一株防治稻瘟病的短小芽孢杆菌S9

摘要

本发明公开了一种防治稻瘟病的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)及其应用。本发明的短小芽孢杆菌具有对稻瘟病的广谱且高效的防效，可用于各种品系水稻的稻瘟病防治，尤其是叶瘟和穗颈瘟的防治。

权利要求

1.一种短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)S9，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2017年05月22日，保藏编号为CGMCC No.14178。

2.一种菌剂，其包含如权利要求1所述的短小芽孢杆菌S9或培养所述短小芽孢杆菌S9所获得的无菌上清液。

3.一种防治稻瘟病的方法，其包括将如权利要求1所述的短小芽孢杆菌S9或如权利要求2所述的菌剂施用于水稻作物。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述菌剂为所述短小芽孢杆菌S9的培养液。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述稻瘟病为叶瘟和/或穗颈瘟。

6.如权利要求1所述的短小芽孢杆菌S9或如权利要求2所述的菌剂在防治稻瘟病中的用途。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述稻瘟病为叶瘟和/或穗颈瘟。

说明书

一株防治稻瘟病的短小芽孢杆菌S9

技术领域

[0001] 本发明涉及微生物领域，尤其涉及一株防治稻瘟病的短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)及其应用。

背景技术

[0002] 水稻是世界上重要的粮食作物，产量占据世界粮食总产量的1/4以上，占据中国粮食总产量一半以上，是全世界一半以上的人口所依赖的主食。稻瘟病(Rice Blast)是由子囊菌Magnaporthe oryzae(T.T.Hebert)Yaegashi&Udagawa(无性态：Pyricularia oryzae)引起的一种突发性强、易于流行的世界性真菌病害。该病一年四季均可对水稻造成危害，其危害遍及水稻的各个部位，有苗稻瘟、叶瘟、叶枕瘟、节稻瘟、穗颈瘟、枝梗瘟和谷粒瘟等。稻瘟病分布广泛，全球85个国家均有发生，也是我国南北稻区危害最严重的水稻病害之一。稻瘟病在全球每年造成10～30％的水稻产量损失，每年的产量损失可以养活全世界6千万人口。

[0003] 目前对该稻瘟病菌的防治主要采用抗病品种的选育和化学防治，化学药剂长期使用不但增加农产品的农药残留还会造成生态环境严重污染，破坏生态系统平衡，威胁食品安全。芽胞杆菌(Bacillus)不仅能够有效控制植物病害，同时对人畜安全、植物病原菌不易产生抗性、抗逆性强和促进植物生长等优点，是稻瘟病防治上的重要生防菌。芽胞杆菌定殖在水稻植株上，产生抗菌活性物质抑制稻瘟病菌的生长，诱导水稻产生抗病性，对水稻植株具有促生作用，可以挽回水稻产量损失。芽胞杆菌可以制备生防制剂用来防治我国南方稻区和北方稻区的稻瘟病危害，在水稻产业的可持续发展中对稻瘟病的生物防治具有指导意义。芽胞杆菌可以在化学农药不能施用的时期防治稻瘟病的突发危害，最大限度减轻稻瘟病造成的产量损失，不会增加水稻有毒物质残留，更不会污染环境。

