砂藓蛋白磷酸酶2C基因RcPP2C及其编码蛋白和应用

摘要

砂藓蛋白磷酸酶2C基因RcPP2C及其编码蛋白和应用，它涉及一种砂藓蛋白磷酸酶2C基因RcPP2C及其编码蛋白和应用。其目的在于提供一种砂藓蛋白磷酸酶2C基因RcPP2C及其编码蛋白和应用。砂藓蛋白磷酸酶2C基因RcPP2C的序列如序列表Seq ID No：1所示，氨基酸序列如序列表Seq ID No：2所示，该基因应用在提高植物抗旱性上。RcPP2C基因是与细胞信号转导通路中抗旱相关基因，将其转入植株中可提高其抗旱性，为培育耐旱的植物新品种，增强植物的抗逆性奠定基础，具有重要意义。本发明应用于分子育种领域。

权利要求

1.砂藓蛋白磷酸酶2C基因RcPP2C，其特征在于该基因的核苷酸序列如序列表中Seq ID No：1所示。

2.根据权利要求1所述的砂藓蛋白磷酸酶2C基因RcPP2C，其特征在于该基因编码的蛋白的氨基酸序列如序列表中Seq ID No：2所示。

3.如权利要求1所述的砂藓蛋白磷酸酶2C基因RcPP2C的应用，其特征在于它是在提高植物复水抗旱性上的应用。

说明书

砂藓蛋白磷酸酶2C基因RcPP2C及其编码蛋白和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种基因及其编码蛋白和应用，尤其涉及砂藓蛋白磷酸酶2C基因RcPP2C及其编码蛋白和应用。

背景技术

[0002] 干旱、高盐及低温等缺水胁迫是最主要的影响植物生长和发育的环境胁迫因素。水资源短缺已经成制约为全世界农业发展的一个重要的不利条件。为了解决这个问题，人们尝试着从资源丰富的野生植物基因库中找到耐旱基因，利用先进的生物技术培育出耐盐、耐旱、耐低温的植物新品种，增强植物的抗逆性，从而提高经济价值。因此，如何提高植物的抗逆性，成为各国科学家的研究热点。

[0003] 信号通路是指细胞要发生某种反应时，信号从细胞外到细胞内传递了一种信息，细胞要根据这种信息来做出反应，植物体适应环境的一系列反应都是通过信号通路完成。蛋白磷酸酶2C(Protein Phosphatase 2C，PP2C)是信号通路中的重要基因，是一类依赖于
2+ 2+
Mg 或Mn 丝氨酸/苏氨酸残基蛋白磷酸酶，没有调控亚基，以单体形式存在。PP2Cs在古细菌，细菌，真菌，植物和动物均发现，PP2Cs的功能主要涉及到应激信号。PP2C的催化区域含有11个保守的基序，植物PP2Cs具有其独特的结构模式，植物中多数PP2C类磷酸酶C-端有保守的催化区域，而N-端则是保守性不强、长度不一的延伸区域，这些延伸区域含有与胞内信号相关的序列包括跨膜区域和激酶互作区域等，从而赋予PP2C不同的功能。在高等植物，如拟南芥和水稻，含有80到90个PP2Cs，分别属于十个或更多的亚群。A亚群的PP2C参与植物的脱落酸信号，第一个植物PP2C是在abi1突变体发现的，表现为对ABA不敏感。ABI1与其同源的ABI2调控ABA响应，包括蒸腾作用的调节、植物生长，种子萌发等。而植物激素ABA在响应非生物胁迫中起着重要作用。B亚群的PP2C参与MAPK活性调控，包括在拟南芥中发现的AP2C和在苜蓿中发现的MP2C。AP2C1-AP2C4这四个激酶作为MAPK磷酸酶在蛋白N-端有一个特别激酶相互作用的模体，其中的AP2C1和AP2C3参与植物的天然免疫及气孔通路变化。MP2C是从苜蓿cDNA文库中筛选得到的PP2C类蛋白参与MAPK信号途径，与SIMK(stress induced MAPK)相互作用，使SIMK去磷酸化而失活，在SIKM信号途径中起负调控作用，而MAPK级联途径参与响应损伤、低温、干旱、盐碱、渗透压和活性氧等逆境胁迫。C亚群包括磷酸酶POL和PLL，POL/PLL1双突变体的表型，表明POL和PLL1控制芽和根的分生组织以及胚的形成，拟南芥POL/PLL同源基因XB15参与植物的天然免疫，缺乏或低表达XB15导致自发的细胞死亡。E亚群PP2C的代表为AtLG03590，主要调控保卫细胞张度并参与干旱、高温胁迫信号通路。

