一株产中性生淀粉酶的阿氏芽孢杆菌

摘要

本发明公开了一株产中性生淀粉酶的阿氏芽孢杆菌，属于生物工程技术领域。所述高产中性生淀粉酶的野生芽孢杆菌菌株筛选自广西木薯田浅层土壤。本发明所述菌株保藏在湖北省武汉市武汉大学中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 2017320。该菌株培养条件简便，发酵周期短,酶活力高；所产生淀粉酶为中温、中性酶，最适温度和最适pH分布为50℃和7.0，水解生淀粉能力强，产物以麦芽糖为主。在淀粉糖、发酵、食品和饲料等工业领域具有广阔的应用前景。

权利要求

1.一株阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)GEL-09，已于2017年6月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No:M 2017320，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。

2.一种生淀粉酶的生产方法，其特征在于，将权利要求1所述的阿氏芽孢杆菌接种至培养基中，于33～37℃培养48～120h。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述培养基的碳源包括木薯淀粉、玉米淀粉、马铃薯淀粉、麦芽糖中的至少一种。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，氮源包括酵母粉、蛋白胨、玉米浆、牛肉膏或豆饼粉。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，控制培养基的初始pH为7.0～7.5。

6.一种组合物，其特征在于，所述组合物含有权利要求1所述的阿氏芽孢杆菌GEL-09。

7.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，含有权利要求1所述的阿氏芽孢杆菌GEL-09生产的生淀粉酶。

8.一种生物制剂，其特征在于，含有权利要求1所述的阿氏芽孢杆菌GEL-09细胞。

9.权利要求1所述的阿氏芽孢杆菌GEL-09在食品领域制备淀粉糖或发酵食品中的应用。

10.权利要求1所述的阿氏芽孢杆菌GEL-09在制备饲料方面的应用。

说明书

一株产中性生淀粉酶的阿氏芽孢杆菌

技术领域

[0001] 本发明涉及一株产中性生淀粉酶的阿氏芽孢杆菌，属于生物工程技术领域。

背景技术

[0002] 淀粉是自然界储量最丰富的碳水化合物之一，不仅是人和动物的主要营养来源，还是重要的工业原料。淀粉既能用来生产葡萄糖、麦芽糖等淀粉糖，也能用来生产氨基酸、有机酸、白酒、啤酒、酒精、食醋等发酵产品。淀粉是以葡萄糖为单元组成的多糖，在工业应用中，首先需要将其酶解成单糖或寡糖。根据用于酶解的淀粉底物是否经过糊化，酶解工艺一般分为两类：高温蒸煮工艺和生料酶解工艺。高温蒸煮工艺中，淀粉首先需要经过高温蒸煮(95-115℃，甚至更高温度)进行糊化和液化，以利于后续酶解糖化的进行。该工艺需要消耗大量的能源，以酒精发酵为例，高温蒸煮的能耗超过整个酒精生产过程所耗能源的三分之一。

[0003] 与高温蒸煮工艺不同，生料酶解(生料发酵)是指将未经蒸煮或处理的生料淀粉颗粒用生淀粉酶直接进行糖化，该过程无需淀粉糊化工序，因此可以降低能源消耗、节省投资和运行成本，在酒精发酵、白酒、黄酒和食醋的生料酿造工业中具有广阔的应用前景。近年来备受国内外学者的关注。

[0004] 生料酶解的关键酶制剂是生淀粉酶，该类酶可以水解生淀粉颗粒。目前，生淀粉酶来源主要有两类。第一类来源于真菌，如Aspergillus niger、Rhizopus oryzae、Aspergillus kawachi等。该类生淀粉酶是由真菌α-淀粉酶和真菌糖化酶复配而成的复合酶，最适pH一般为4.5-5.0左右。二者具有互补和增效活性，可以在温和条件下破坏淀粉颗粒的晶体结构。其中，糖化酶通过外切作用能够在淀粉表面形成无数个小孔，并使孔洞变深，而α-淀粉酶通过内切作用进一步拓宽淀粉孔洞。第二类生淀粉酶来源于细菌。研究发现，某些细菌(如Bacillus cirulans、Paenibacilluspolymyxa)，可以产生特殊的淀粉酶，最适pH一般为7.0左右。这类淀粉酶在无其他酶的协助的情况下，就可以水解生淀粉颗粒，在淀粉颗粒上形成孔洞，生成多孔淀粉和还原糖。