[0004] 稻瘟病菌孢子是主要的侵染器官，孢子成熟后产生芽管，附着胞附在表面，芽管以自然孔口或以侵染栓从水稻表皮直接进入。其中，附着胞的形成是成功侵入的关键步骤之一，它必须产生足够的压力才能够机械穿透寄主角质层完成侵入过程，而黑色素就是产生附着胞压力的前提，附着胞与寄主表面接触一侧非常小的区域内沉积黑色素，最后形成附着胞孔，完成侵入过程。芽胞杆菌通过成功定殖至植物根际、体表或体内，同稻瘟病菌竞争植物周围的营养、分泌抗菌物质抑制病原菌菌丝生长、分生孢子的萌发、使附着胞畸形和淡化黑色素，同时诱导水稻防御系统抵御稻瘟病菌的入侵，从而达到生防的目的。芽胞杆菌可以产生几丁质酶、糖脱酶、细胞壁降解酶等促使稻瘟病菌菌丝细胞壁溶解，特别是那些衰老的甚至接近死亡的菌丝更容易发生溶解。游春平等(2001；2002；2008)筛选到枯草芽胞杆菌和短小芽孢杆菌，对稻瘟病菌二种交配型的分生孢子萌发和附着胞形成的抑制率分别为82.5％和100％，研究发现短小芽孢杆菌产生3种多肽类活性物质，显著抑制稻瘟病菌分生孢子萌发，并且能够诱导水稻植株体内PAL、PO和PPO酶活性升高。樊莎等(2013)从桂花果实中分离的短小芽孢杆菌osm-1对稻瘟病菌菌丝生长的抑制率为47％。戎松浩等(2016)从木樨果实中分离的短小芽孢杆菌Bp6221，当培养基中发酵液浓度为0.025mL/mL时，稻瘟病菌的生长大小仅为阳性对照的一半。

[0005] 利用酶工程和蛋白质工程技术，开展农作物近采收期以蛋白质为有效成分的新型芽胞杆菌生防制剂的研究与应用，可以最大限度地挽回水稻产业在近采收期因为突发病害造成的产量损失。芽胞杆菌防治稻瘟病的研究与应用是水稻生产可持续发展的需要，可以满足联合国世界粮食组织关于粮食安全发展的要求，但是本领域中还缺少对水稻稻瘟病具有广谱且高效防效、抗菌活性物质产量高的芽胞杆菌菌株。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供一种对不同品种水稻的稻瘟病，尤其是叶瘟和穗颈瘟具有较好防治作用，并兼具促生、促产作用的短小芽孢杆菌菌株。

[0007] 为达此目的，本发明采用以下技术方案：

[0008] 在第一方面，本发明提供了一种短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)S9，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2017年05月22日，保藏编号为CGMCC No.14178。

[0009] 在第二方面，本发明提供了一种菌剂，其包含如第一方面所述的短小芽孢杆菌S9或培养所述短小芽孢杆菌S9所获得的无菌上清液。

[0010] 在第三方面，本发明提供了一种防治稻瘟病的方法，其包括将如第一方面所述的短小芽孢杆菌S9或如第二方面所述的菌剂施用于水稻作物。

[0011] 在本发明的防治稻瘟病的方法中，所述菌剂为所述短小芽孢杆菌S9的培养液。

[0012] 在本发明的防治稻瘟病的方法中，所述稻瘟病为叶瘟和/或穗颈瘟。

[0013] 在第四方面，本发明提供了如第一方面所述的短小芽孢杆菌S9或如第二方面所述的菌剂在防治稻瘟病中的用途。

[0014] 在本发明的防治稻瘟病的用途中，所述稻瘟病为叶瘟和/或穗颈瘟。

[0015] 本发明的有益技术效果为：

[0016] 1、与现有的防治稻瘟病的短小芽孢杆菌相比，本发明的短小芽孢杆菌防治效率更高，这体现在可用更少的芽胞量获得相似或更好的防效。

[0017] 2、与现有的防治稻瘟病的短小芽孢杆菌相比，本发明的短小芽孢杆菌具有更广谱的防治效果。

[0018] 3、与现有的防治稻瘟病的短小芽孢杆菌相比，本发明的短小芽孢杆菌对水稻叶瘟和穗颈瘟的防治效果较好。

[0019] 4、与现有的防治稻瘟病的短小芽孢杆菌相比，本发明的短小芽孢杆菌对水稻促生、促产效果较好。

附图说明

[0020] 图1是短小芽孢杆菌S9菌株在NA培养基平板上的培养形态。

[0021] 图2是短小芽孢杆菌S9菌株与稻瘟病菌P131的平板对峙图片。

[0022] 图3是短小芽孢杆菌S9菌株发酵培养液与稻瘟病菌P131的平板对峙图片。

[0023] 图4是短小芽孢杆菌S9菌株对稻瘟病菌P131侵染结构抑制的电镜图片，上图为稻瘟病菌P131菌丝对照，下图为短小芽孢杆菌S9对稻瘟病菌P131侵染结构抑制后的电镜图。