[0004] 随着分子生物学的快速发展，信号转导相关基因已在水稻、玉米、烟草等植物中进行了比较深入的研究，但在苔藓植物中相关的研究很少。砂藓(Racomitrium canescens)属紫萼藓科(Grimmiaceae)砂藓属(Racomitrium)，植物体挺硬，有时粗壮，常呈疏松成片丛生，存在于低海拔地区的岩面、岩面薄土和沙石地面上，在东亚分布较广。植物体经长时间的干旱，复水后仍能马上恢复新鲜绿色，继续进行生长，具有很强的再生能力。苔藓植物具有世代交替现象，单倍体的配子体世代占优势，几乎所有的细胞都可以再生为原丝体组织，有利于高通量规模化培养、突变体筛选和遗传性状的直接分析，如小立碗藓，是目前发现的唯一具有高频率同源重组特性的植物。因此，从砂藓中克隆与细胞信号转导通路中抗旱相关基因，初步研究其潜在的生物学功能，可为苔藓植物的抗旱机制研究奠定基础，具有重要意义。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供一种砂藓蛋白磷酸酶2C基因RcPP2C及其编码蛋白和应用。

[0006] 本发明砂藓蛋白磷酸酶2C基因RcPP2C的核苷酸序列如序列表Seq ID No：1所示。

[0007] 本发明编码砂藓蛋白磷酸酶2C基因RcPP2C蛋白的氨基酸序列如序列表Seq ID No：2所示。

[0008] 本发明砂藓蛋白磷酸酶2C基因RcPP2C基因的应用是指在提高植物抗旱性上的应用。

[0009] 本发明的有益效果是：

[0010] 本发明提供的砂藓蛋白磷酸酶2C基因RcPP2C来自砂藓。以砂藓为实验材料，克隆出与抗旱相关的水通道蛋白基因，并进行转基因，已获得抗旱转基因植株，可为植物基因工程育种提供优良基因资源，同时为改良植物的抗逆性提供物质基础。

附图说明

[0011] 图1为实施例中砂藓总RNA电泳图；

[0012] 图2为实施例中RcPP2C基因的克隆结果图；

[0013] 图3为实施例中RcPP2C基因复水的表达分析结果图；

[0014] 图4为实施例中RcPP2C基因干旱条件的表达分析结果图；

[0015] 图5为实施例中重组质粒P-RcPP2C双酶切结果图；

[0016] 图6为实施例中重组质粒PRI-RcPP2C双酶切结果图；

[0017] 图7为实施例中烟草再生体系建立过程中的愈伤组织；

[0018] 图8为实施例中烟草再生体系建立过程中的转基因烟草幼芽；

[0019] 图9为实施例中烟草再生体系建立过程中的转基因烟草生根培养；

[0020] 图10为实施例中烟草再生体系建立过程中的转基因烟草植株；

[0021] 图11为实施例中转基因烟草T1代PCR结果图；其中，M：Marker；1：转基因植株；2：非转基因植株；

[0022] 图12为实施例中转基因烟草干旱胁迫前植株表型图；

[0023] 图13为实施例中转基因烟草干旱胁迫15d植株表型图；

[0024] 图14为实施例中转基因烟草复水后植株表型图。

具体实施方式

[0025] 具体实施方式一：本实施方式砂藓蛋白磷酸酶2C基因RcPP2C的核苷酸序列如序列表Seq ID No：1所示。

[0026] 本实施方式提供的砂藓蛋白磷酸酶2C基因RcPP2C来自砂藓。以砂藓为实验材料，克隆出与抗旱相关的水通道蛋白基因，并进行转基因，已获得抗旱转基因植株，可为植物基因工程育种提供优良基因资源，同时为改良植物的抗逆性提供物质基础。