[0005] 在工业发酵中，细菌被广泛用于L-乳酸、谷氨酸、赖氨酸、大宗酶制剂等产品的发酵生产。目前，这些大宗发酵产品的生产一般采用高温蒸煮，导致耗能大、成本高；如果能够利用合适的生淀粉酶与细菌协同作用，进行边糖化边发酵，将进一步降低能耗和成本，提高产品附加值。常见的工业用细菌菌株有乳酸菌、芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌等，它们的最适发酵pH一般为中性，在pH 7.0左右。然而，已有的生淀粉酶主要是来自真菌的酸性酶，最适pH一般为4.5-5.0左右，与细菌最适发酵pH相差较大。将细菌与来自真菌的酸性生淀粉酶同步糖化发酵，需要在pH控制上做出妥协，pH一般控制在5.5-6.0。该pH不是任何一方的最佳条件，因此会造成酶活力损失或者菌种活力不够，导致酶解或发酵效果不佳。如何克服现有技术的不足，加快开发高活性中性生淀粉酶已成为当今本领域中亟待解决的难题之一。

发明内容

[0006] 为了解决上述问题，本发明的第一个目的是提供一株阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)GEL-09，已于2017年6月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No:M2017320，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。

[0007] 本发明的第二个目的是提供一种生淀粉酶的生产方法，所述方法是将所述阿氏芽孢杆菌接种至培养基中，于33～37℃培养48～120h。

[0008] 在本发明的一种实施方式中，所述培养基的碳源包括木薯淀粉、玉米淀粉、马铃薯淀粉、麦芽糖中的至少一种，氮源包括有机氮源。

[0009] 在本发明的一种实施方式中，所述有机氮源包括酵母粉、蛋白胨、玉米浆、牛肉膏、或豆饼粉。

[0010] 在本发明的一种实施方式中，氮源还包括无机氮源。

[0011] 在本发明的一种实施方式中，所述玉米淀粉的浓度为2～5g/L。

[0012] 在本发明的一种实施方式中，所述方法是将阿氏芽孢杆菌接入种子培养基，在37℃培养12h作为种子，以2.5％(V/V)接种量，将种子接种到发酵培养基中，培养温度为35,℃，摇床转速为200r/min，振荡培养。

[0013] 在本发明的一种实施方式中，所述方法控制发酵培养基的初始pH为7.0～7.5。

[0014] 在本发明的一种实施方式中，所述方法控制发酵温度为33～37℃。

[0015] 本发明的第三个目的是提供一种组合物，所述组合物含有所述阿氏芽孢杆菌的产物。

[0016] 本发明的第四个目的是提供所述阿氏芽孢杆菌在食品领域中的应用。

[0017] 在本发明的一种实施方式中，所述应用包括制备淀粉糖、发酵、食品。

[0018] 在本发明的一种实施方式中，所述应用包括制备饲料。

[0019] 有益效果：本发明的述阿氏芽孢杆菌生产的生淀粉酶最适温度和最适pH分布为50℃和7.0，水解生淀粉能力强，产物以麦芽糖为主，酶活力达746.3U/mL，显著优于现有技术中的中性生淀粉酶，该酶的生淀粉降解能力(RDA)值为62.3％。

[0020] 生物材料保藏

[0021] 阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai)GEL-09，已于2017年6月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No:M 2017320，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。