[0024] 图5是短小芽孢杆菌S9菌株无菌上清液对稻瘟病菌侵染结构抑制的电镜图片，上图为稻瘟病菌P131菌丝对照，下图为短小芽孢杆菌S9无菌上清液对稻瘟病菌P131侵染结构抑制后的分生孢子和菌丝的电镜图。

[0025] 图6是短小芽孢杆菌S9菌株生防活性物质检测图片。

[0026] 图7是短小芽孢杆菌S9菌株产生的挥发性物质对稻瘟病菌P131的抑制结果，左图为稻瘟病菌P131菌丝对照，右图为短小芽孢杆菌S9产生的挥发性物质对稻瘟病菌P131的抑制结果。

具体实施方式

[0027] 下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。

[0028] 实施例1：短小芽孢杆菌S9菌株的筛选及发酵培养

[0029] (1)样品采集：采集样品为水稻品种宁粳48号根围土壤，地点为宁夏回族自治区平罗县姚伏镇。连同水稻的根系一起拔出，用聚乙烯塑料袋装好，带回实验室分离。

[0030] (2)短小芽孢杆菌分离：称取1g土壤，放入100mL无菌水中常温下振荡混匀1个小时，用无菌水按照10、102和103梯度稀释，微量移液器取梯度稀释液200mL/皿用涂布棒涂在NA固体培养基平板，37℃培养箱培养48h后，接种针挑取单菌落在NA固体培养基平板上用无菌牙签梯度划线，得到纯化后的细菌单菌落，将单菌落保存在40％甘油中于-80℃超低温冰箱中保存备用。

[0031] (3)短小芽孢杆菌的筛选：选取健康水稻叶片，剪取5cm长叶段，放入短小芽孢杆菌S9发酵液中，振荡定殖1h，得到定殖后叶片；在培养皿底部铺设滤纸，再在湿润的滤纸上放置灭菌牙签，在牙签上放置定殖后叶片，定殖培养20h后，用新的灭菌牙签轻刺叶段表面，不伤及叶段角质层，每个叶段刺伤5个点，再用移液枪吸取稻瘟病菌孢子悬浮液分别接种在刺伤的5个点上，得到接种后叶片，在人工气候箱培养24h、48h和72h后调查接种点稻瘟病病斑数量和面积，选取接种点无病斑或者病斑颜色浅且面积小的芽胞杆菌低温保存备用。

[0032] 肉汤培养基(NA)：蛋白胨10.0g，牛肉粉3.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，pH 7.3±0.1，121℃灭菌20min。

[0033] LB液体培养基：酵母提取物5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，水1000mL，pH7.4～7.6，121℃灭菌30min。

[0034] 燕麦培养基：燕麦片30g，琼脂17～20g，加水1000mL，在沸水浴上加热1h，纱布过滤后加水补足1000mL，加琼脂熔化后分装灭菌(121℃，20min)。

[0035] 经鉴定，该短小芽孢杆菌菌株特征如下：白色，菌落形态有半透明型和透明型，有皱褶且无规则。在NA培养基上培养的菌落光滑，逐渐变成浅黄色。细胞杆状[(0.6～0.7)μm×(2.0～3.0)μm]，革兰氏阳性或可变，以周生鞭毛运动，形成芽胞，呈椭球状或圆柱形，中生、旁生或近端生，没有形成营养细胞，无膜。

[0036] 发明人已将本菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2017年05月22日，保藏编号为CGMCC No.14178。