[0027] 具体实施方式二：本实施方式编码砂藓蛋白磷酸酶2C基因RcPP2C蛋白的氨基酸序列如序列表Seq ID No：2所示。

[0028] 具体实施方式三：本实施方式砂藓蛋白磷酸酶2C基因RcPP2C基因的应用是指在提高植物抗旱性上的应用。

[0029] 通过以下实验验证本发明的效果：

[0030] 实施例1：

[0031] 一、RcPP2C基因的克隆

[0032] 1、以砂藓为材料，采用改良的SDS法提取总RNA。

[0033] (1)取0.3g砂藓放入预冷的研钵中，加入少量的PVP和抗坏血酸，在液氮中研磨，将研磨的粉末转入1.5mL离心管中，加入750μL 2％SDS，Tris酚和氯仿各350μL，剧烈震荡10min，4℃，12 000r/min离心10min；

[0034] (2)取上清加Tris酚和氯仿各350μL，剧烈震荡10min，4℃12 000r/min离心10min；

[0035] (3)重复(2)一次；

[0036] (4)取上清加入等体积氯仿，剧烈震荡10min，4℃，12 000r/min离心10min；

[0037] (5)取上清加入1/2体积的10mol/L LiCl和1/2体积的75％乙醇，放入-80℃冰箱沉降1h；

[0038] (6)4℃12 000r/min离心20min，弃上清加入75％乙醇，4℃12 000r/min离心10min；

[0039] (7)弃上清，冰浴晾干，加入适量0.1％DEPC水，1％琼脂糖凝胶电泳检测。

[0040] 总RNA提取结果如图1所示。

[0041] 2、总RNA的纯化

[0042] (1)在灭菌的离心管中加入以下成分：

[0043]

[0044] (2)37℃水浴30min后，加入150μL 0.1％DEPC和200μL CI(氯仿：异戊醇＝24:1)，震荡10min，4℃12 000r/min离心10min；

[0045] (3)取上清，加400μL无水乙醇-80℃冰箱沉降2h；

[0046] (4)4℃，12 000r/min离心20min，弃上清加入300μL 75％乙醇，4℃，12 000r/min离心5min；

[0047] (5)弃上清，冰浴晾干，加入20μL 0.1％DEPC，电泳检测。

[0048] 3、cDNA第一链的合成

[0049] (1)2μg总RNA中加入1μg Oligo(dT)15 Primer，70℃，5min后，立即于冰上冷却；按以下顺序在复性的引物/模板管(200μL离心管)中加入下列组分：

[0050]

[0051] 加无核酸酶ddH2O补齐至25μL

[0052] (2)轻弹离心管混合溶液，-80℃冰箱保存备用。

[0053] 4、目的基因克隆

[0054] 以砂藓cDNA为模板，PCR反应体系及反应程序如下：

[0055]

[0056]

[0057] RcPP2CP-F：5′ACGCGTCGACGCAATGGGCGTTTTCAGCG3′

[0058] RcPP2CP-R：5′CGGGATCCCGACCCCACACTCTGTAGTCTATCCACC3′

[0059] 反应程序为：

[0060]