附图说明

[0022] 图1为菌株GEL-09菌落形态(A)及细胞显微观察(B)结果；

[0023] 图2为菌株GEL-09与其他相近菌株的16S rRNA基因序列构建的系统发育进化树；

[0024] 图3为碳源种类及玉米淀粉浓度对GEL-09生长(A)及产酶(B)的影响；

[0025] 图4为氮源种类及复合氮源浓度对GEL-09生长及产酶的影响；

[0026] 图5为培养基初始pH对GEL-09生长及产酶的影响；

[0027] 图6为发酵温度对GEL-09生长及产酶的影响；

[0028] 图7为菌株GEL-09生长及产酶曲线；

[0029] 图8为生淀粉酶在不同pH下的酶活；

[0030] 图9为生淀粉酶在不同温度下的酶活；

[0031] 图10为金属离子和螯合剂对生淀粉酶活力的影响。

具体实施方式

[0032] 1、培养基成分(按质量/体积分数，即g/100mL计)：

[0033] 斜面培养基：牛肉膏0.5，蛋白胨1，NaCl 0.5，琼脂1.5，pH值为7.0，1×105Pa灭菌20min。

[0034] 富集培养基：葡萄糖2、胰蛋白胨2、可溶性淀粉0.5、NaCl 1，pH 7.0。

[0035] 平板筛选培养基：牛肉膏0.05，酵母粉0.1、KH2PO40.2、MgSO4·7H2O 0.05、琼脂1.5，pH 7.0，121℃灭菌30min；其中木薯淀粉,需经过160℃干热灭菌2h后,在灭菌后的其它组分冷却至45℃时采用无菌操作加入灭过菌的培养基中(终浓度2％)，快速振荡混匀倒平板，冷却凝固备用。

[0036] 种子培养基：酵母粉0.5，蛋白胨1.0，NaCl 1.0，pH 7.0。

[0037] 发酵培养基：蛋白胨2.0，K2HPO40.2，MgSO40.05，木薯生淀粉1.0。其中木薯生淀粉先干热灭菌,再在无菌条件下加入培养基中。

[0038] 2、酶活力测定方法

[0039] (1)生淀粉酶活力测定方法：准确吸取2mL 2％木薯淀粉悬浮液，置于20mL比色管中；加2mL 50mM pH 7.0磷酸盐缓冲溶液，摇匀，于50℃恒温水浴摇床中预热5min；然后加入1mL适当稀释的发酵上清液，立即摇匀并计时；于50℃恒温水浴摇床中振荡(160r/min)反应
1h，加入0.5mL、4％(W/V)NaOH终止反应，最后取适当体积的反应液于5000r/min离心5min。
取1mL上清液，立即加入0.8mLDNS溶液，摇匀。沸水浴中煮沸5min，立即放置到冰水中冷却。
以同样条件下用缓冲液代替酶液的反应体系作为空白。上述反应体系加适量蒸馏水并定容至13mL；混匀后用1cm比色皿在540nm波长下测吸光度(OD540nm)。

[0040] 酶活力(U)定义为：在上述分析测定条件下，1min水解生淀粉产生1μg的还原糖(以麦芽糖计)所需的酶量定义为一个酶活力单位。

[0041] (2)糊化淀粉酶活的测定方法：除作用底物替换为糊化的淀粉外，其余与生淀粉酶活的测定方法相同。

[0042] 生淀粉降解能力(RDA)计算：RDA＝B/A×100％，其中B为降解生淀粉酶活，A为降解糊化淀粉酶活。

[0043] 实施例1产生淀粉酶菌株的筛选

[0044] 分别从广西南宁市武鸣区、邕宁区木薯田10-20cm浅层土壤采集土样，共计16份土壤样品。称取2g土样放入250mL锥形瓶，加入20mL无菌生理盐水。置于磁力搅拌器上搅拌约30min，取悬浊液80℃热处理15min杀死营养体细胞，然后在37℃富集培养24h。再取富集培养菌液进行梯度稀释(103、104、105和106)，各取50μL涂布在以木薯淀粉为唯一碳源的筛选培养基平板上，置30℃培养2天。观察菌落生长情况，并滴加0.05％稀碘液，测定菌落周围的透明圈直径(D)和菌落直径(d)，并计算其比值。

[0045] 选取D/d比值较大的58个菌落作为初筛菌株，接种到发酵培养基中，30℃，200r/min，振荡培养3天。培养液经过12000r/min离心5min，收集上清液，并测定发酵上清液中的生淀粉糖化酶活力。其中一株菌株水解生淀粉的酶活力最高，为153.3U/mL。进一步测定粗酶液的RDA值，结果显示粗酶的RDA值为36.7％。将该菌株划线到斜面培养基中培养并保藏，命名为GEL-09。

