本公开涉及脑胶质瘤的尿液蛋白标志物及其在监测肿瘤治疗效果中的用途。具体而言，本公开涉及胶质瘤尿蛋白标志物在监测脑胶质瘤患者的治疗效果中的用途，所述尿蛋白标志物选自：血小板凝血酶敏感蛋白‑4、胶原α‑1(IV)链、白介素‑1受体拮抗蛋白、核糖核酸酶抑制因子、N‑乙酰胞壁酰‑L‑丙氨酸酰胺酶、纤蛋白‑1、聚合免疫球蛋白受体、组织蛋白酶D、胱抑素‑C、氨肽酶N、二肽基肽酶1、β‑葡萄糖醛酸、溶酶体Pro‑X羧肽酶、结合素‑2、硒结合蛋白1、程序性细胞死亡蛋白1配体2、酸性神经酰胺酶、Napsin‑A、溶酶体相关膜糖蛋白1、谷氨酰氨基肽酶、γ‑谷氨酰水解酶等。利用本公开的鉴定试剂能够有效确定患者的术后治疗效果。
1.蛋白表达水平的鉴定试剂在制备用于监测受试者的脑胶质瘤治疗效果的试剂中的用途，其中：-所述蛋白包含：血小板凝血酶敏感蛋白-4、胶原IVα-1链、膜联蛋白A7、粘附G蛋白偶联受体F5、线粒体10kDa热休克蛋白和癌胚抗原相关细胞粘附分子1；
α-晶状蛋白B链、β-葡萄糖醛酸、CD276抗原、C型凝集素结构域家族4构件G、γ-谷氨酰水解酶、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶、Napsin-A、氨肽酶N、白介素-1受体拮抗蛋白、肠型麦芽糖-葡糖淀粉酶、程序性细胞死亡蛋白1配体2、二肽基肽酶1、二氢蝶啶还原酶、谷氨酰氨基肽酶、胱抑素-C、核糖核酸酶抑制因子、聚合免疫球蛋白受体、结合素-2、类似丝氨酸羧肽酶CPVL、溶酶体Pro-X羧肽酶、溶酶体相关膜糖蛋白1、溶酶体相关膜糖蛋白2、酸性神经酰胺酶、纤蛋白-1、线粒体苹果酸脱氢酶、硒结合蛋白1、组织蛋白酶D、肿瘤坏死因子受体超家族成员1B；
所述的表达水平是指所述蛋白在所述受试者尿液样本中的表达水平。
所述鉴定试剂是质谱鉴定试剂、抗体或其抗原结合片段、探针、引物。
3.根据权利要求2所述的用途，其中所述抗体是单克隆抗体。
相较于治疗前，治疗后选自以下的蛋白的表达水平降低指示所述受试者脑胶质瘤治愈：N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶、白介素-1受体拮抗蛋白、胶原IVα-1链、核糖核酸酶抑制因子、血小板凝血酶敏感蛋白-4、纤蛋白-1及其组合；
相较于治疗前，治疗后选自以下的蛋白的表达水平升高指示所述受试者脑胶质瘤的治愈：α-晶状蛋白B链、β-葡萄糖醛酸、CD276抗原、C型凝集素结构域家族4构件G、γ-谷氨酰水解酶、Napsin-A、癌胚抗原相关细胞粘附分子1、氨肽酶N、肠型麦芽糖-葡糖淀粉酶、程序性细胞死亡蛋白1配体2、二肽基肽酶1、二氢蝶啶还原酶、谷氨酰氨基肽酶、胱抑素-C、聚合免疫球蛋白受体、结合素-2、类似丝氨酸羧肽酶CPVL、膜联蛋白A7、粘附G蛋白偶联受体F5、溶酶体Pro-X羧肽酶、溶酶体相关膜糖蛋白1、溶酶体相关膜糖蛋白2、酸性神经酰胺酶、线粒体
10kDa热休克蛋白、线粒体苹果酸脱氢酶、硒结合蛋白1、组织蛋白酶D、肿瘤坏死因子受体超家族成员1B、及其组合；
治疗前是指，在所述受试者接受治疗之日前0至72小时；
治疗后是指，在所述受试者接受治疗之日后5至20天。
5.根据权利要求4所述的用途，治疗后是指在所述受试者接受治疗之日后6至15天。
6.根据权利要求4所述的用途，治疗后是指在所述受试者接受治疗之日后7至14天。
相较于治疗前，治疗后选自以下的蛋白的表达水平降低指示所述受试者脑胶质瘤治愈：N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶、白介素-1受体拮抗蛋白、胶原IVα-1链、核糖核酸酶抑制因子、血小板凝血酶敏感蛋白-4、纤蛋白-1及其组合；并且至少包含血小板凝血酶敏感蛋白-4；