[0037] 实施例2：短小芽孢杆菌S9菌株的生物活性测定：

[0038] (1)短小芽孢杆菌S9菌株对稻瘟病菌的抑菌测定：在番茄燕麦平板培养基上中央放置稻瘟病菌P131菌饼，生长4d后菌饼两侧相距2cm处接种单菌落芽胞杆菌菌饼作对峙培养，以无菌水为对照，置于培养箱28℃黑暗培养。每处理设3次重复。2d后测量病原菌菌落直径和抑菌带，结果见表1。

[0039] (2)短小芽孢杆菌S9无菌上清液对稻瘟病菌的抑菌测定：在番茄燕麦平板培养基上中央放置稻瘟病菌菌饼，在菌饼两侧相距2cm处放置无菌牛津杯，杯中分别加入芽胞杆菌的发酵液作对峙培养，分别以无菌水和无菌LB液体培养基为对照，置于培养箱28℃黑暗培养。每个处理设3次重复。5d后测量病原菌菌落直径和抑菌带，结果见表1。

[0040] 表1短小芽孢杆菌S9菌株与稻瘟病菌的对峙培养

[0041]

[0042] 注：表中的实验数据为三次重复的平均值。

[0043] (3)短小芽孢杆菌S9离体叶片防效测定：选取健康水稻叶片，剪取5cm长叶段，放入短小芽孢杆菌S9发酵液中，200rpm/min，28℃振荡定殖1h，得到定殖后叶片；在培养皿底部铺设滤纸，再在湿润的滤纸上放置5根灭菌牙签，在牙签上放置定殖后叶片，定殖培养20h后，用新的灭菌牙签轻刺叶段表面，不伤及叶段角质层，每个叶段刺伤5个点，再用移液枪吸取稻瘟病菌孢子悬浮液分别接种在刺伤的5个点上，得到接种后叶片，在人工气候箱培养24h、48h和72h后调查接种点稻瘟病病斑数量和面积，计算防治效果。接种后的培养皿放在人工气候箱培养，参数设置是28℃，RH(湿度)70％，每天光照时间4h，光照强度为4400Lux，结果见表3。

[0044] 稻瘟病叶瘟室内调查分级标准：按国际水稻所稻瘟病抗性评价分级标准(表2)[0045] 表2为稻瘟病叶瘟室内调查分级标准

[0046]

[0047]

[0048] 生防效果计算公式：

[0049]

[0050]

[0051] 表3短小芽孢杆菌S9对稻瘟病菌离体叶片防效测定

[0052]

[0053] 注：显著性分析采用最小极差法(LSD)(P≤0.05±标准误)。

[0054] (4)短小芽孢杆菌S9菌株在温室盆栽条件下的生防效果：挑选健康水稻品种D10，1％次氯酸钠溶液消毒10min，75％酒精冲洗3次，无菌水冲洗5次，28℃人工气候箱催芽，待芽长到1cm时播种于塑料小水桶里(水桶底部直径18cm×高21cm×水桶上部直径24.5cm)。
种植28d后喷施待测芽胞杆菌发酵液，芽胞浓度为1×108CFU/mL，每个水桶喷施20mL，每个处理4个重复。24h后接种稻瘟病菌孢子悬浮液，孢子浓度为1×106CFU/mL。7d后调查叶瘟发生情况，计算病情指数和防效大小。

[0055] 表4短小芽孢杆菌S9在温室条件下对叶瘟的防治效果测定

[0056]处理 病情指数 防治效果(％)
S9 3.77±1.16bB 76.56±0.85bB
三环唑 2.98±0.14bB 81.51±0.69aA
清水对照 16.09±0.43aA /

