的酶量)，在不同pH(4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0)下测定酶活力。经测定，固定化酶和游离酶的最适pH值均为7。说明固定过程并没有改变酶的最适pH值，但是固定化脂肪酶的活性随pH变化幅度远小于游离酶，稳定性得到提高。

[0215] 实施例23

[0216] 脂肪酶温度稳定性测试

[0217] (1)固定化酶：将固定好的酶的载体(20mg载体)分散在9ml 0.01M PBS溶液中，放置在60℃烘箱中。每隔30min取出三组(三个平行数据)，测定其酶活力。将未放入烘箱即测定的酶活数据定为100％，150min之后，固定化酶仍保留了其最初活性的50％。

[0218] (2)游离酶

[0219] 在1ml上述制备的酶溶液中，加入8ml 0.01M PBS溶液，放置在60℃烘箱中。每隔30min取出三组(三个平行数据)，测定其酶活力。将未放入烘箱即测定的酶活数据定为
100％，150min之后，游离酶保留了其最初活性的18％。

[0220] 实施例24

[0221] 固定化脂肪酶循环稳定性测试

[0222] 在一定温度(37℃)、一定pH(7.0)下测定测定酶活力，每次测定结束后用磁铁分离，并用PBS冲洗载体，再进行下一轮反应。记录每次循环之后酶的残留活力。将酶活最高的数据定为100％(即0次循环的数据)，7个循环之后，固定化酶仍保留了其最初活性的65％。

[0223] 实施例25

[0224] 固定化脂肪酶动力学参数Km和Vmax测定

[0225] 配制1mM，2.5mM，5mM，10mM，12.5mM，25mM的pNPP溶液，测定25μg的固定/游离酶在不同浓度下的反应初速度(限定反应时间为5min)，以1/V为纵坐标，1/S为横坐标，绘制散点图，并对其进行线性拟合，得到截距和斜率数据。结果显示，固定化酶的Km约为游离酶的54％，说明固定化酶比游离酶对底物的亲和力得到很大的提高。固定化酶的Vmax/Km约为游离酶的1.5倍，即固定化酶的催化效率也比游离酶有了显著的提高。