[0061] 1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示。

[0062] 将回收得到的PCR产物与pMD-19simple T载体进行连接，进行大肠杆菌感受态细胞转化，挑选阳性克隆进行测序，得到全长为1389bp的序列，其核苷酸序列如序列表中的SEQ ID No：1所示。编码具有序列表中SEQ ID NO：2的氨基酸序列的蛋白质。通过亲/疏水性分析，RcPP2C蛋白为亲水性蛋白；通过跨膜结构域分析，RcPP2C蛋白不含编码区；信号肽预测显示该蛋白没有信号肽位点，不是分泌型蛋白质类。蛋白结构域预测显示，RcPP2C蛋白含有PP2C-SIG结构域，属于丝氨酸/苏氨酸磷酸酶2C家族。这些特点符合蛋白磷酸酶2C家族的基本特征，初步确定获得了砂藓蛋白磷酸酶2C基因家族的新成员，命名为RcPP2C。

[0063] 二、RcPP2C基因在不同处理下的表达分析

[0064] 1、取材：将采集于黑龙江省五大连池市风景区的砂藓，分别进行1d、2d、3d、4d、5d的复水处理并取材；将正常生长材料进行硅胶快速干燥处理，处理时间分别为10min、20min、30min、1h、4h、8h、1d、2d，处理后和存放两年的标本一起进行取样，以恢复正常生长的材料为对照。提取总RNA，利用荧光定量PCR法分析RcPP2C基因在不同处理时间的表达量。
所用引物序列为：

[0065] RcPP2C-F:5′-ACTGGTTCCTTCGGCACAT-3′

[0066] RCPP2C-R:5′-GACATACCTCCCTGCTCTGC-3′

[0067] 2、反应体系为：SsoFast EvaGreen supermix(2×)10μL，引物各1.0μL(10μmol/L)，模板cDNA 1ng，ddH2O补至20μL。反应程序为：95℃30s；95℃5s，58℃10s，72℃30s，35个循环。所用内参基因为18S，引物序列为：

[0068] 18s rRNA-F:5′-TTGACGGAAGGGCACCA-3′

[0069] 18s rRNA-R:5′-ACCACCACCCATAGAATCAAGAA-3′

[0070] 3、检测结果如图3所示。可见本发明的基因在不同处理时间中均有表达。该基因在复水过程中，在3d时达到最大值，是对照的11.5倍(图3)。快速干旱过程中，处理8h达到最大值，是对照的8倍；干旱时间的延长基因表达量呈下降趋势，长期干旱的材料是对照的1.8倍(图4)。干旱和复水过程均有差异性表达，说明RcPP2C可能参与砂藓的干旱胁迫应答。

[0071] 三、含有目的基因RcPP2C表达载体的构建

[0072] 1、提取含有RcPP2C基因的T载体质粒，用Sal I和BamH I限制性内切酶进行双酶切，获得带有粘性末端RcPP2C基因的cDNA片段，结果如图5所示。同时，将表达载体PRI101-AN质粒进行双酶切。

[0073] 克隆载体和表达载体双酶切反应体系如表1所示。

[0074] 表1

[0075]

[0076] 四、连接转化至根癌农杆菌EHA105

[0077] 1、将克隆载体和表达载体酶切产物用T4DNA Ligase连接，命名为PRI-RcPP2C。连接反应体系如表2所示。

[0078] 表2

[0079]