相较于治疗前，治疗后选自以下的蛋白的表达水平升高指示所述受试者脑胶质瘤的治愈：α-晶状蛋白B链、β-葡萄糖醛酸、CD276抗原、C型凝集素结构域家族4构件G、γ-谷氨酰水解酶、Napsin-A、癌胚抗原相关细胞粘附分子1、氨肽酶N、肠型麦芽糖-葡糖淀粉酶、程序性细胞死亡蛋白1配体2、二肽基肽酶1、二氢蝶啶还原酶、谷氨酰氨基肽酶、胱抑素-C、聚合免疫球蛋白受体、结合素-2、类似丝氨酸羧肽酶CPVL、膜联蛋白A7、粘附G蛋白偶联受体F5、溶酶体Pro-X羧肽酶、溶酶体相关膜糖蛋白1、溶酶体相关膜糖蛋白2、酸性神经酰胺酶、线粒体
10kDa热休克蛋白、线粒体苹果酸脱氢酶、硒结合蛋白1、组织蛋白酶D、肿瘤坏死因子受体超家族成员1B、及其组合；并且至少包含癌胚抗原相关细胞粘附分子1。
8.根据权利要求1所述的用途，其中所述脑胶质瘤选自：局限性胶质瘤、弥漫性胶质瘤。
9.根据权利要求8所述的用途，其中所述的弥漫性胶质瘤是毛细胞型星形细胞瘤。
10.根据权利要求8所述的用途，其中所述的弥漫性胶质瘤是多形性黄色瘤型星形细胞瘤。
11.根据权利要求8所述的用途，其中所述的弥漫性胶质瘤是弥漫性星形细胞瘤。
12.根据权利要求8所述的用途，其中所述的弥漫性胶质瘤是少突胶质细胞瘤。
13.根据权利要求8所述的用途，其中所述的弥漫性胶质瘤是少突星形细胞瘤。
14.根据权利要求8所述的用途，其中所述的弥漫性胶质瘤是间变性星形细胞瘤。
15.根据权利要求8所述的用途，其中所述的弥漫性胶质瘤是间变性少突胶质细胞瘤。
16.根据权利要求8所述的用途，其中所述的弥漫性胶质瘤是间变性少突星形细胞瘤。
17.根据权利要求8所述的用途，其中所述的弥漫性胶质瘤是胶质母细胞瘤。
18.根据权利要求1所述的用途，所述脑胶质瘤选自：胶质母细胞瘤、少突胶质细胞瘤。
19.一种用于监测脑胶质瘤治疗效果的试剂盒或芯片，其包含分别针对以下每一种蛋白的表达水平的鉴定试剂：α-晶状蛋白B链、β-葡萄糖醛酸、CD276抗原、C型凝集素结构域家族4构件G、γ-谷氨酰水解酶、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶、Napsin-A、癌胚抗原相关细胞粘附分子1、氨肽酶N、白介素-1受体拮抗蛋白、肠型麦芽糖-葡糖淀粉酶、程序性细胞死亡蛋白1配体2、二肽基肽酶1、二氢蝶啶还原酶、谷氨酰氨基肽酶、胱抑素-C、核糖核酸酶抑制因子、聚合免疫球蛋白受体、结合素-2、胶原IVα-1链、类似丝氨酸羧肽酶CPVL、膜联蛋白A7、粘附G蛋白偶联受体F5、溶酶体Pro-X羧肽酶、溶酶体相关膜糖蛋白1、溶酶体相关膜糖蛋白2、酸性神经酰胺酶、纤蛋白-1、线粒体10kDa热休克蛋白、线粒体苹果酸脱氢酶、硒结合蛋白1、血小板凝血酶敏感蛋白-4、组织蛋白酶D、肿瘤坏死因子受体超家族成员1B；
所述鉴定试剂是质谱鉴定试剂、抗体或其抗原结合片段、探针、引物。
20.根据权利要求19所述的用于监测脑胶质瘤治疗效果的试剂盒或芯片，所述抗体是单克隆抗体。
脑胶质瘤的尿液蛋白标志物及其在监测肿瘤治疗效果中的
用途
技术领域
[0001] 本公开涉及临床医学；具体而言涉及人脑胶质瘤相关的尿液蛋白标志物。具体而言，本公开涉及利用脑胶质瘤患者尿液样品和质谱分析蛋白组学技术获得的人脑胶质瘤诊断和/或监测相关的尿液蛋白标志物，及其用途。
背景技术
[0002] 疾病生物标志物是与病理过程相关的可测量的变化，可以用于诊断疾病、监测病程、预测疾病预后和评估治疗效果。尿液是理想的疾病标志物样品来源，尿液可以通过无创的方式大量获得，可以无痛地反复收集同一患者不同时间点的尿液，更重要的是尿液中缺乏稳态机制的调控可以富集机体排出的各种变化，而这些变化就是潜在的疾病标志物(参见Gao Y.Urine--an untapped goldmine for biomarker discovery.Sci China.Life Sci,2013,56(12):1145)。