[0057] 注：显著性分析采用最小极差法(LSD)(P≤0.05±标准误)。

[0058] (5)短小芽孢杆菌S9菌株的大田防治效果试验

[0059] 在宁夏回族自治区平罗县姚伏镇宁夏禾银现代农业有限公司水稻种植基地进行短小芽孢杆菌S9的田间药效试验，水稻品种是宁粳43号，试验芽胞杆菌芽胞量是1×108CFU/ml，平均每个试验小区面积是50m2，4个重复小区，分别调查短小芽孢杆菌S9对叶瘟和穗颈瘟的防治效果。调查方法按《农药田间药效试验准则》，稻瘟病叶瘟调查分级标准是：
0级：无病；1级：仅有针尖大小的褐点；3级：小而圆以致稍长的褐色坏死灰斑，直径1～2mm；5级：典型的稻瘟病斑，受害面积小于10％；7级：典型的稻瘟病斑，受害面积为26％～50％；9级：全面叶片死亡。穗颈瘟调查方法见表5，结果见表6和表7。

[0060] 表5为稻瘟病穗颈瘟调查分级标准

[0061]级数 调查标准
0 无穗颈瘟、粒瘟和枝梗瘟
1 有粒瘟和枝梗瘟，瘪粒数＜5％
2 有粒瘟和枝梗瘟，瘪粒数为5～10％
3 有粒瘟和枝梗瘟，瘪粒数为10～20％
4 有粒瘟和枝梗瘟，瘪粒数为20～30％
5 有穗颈瘟、粒瘟和枝梗瘟，瘪粒数为20～30％
6 穗颈瘟造成瘪粒数＞80％

[0062] 生防效果计算公式：

[0063]

[0064]

[0065] 表6短小芽孢杆菌S9菌株对叶瘟的大田防治效果测定

[0066]

[0067]

[0068] 注：显著性分析采用最小极差法(LSD)(P≤0.05±标准误)。

[0069] 表7短小芽孢杆菌S9菌株对穗颈瘟的大田防治效果测定

[0070]处理 病情指数 防效/％
S9 13.27±0.29bcB 71.55±0.31bBC
绿地康 12.25±0.73cB 76.25±0.37aA
三环唑 12.06±0.51bcB 74.18±1.08aAB
清水对照 46.86±3.06aA /

[0071] 注：显著性分析采用最小极差法(LSD)(P≤0.05±标准误)。

[0072] (6)短小芽孢杆菌S9菌株对水稻秧苗的促生能力：选取健康且长势一致的水稻种子宁粳43号放入短小芽孢杆菌S9的发酵培养液中浸种1h后取出放在铺有滤纸的培养皿内，在28℃，RH为70％的人工气候箱培养，48h后调查种子露白数量。每个处理重复3皿。取健康且长势一致的水稻种子放入短小芽孢杆菌S9的发酵培养液中浸种1h后播种于水稻育秧池中，生长1个月后调查水稻秧苗的根长和株高，结果见表8。

[0073] 表8短小芽孢杆菌S9对水稻秧苗的促生能力

[0074]

[0075] 注：数据为三次重复的平均值，显著性分析采用最小极差法(LSD)(P≤0.05±标准误)。

[0076] (7)短小芽孢杆菌S9菌株对水稻植株的促产能力：取健康且长势一致的水稻种子宁粳43号放入短小芽孢杆菌S9的发酵培养液中浸种1h后播种于水稻育秧池中，分别在插秧期、分蘖期、齐穗期、黄熟期喷雾短小芽孢杆菌S9的发酵培养液，收割时将水稻植株连根系一起拔起，调查水稻植株的有效穗数、穗长、秕粒数、总重量、空秕率和千粒重，结果见表9。检测短小芽孢杆菌S9菌株对稻米品质的影响，结果见表10。

[0077] 表9短小芽孢杆菌S9对水稻植株的促生能力

[0078]处理 有效穗数/穴 穗长(cm) 空秕率(％) 千粒重(g)
S9 10±0.81aA 193.33±1.33bAB 5.53±0.21bA 28.45±0.24aA
绿地康 12±0.70aA 224.17±9.95aA 5.87±0.29bA 27.82±0.46aA
三环唑 10±0.72aA 186.14±1.18bB 5.43±1.27bA 29.45±0.03aA
清水对照 9±0.72aA 180.47±0.57bB 7.39±0.95aA 27.96±0.31aA