[0080] 混合均匀后离心，16℃连接过夜。

[0081] 连接后进行重组质粒的双酶切鉴定，结果如图6所示，显示出现两条条带，大片段为载体小片段为目的片段，说明重组质粒鉴定成功。

[0082] 2、采用冻融法转化根癌农杆菌。

[0083] (1)取10μL重组质粒，加入根癌农杆菌EHA105感受态细胞中，冰浴30min；

[0084] (2)液氮速冻5min后，立即置于37℃水浴5min；

[0085] (3)在无菌操作台中加入不含抗生素的YEB液体培养基800μL，28℃180rpm振荡培养4h；

[0086] (4)5 000rpm离心5min，在无菌操作台中收集菌体，加入100μL YEB液体培养基重悬菌体；

[0087] (5)将菌液均匀涂布于含有(Rif、Kana 50μg/mL)的YEB固体培养基上，28℃培养约2～4d；

[0088] (6)提取质粒，以菌液为模板使用特异性引物进行PCR鉴定。

[0089] 四、转基因烟草的获得

[0090] 1、农杆菌介导法转化烟草

[0091] (1)烟草种子消毒：75％乙醇洗1min，2％次氯酸洗8min，无菌水洗5～6次；

[0092] (2)无菌苗的培养：消毒后的种子接种在MS培养基上培养，获得无菌苗；

[0093] (3)含有目的片段的农杆菌菌液在侵染前需进行二次活化，一次活化时将菌液按照1:100比例加入到含相应抗生素(Rif、Kana、50μg/mL)的YEB液体培养基中的YEB液体培养基中，28℃，180rpm振荡培养约16h左右，二次活化时取一次活化的菌液按一定比例，加入到含相应抗生素(Rif、Kana、50μg/mL)的YEB液体培养基中，28℃，180rpm振荡培养至OD600达0.5；

[0094] (4)取二次活化的菌液，5 000rpm离心10min，收集菌体，用MS液体培养基洗涤菌体，并将稀释到OD600至0.1的菌液，得到侵染液；

[0095] (5)叶盘法转化烟草：在无菌操作台中，取大约8mm左右的烟草叶盘12～15片，放入小锥形瓶中，倒入侵染液，轻轻摇晃，10min后取出叶片，放在无菌滤纸上，吸去多余菌液后，放入MS(加终浓度2.0μg/mL 6-BA和终浓度0.5μg/mL NAA)固体培养基中，暗培养2d后，用无菌水及MS液体培养基清洗，吸去多余菌液，转接到含有500μg/mL头孢青霉素和50μg/mL卡那霉素的MS(加终浓度2.0μg/mL 6-BA和终浓度0.5μg/mLNAA)固体培养基上，每10d左右继代一次。

[0096] (6)约15d会分化出愈伤组织，约一个月以后愈伤组织上开始有不定芽形成，待不定芽长到1～2cm时候接到生根培养基上进行生根培养，生根的转基因苗长到7～8cm时将苗移栽到灭过菌的土壤中。

[0097] (7)室内常温培养至开花接种，所得种子为T0代烟草种子。

[0098] 结果如图7～10所示。其中图7为愈伤组织，图8为转基因烟草幼芽，图9为转基因烟草生根培养，图10为转基因烟草植株。

[0099] 2、T0代烟草幼苗的培养

[0100] 选取T0代转基因烟草与野生型烟草种子，先用75％酒精消毒5min，再用10％的NaCl消毒10min，然后无菌水洗5-7遍。将消毒好的种子分别平铺于1/2MS(含50mg/L Kan)和1/2MS培养基中获得T1代植株。

[0101] 3、T1代转基因烟草的筛选及鉴定

[0102] T0代烟草种子在含有卡那的培养基中若能正常生长则是转基因植株，反之逐渐白化死亡。选取野生型与转基因植株长势一致的T1代植株，将其移至土壤中继续培养，等烟草长势稳定后，用CTAB法提取DNA，进行PCR扩增。在转基因T1代植株中可以检测到RcPP2C基因的表达，而在野生型烟草中不表达。结果如图11所示(1：转基因植株；2：非转基因植株)。对野生型和转基因烟草进行干旱胁迫，观察其表型变化。结果如图11～13所示。干旱胁迫前，各株系烟草植株没有明显的表型差异，生长发育正常，叶色、株高等方面差别不大(图12)，但在干旱胁迫15d后，野生型植株萎蔫严重受，转基因植株干旱影响相对较小(图13)，复水后转基因植株恢复正常生长而野生型并没有恢复(图14)。

[0103] 由此可知，RcPP2C基因是与细胞信号转导通路中抗旱相关基因，将其转入植株中可提高其抗旱性，为培育耐旱的植物新品种，增强植物的抗逆性奠定基础，具有重要意义。