[0003] 尿液蛋白质组(urinary proteomics)旨在建立一种无创的“液体活检”(liquid biopsy)诊断方法，通过检测尿液中特异的疾病标志物来部分替代器官穿刺活检已成为临床医生关注的重要研究方向，具有重大的临床应用前景。
[0004] 脑胶质瘤是一种最常见的原发性脑部肿瘤，占中枢神经系统恶性肿瘤的81％。胶质瘤恶性程度高、病情进展迅速(参见Ostrom Q T,Bauchet L,Davis F G,等人The epidemiology of glioma in adults:a“state of the science”review.Neuro-oncology,2014,16(7):896-913)。以恶性胶质瘤为代表的中枢神经系统恶性肿瘤造成了巨大的社会经济及家庭负担，一直是当今肿瘤研究的热点。所以及时诊断胶质瘤并监测胶质瘤患者疾病治疗效果对于提高患者的生存率至关重要。
发明内容
[0005] 鉴于本领域的上述需求，根据本公开的一些实施方式，提供了针对选自以下蛋白的鉴定试剂在制备用于监测受试者的脑胶质瘤治疗效果的试剂中的用途，其中所述鉴定试剂：α-晶状蛋白B链、β-葡萄糖醛酸、CD276抗原、C型凝集素结构域家族4构件G、γ-谷氨酰水解酶、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶、Napsin-A、癌胚抗原相关细胞粘附分子1、氨肽酶N、白介素-1受体拮抗蛋白、肠型麦芽糖-葡糖淀粉酶、程序性细胞死亡蛋白1配体2、二肽基肽酶1、二氢蝶啶还原酶、谷氨酰氨基肽酶、胱抑素-C、核糖核酸酶抑制因子、胶原α-1(IV)、聚合免疫球蛋白受体、结合素-2、类似丝氨酸羧肽酶CPVL、膜联蛋白A7、粘附G蛋白偶联受体F5、溶酶体Pro-X羧肽酶、溶酶体相关膜糖蛋白1、溶酶体相关膜糖蛋白2、酸性神经酰胺酶、纤蛋白-1、线粒体10kDa热休克蛋白、线粒体苹果酸脱氢酶、硒结合蛋白1、血小板凝血酶敏感蛋白-4、组织蛋白酶D、肿瘤坏死因子受体超家族成员1B、及其组合。
[0006] 在具体的实施方式中，在受试者治疗前及治疗后的多个时间点(治疗前至少1个、或至少2个、或至少3个；治疗后至少1个、或至少2个、或至少3个、或至少4个、或至少5个)进行取样，根据患者尿液中蛋白标志物的变化情况来监测胶质瘤的治疗效果情况。技术人员能够理解，治疗前至少采集1个样本，治疗后至少采集一个样本，以便进行比较；当然，不限于一个样本，在更多的时间点采集样本允许动态地监测标记物的变化趋势。然而，也不应过于密集，超出受试者的承受能力；并且过于密集的样本采集，导致样本间的时间间隔太短，难以观察到变化，也会增加监测成本。可以理解，“治疗前”不意味着过于久远，比如受试者尚未患病之时。因此，治疗前，所述的受试者应当已经诊断患有胶质瘤。在一些实施方式中，治疗前是指，在所述受试者接受治疗之日前的0至72小时；优选24至48小时；更优选12至24小时。此处，“接受治疗之日前的0小时”是指尚未接受、但马上要接受治疗。
[0007] 治疗后是指，在所述受试者接受治疗之日后的5至20天，优选6至15天，更优选7至14天。
[0008] 在一些实施方式中，治疗前12至72小时内(包含端点数值，全文同)采集1个样本，并且治疗后7至14天采集一个样本。
[0009] 在另一些实施方式中，治疗前12至24小时内采集1个样本，并且治疗后5至8天采集一个样本，治疗后12至20天再次采集一个样本。