[0079] 注：数据为三次重复的平均值，显著性分析采用最小极差法(LSD)(P≤0.05±标准误)。

[0080] 表10短小芽孢杆菌S9对稻米品质的影响

[0081]处理 糙米率 精米率 整精米率 垩白粒率 垩白度
S9 87.74±0.24abA 81.26±0.27aA 70.01±0.94aA 7.20±0.31aA 3.21±1.32aAB三环唑 88.28±0.34aA 81.43±0.17aA 70.87±0.38aA 5.10±1.04bB 1.63±1.03cC绿地康 88.12±0.26aA 81.30±0.15aA 69.87±0.58aA 7.30±1.21aA 2.63±0.54bB清水 87.13±0.29bA 81.63±0.47aA 68.83±1.42aA 7.40±1.17aA 3.57±0.45aA[0082] 注：数据为三次重复的平均值，显著性分析采用最小极差法(LSD)(P≤0.05±标准误)。

[0083] (8)短小芽孢杆菌S9菌株对稻瘟病菌侵染结构抑制的SEM观察：

[0084] 菌株S9对稻瘟病菌菌丝抑制的SEM观察：在PDA固体培养基上活化稻瘟病菌，28℃培养5～7天，用直径5mm的打孔器在活化的稻瘟病菌平板上打成菌饼。将稻瘟病菌作为靶标菌，在PDA平板中心接种直径为5mm的稻瘟病菌菌饼，待测细菌接种于距靶标菌饼2cm处，在28℃恒温箱中培养5～7天，待空白对照的稻瘟病菌菌丝长满整个培养皿时，取对峙培养平板上抑菌区域真菌菌丝边缘及相应位置空白对照(只长真菌)的菌丝(连同培养基切下)，采用扫描电镜观察抑菌区域，结果见图4。

[0085] 菌株S9无菌上清液对分生孢子和菌丝抑制的SEM观察：培养48h的供试菌株无菌上清液与稻瘟病菌P131孢子悬浮液(1×106CFU/mL)以1∶1的比例混匀，混合液在2mL无菌离心管中28℃对峙培养24h时候，高速冷冻离心后，沉淀物用2.5％戊二醛固定2h以上，采用磷酸缓冲液冲洗三次，1％饿酸固定2h后，再次用磷酸缓冲液冲洗三次，30％、50％、70％、80％、90％和100％乙醇梯度脱水三次，LEICAEM CPD临界点干燥仪进行干燥，EIKO IB-3喷金，最后采用日立S-3400N扫描电镜观察供试菌株对稻瘟病菌分生孢子和菌丝形态上的影响，结果见图5。

[0086] 菌株无菌上清液的制备：将已活化24h的供试菌株S9单菌落分别接种至LB液体培养基中，37℃、200rpm/min振荡培养48h后，发酵培养液在4℃、10000rpm/min离心20min去除菌体，上清液经过滤(0.22μm)除菌，即得无菌上清液。

[0087] (9)短小芽孢杆菌S9菌株生防活性物质检测：

[0088] 生物膜的检测：挑取单菌落接种到液体LB培养基上，30℃，180rpm过夜摇培，按1:1000比例加入到含有Msgg培养基的12孔组织培养板中，在23℃下培养，3天后观察生物膜形成情况，结果见表11。

[0089] 淀粉酶的检测：取新活化的单菌落接种于含有0.2％可溶性淀粉的LB平板上，培养48h，形成明显菌落后，在平板上滴加卢哥式碘液染色10min，用70％乙醇洗板，能产生淀粉酶的菌株，在黑色的背景下，其菌落生长处周围可形成无色的透明圈，如果有透明圈表明菌株可以产生淀粉酶，每个处理3个重复，结果见表11。