[0046] 实施例2产生淀粉酶菌株的鉴定

[0047] (1)菌落特征及菌体形态

[0048] 在固体筛选平板上的菌落呈圆形规则、边缘光滑、表面凸起、呈乳白色、较湿润、不透明、易挑起、不起皱(图1)。迎光观察呈白蜡状。培养时间过久菌落会带有微黄色。显微观察菌体为长杆状，有芽孢，革兰氏染色呈阳性。

[0049] (2)生理生化特征

[0050] 淀粉水解试验阳性。接触酶、氧化酶、脲酶、半乳糖苷酶、磷酸酶试验阳性。胰蛋白酶、氧化酶(Kovacs)、芳胺酶、吲哚试验阴性。甲基红试验阴性。能利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、棉籽糖。不能利用乳糖、乙酸盐、山梨醇、鼠李糖。

[0051] (3)16S rDNA序列分析

[0052] 接种菌株GEL-09至LB培养基中，培养过夜，提取该菌的总DNA作为PCR模板。采用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增，本研究选用的通用引物为27F和1492R。PCR扩增条件：95℃5min,94℃30s,55℃30s,72℃90s,循环30次；72℃10min。

[0053] PCR扩增产物经过纯化、加A、胶回收后，连接pMD18-T载体，提取质粒并经琼脂糖电泳检测后送至上海生工生物技术有限公司测序，测序结果如SEQ ID NO.1所示，将测序结果提交GenBank数据库中进行核苷酸序列相似度比较。发现该菌株与阿氏芽孢杆菌Bacillusaryabhattai B8W2216S rDNA同源性99％。然后用ClustalW 2.0软件进行多重序列比对分析，最后用MEGA7.0软件(Neighbor-Joining法)构建系统发育树。

[0054] 如图2所示，基于16S rDNA序列所构建的系统发育进化树也呈现出稳定的亲缘关系。结合菌株的形态特征、16S rDNA序列比对及系统发育树分析，初步将该菌株鉴定为芽孢杆菌目(Bacillales)芽孢杆菌科(Bacillaceae)芽孢杆菌属(Bacillus)阿氏芽孢杆菌种(Bacillusaryabhattai)。

[0055] 综合菌落形态特征、生理生化特征以及16S rDNA序列系统发育分析，将菌株GEL-09初步鉴定为阿氏芽孢杆菌Bacillus aryabhattai GEL-09。该菌株已经提交并保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No:M 2017320，保藏日期为2017年6月9日，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。

[0056] 实施例3不同碳源对菌体生长及产酶的影响

[0057] 将保藏的阿氏芽孢杆菌接入种子培养基，在37℃、200rpm摇瓶培养12h作为种子。以2.5％(V/V)接种量，将种子接种到发酵培养基中，摇床转速为200r/min，振荡培养。

[0058] 分别以木薯淀粉、玉米淀粉、马铃薯淀粉、葡萄糖、麦芽糖、果糖、甘油和蔗糖作为菌株GEL-09发酵碳源，其他培养基成分及条件不变，发酵后测定菌体浓度及酶活。结果如图3A所示，不同种类的淀粉为碳源时，菌体生长较低，但是所产酶活力较高；单糖、二糖、甘油为碳源时，虽然产酶效果较差，但是菌体生长好于多糖(淀粉)为碳源时的生长情况。以葡萄糖为碳源时，菌体浓度最高，但是产酶水平最低。麦芽糖为碳源时，酶活力高于单糖(葡萄糖、果糖)；玉米淀粉为碳源时，产酶水平最高(161.3U/mL)，是葡萄糖为碳源时酶活力的3.3倍。以木薯淀粉、马铃薯淀粉、麦芽糖为碳源时，酶活力分别为156.5U/mL、150.0U/mL、
104.8U/mL。不同碳源对菌株GEL-09生淀粉酶产量影响规律为：多糖＞寡糖＞单糖。可见，聚合度较高的糖更有利于诱导生淀粉酶的生成。