[0090] 蛋白酶的检测：将活化的待测菌株穿刺接种于1％脱脂牛奶琼脂平板上，30℃培养24h、48h、72h后观察外围透明圈的产生，出现透明圈表明有蛋白酶的产生，每个处理3个重复，结果见表11。

[0091] 葡聚糖酶检测：待测菌接种于含有ABP培养基的平板上，30℃培养48h、72h后，观察平板中是否出现消解圈，若有消解圈产生则表明有葡聚糖酶的产生，每个处理3个重复，结果见表11。

[0092] 嗜铁素检测：嗜铁素用CAS培养基检测，将活化的待测菌接种于CAS检测培养基平板上，30℃培养72h后，观察平板中是否产生橘黄色晕圈，若出现橘黄色则表明有嗜铁素的产生，每个处理重复3次，结果见表11。

[0093] 纤维素酶的检测：将分离到的菌株活化后接种于纤维素筛选培养基平板上，28℃恒温倒置培养2d，用0.1％的刚果红染色液浸染10min，再用1mol/L的NaCl溶液脱色5min。若菌株产纤维素酶，则会在菌落周围出现清晰的透明圈，每个处理重复3次，结果见表11。

[0094] 挥发性物质的检测：在番茄燕麦培养基平板中央接种一片直径1cm的稻瘟病菌P131菌块，在另一个同样大小的NA培养基平板上涂布培养S9菌株，将前者反扣于后者之上，两皿接触处用封口膜密封，以未涂布S9菌株的NA平板作空白对照，于28℃下恒温培养9d后分别测量涂布S9菌株和对照培养的稻瘟病菌菌落直径，计算相对抑制率。每处理5个重复，结果见表11和图7。

[0095]

[0096] Msgg培养基的制备：0.1M Phosphate Buffer 50mL/L，0.5M MOPS(pH 7.0)200mL/L，0.1M MgCl2 20mL/L，0.01M MnCl2 5mL/L，1mM ZnCl2 1mL/L，10mM Thiamine 0.2mL/L，10mg/mL Phe 5mL/L，10mg/mL Trp 5mL/L，10mg/ml Thr 5mL/L，50％glycerol 10mL/L，
10％Glutamate 50mL/L，去离子水32mL/L，过滤灭菌后，加入灭菌的10mL 5mM FeC13和7mL 
0.1M CaC12，于4℃保存备用。

[0097] ABP培养基的制备：用研钵将块状茯苓研碎成粉末，使其可通过120目的筛子，KH2PO4 6.8g，K2PHO4·12H2O 17.9g，酵母提取物6.7g，茯苓粉(或β-1.3-葡聚糖)5.0g，苯胺蓝120mg，琼脂粉12g，pH值为6.8，水1L。

[0098] CAS培养基的制备：酪胨9g，酵母浸膏5g，枸橼酸三钠10g，磷酸氢二钠1g，磷酸二氢钠1g，葡萄糖10g，琼脂20g，溶于1L水中。

[0099] 纤维素富集培养基(1L):NaCI 6g,MgS04 0.1g,KH2P04 0.5g,CaC12 0.1g,(NH4)S04 2.0g,K2HP04 2.0g，琼脂15g,CMC-Na 5g，pH调至7.0；纤维素筛选培养基(1L)：在上述纤维素酶富集培养基中加入酵母粉1g。

[0100] 刚果红染色液:用蒸馏水溶解刚果红，终浓度为0.1％(w/v)。

[0101] 刚果红脱色液:终浓度为1mol/L的NaCI溶液。

[0102] 表11短小芽孢杆菌S9菌株生防活性物质检测

[0103]

[0104] 注：数据为三次重复的检测结果；“+”是检测出结果，“-”是未检测出[0105] 申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细特征以及方法，但本发明并不局限于上述详细特征以及方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细特征以及方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用条件的等效替换以及辅助部件的增加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。