[0059] 进一步地，通过调整不同浓度玉米淀粉，评价玉米淀粉浓度对菌株GEL-09产酶的影响。如图3B所示，玉米粉浓度为2～5％时，相对酶活达90％以上；当浓度达到3％时，生淀粉酶活力达到最高，达230.7U/mL；进一步增加玉米淀粉浓度，菌株的产酶量缓慢降低。

[0060] 实施例4不同氮源对菌体生长及产酶的影响

[0061] 分别选择不同种类的无机氮源(NH4Cl、(NH4)2SO4、NaNO3)和有机氮源(酵母粉、蛋白胨、玉米浆、牛肉膏、豆饼粉)用于菌株GEL-09的发酵产酶。结果如图4A所示，含有有机氮源的发酵培养基中，相对酶活超过65％，以牛肉膏为氮源时，菌体浓度(OD600＝6.3)和酶活力(257.2U/mL)分别是以NaNO3为氮源时的8.2倍和7.1倍。

[0062] 当分别以酵母粉和牛肉膏为为唯一氮源时，最有利于菌体生长和产酶。因此，将二者以1:1的比例混合成为复合氮源。将该复合氮源分别以1～6^％的浓度配置发酵培养基，结果如图4B所示，氮源浓度为3～6％时相对酶活超过83％，在氮源浓度为4％时，酶活达到315.3U/mL。

[0063] 实施例5不同初始pH对菌体生长及产酶的影响

[0064] 以经过实施例3和4成分优化后培养基为发酵培养基，发酵培养基成分为：酵母粉1g/L，牛肉膏1gL，KH2PO40.2g/L、MgSO4·7H2O 0.05g/L，玉米淀粉3g/L。

[0065] 分别调节培养基初始pH为5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5，在30℃、200r/min条件振荡培养48h，取样测定菌体浓度和酶活力。结果如图5所示。培养基pH为7.0～7.5时，相对酶活达85％以上；培养基初始pH为7.0时，酶活力达到最高值，因此菌株GEL-09的发酵培养基的最适初始pH值为7.0。

[0066] 实施例6不同发酵温度对菌体生长及产酶的影响

[0067] 将菌株GEL-09接种于优化后的发酵培养基中，分别置于不同的发酵温度(20℃、25℃、30℃、33℃、35℃、37℃和40℃)条件下振荡培养48h，取样测定菌体浓度和酶活力。如图6所示，当发酵温度在33℃-37℃之间时，菌体浓度变化不大，基本维持在7.5～8.1之间，相对酶活达89％以上；当发酵温度提高到40℃时，菌体浓度迅速下降，酶活降低至约80.6U/mL,为最高酶活力的26％。

[0068] 实施例7菌株Gel-09的摇瓶发酵产酶

[0069] 发酵培养基同实施例5，控制初始pH为7.0，于35℃发酵120h，每隔12h取样测定菌株GEL-09的生长及产酶情况，并绘制相应发酵曲线。如图7所示，0-12h为菌株GEL-09的生长延滞期，此后进入对数生长期；在发酵时间为72h以后，进入稳定期，酶活达到352.6U/mL；酶活力在96h达到最高值，为430.6U/mL。

[0070] 实施例8菌株Gel-09的3L发酵罐产酶

[0071] 将培养好的种子液按接种量5％接入3L发酵罐进行发酵培养(装液量1.5L)；发酵培养基同实施例5。发酵罐控制条件为：通气量1.5L/min，培养温度35℃，通过控制搅拌转速将溶氧控制在30％以上，并且流加氨水控制pH值为7.0。

[0072] 发酵培养进行到48小后，一次性补加100mL补料液(含有蛋白胨10g，木薯生淀粉10g，MgSO40.5g)；此后每隔12小时，补加一次补料液(成分同第一次补加成分)，一直发酵到
120h，结束发酵，测定酶活力为746.3U/mL。

[0073] 实施例9生淀粉酶的分离纯化

[0074] 参考实施例7发酵方法进行发酵，发酵结束将发酵液于4℃、10000r/min离心20min，收集发酵上清液。采用70％的(NH4)2SO4进行盐析，4℃缓慢搅拌过夜，离心收集沉淀。
沉淀复溶后，在pH 7.00.02mol/LNa2HPO4和0.01mol/L柠檬酸缓冲液中透析过夜。样品经过离心，并用0.4μm膜过滤后，作为色谱纯化用上样样品。利用AKTAprime蛋白质纯化系统，以DEAE阴离子交换色谱柱为分离柱进行纯化，280nm紫外在线监测收集目的组分，分部收集含生淀粉酶活性的洗脱液，得到纯化后的生淀粉酶样品。

[0075] 分别在pH 5.5-8.0的缓冲体系中测定该酶活力，并计算相对酶活力，以确定其最适pH。如图8所示，生淀粉酶的最适pH为7.0；在pH 7.0到pH 7.5范围内，酶活力保留90.7％以上；在pH 6.5到pH 8.0范围内，酶活力保留65.2％以上；在pH 5.5和pH 6.0相对酶活力分别为42.4％和55.1％。当pH低于5.5时，相对酶活力仅有不到42.4％。由此可见，菌株GEL-09所产生淀粉酶为pH中性酶。

[0076] 以生淀粉为底物在不同温度条件下(40-60℃)测定了该酶的相对酶活力。如图9可见，生淀粉酶的最适温度为50℃，当温度低于或高于50℃时活力下降明显；在40℃、55℃和60℃分别保留38.4％、59.6％和52.0％的活性。因此，该生淀粉酶为中温酶。

[0077] 实施例10不同来源淀粉酶利用生淀粉能力对比

[0078] 以4mL 1％木薯淀粉悬浮液或糊化木薯淀粉溶液为底物，在pH 7.0、50℃条件下，分别与1mL经过适当稀释的GEL-09生淀粉酶、α-淀粉酶、生麦芽糖淀粉酶和β-淀粉酶混合，在恒温水浴摇床中振荡反应，分别测定不同酶的RDA值。结果所示，其他三种淀粉水解酶中的甘薯β-淀粉酶对生淀粉水解能力最低(0.58％)；地衣芽孢杆菌α-淀粉酶次之(1.28％)，嗜热脂肪芽孢杆菌生麦芽糖淀粉酶的RDA值为6.76％，具有一定的生淀粉水解能力。GEL-09生淀粉酶RDA值为62.3％，分别是其他三种淀粉水解酶RDA值的107.4倍、48.7倍和9.2倍。可见，本研究中的甘薯来源β-淀粉酶，基本没有水解能力；微生物来源淀粉水解酶对生淀粉具有一定的水解能力，但是不同来源不同类型的微生物淀粉水解酶之间的生淀粉水解能力具有明显差别。

[0079] 表1不同来源淀粉酶对生淀粉降解能力对比

[0080]

[0081] 实施例11金属离子和螯合剂对生淀粉酶活力的影响

[0082] 在淀粉酶溶液中加入金属离子螯合剂(EDTA)保温后，测定残余酶活力。结果所示，1mmol/mL和5mmol/mL的EDTA对生淀粉酶均具有一定的抑制作用，残余酶活力分别为83.9％
2+ 2+
和81.8％(图10)。在酶液中添加不同金属离子，酶活力测定结果显示，金属离子Zn 、Cu 、Mg2+对酶活力有一定的激活作用；，分别是对照的115.9％、106.3％和110.9％。而Mn2+、Fe2+、Ca2+等对酶活没有明显影响。

[0083] 实施例12生淀粉酶水解淀粉产物分析

[0084] 配制2％(w/v)玉米淀粉(即2g/L)悬液，高温糊化后，调节pH至7.0，加入生淀粉酶至终浓度为50U/mL，50℃条件下搅拌处理72h。取样，加入纯乙醇沉淀未反应底物(淀粉、糊精等)，12000rpm离心5min，除去沉淀。取上清经过0.22μm滤膜过滤后，采用HPLC法分析淀粉酶解产物的组成。HPLC分析条件为：安捷伦1200HPLC色谱仪，安捷伦1200系列示差检测器；色谱柱ThermoAPS-2HYPERSIL(4.6mm×250mm)，流动相为75％(v/v)乙腈水溶液，流速
0.8mLmin-1；柱温40℃。结果表明糖化产物中以麦芽糖、麦芽三糖和葡萄糖含量分别为
81.3％、13.8％和2.7％，其它产物为其它糖类。

[0085] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。