[0010] 根据一些实施方式中，治疗是指任何本领域中已知的以及未来的针对脑胶质瘤的治疗，包括但不限于有创治疗、无创治疗；包括但不限于：化学疗法、辐射疗法、物理切除、生物免疫疗法、中医中药疗法。在一个具体的实施方式中，治疗是指物理切除。技术人员应当理解，本公开中，蛋白表达水平和最终的治疗效果之间的关联性，不因具体的治疗方法而受到影响。这意味着，无论采取何种治疗方法，本公开中蛋白标记物的表达水平均能够用来评价治疗的效果如何。
[0011] 在一些实施方式中，效果如何是指治愈。
[0012] 本公开中，治愈体现为选自以下的任一项或组合：肿瘤切除干净、头颅核磁无异常信号、肢体活动自如、无头痛、无呕吐、无视物不清、无言语不利。
[0013] 在具体的实施方式中，相较于治疗前，治疗后受试者中选自以下的蛋白的表达水平降低，指示所述受试者胶质瘤治愈：N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶、白介素-1受体拮抗蛋白、胶原α-1(IV)链、核糖核酸酶抑制因子、血小板凝血酶敏感蛋白-4、纤蛋白-1及其组合。在具体的实施方式中，相较于治疗前，治疗后受试者中以下蛋白的表达水平降低，指示所述受试者胶质瘤治愈：N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶、白介素-1受体拮抗蛋白、胶原α-1(IV)链、核糖核酸酶抑制因子、血小板凝血酶敏感蛋白-4和纤蛋白-1的组合。
[0014] 在具体的实施方式中，相较于治疗前，治疗后选自以下的蛋白的表达水平升高指示所述受试者胶质瘤治愈：α-晶状蛋白B链、β-葡萄糖醛酸、CD276抗原、C型凝集素结构域家族4构件G、γ-谷氨酰水解酶、Napsin-A、癌胚抗原相关细胞粘附分子1、氨肽酶N、肠型麦芽糖-葡糖淀粉酶、程序性细胞死亡蛋白1配体2、二肽基肽酶1、二氢蝶啶还原酶、谷氨酰氨基肽酶、胱抑素-C、聚合免疫球蛋白受体、结合素-2、类似丝氨酸羧肽酶CPVL、膜联蛋白A7、粘附G蛋白偶联受体F5、溶酶体Pro-X羧肽酶、溶酶体相关膜糖蛋白1、溶酶体相关膜糖蛋白2、酸性神经酰胺酶、线粒体10kDa热休克蛋白、线粒体苹果酸脱氢酶、硒结合蛋白1、组织蛋白酶D、肿瘤坏死因子受体超家族成员1B、及其组合。
[0015] 适用于本公开的鉴定试剂是质谱鉴定试剂、抗体或其抗原结合片段、探针或引物。在具体的实施方式中，抗体是单克隆抗体。本公开对单克隆抗体的物种来源没有限制，任何能够结合上述蛋白的抗体均可以使用。
[0016] 在具体的实施方式中，抗原结合片段包括但不限于：Fab、Fab'、(Fab')2、Fv、ScFv、双特异抗体、三特异抗体、四特异抗体、双-scFv、mimi抗体。任何保留了抗原结合活性的抗体片段均适用于本公开。
[0017] 在本公开的技术方案中，所述脑胶质瘤选自：局限性胶质瘤或弥漫性胶质瘤。根据WHO中枢神经系统肿瘤分类(2007年，第四版)，弥漫性胶质瘤可以分为Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ级，包括毛细胞型星形细胞瘤(WHOI级)、多形性黄色瘤型星形细胞瘤(WHOⅡ级)、弥漫性星形细胞瘤(WHOⅡ级)、少突胶质细胞瘤(WHOⅡ级)、少突星形细胞瘤(WHOⅡ)、间变性星形细胞瘤(WHOⅡ级)、间变性少突胶质细胞瘤(WHOⅢ级)、间变性少突星形细胞瘤(WHOⅢ级)、胶质母细胞瘤(WHOⅣ级)。
[0018] 在具体的实施方式中，根据本公开的蛋白标志物能够用于诊断和/或预后胶质瘤。在另一些实施方式中，根据本公开的蛋白标志物能够用于评价对脑胶质瘤的治疗效果。
[0019] 在具体的实施方式中，表达水平选自核酸水平和蛋白质水平，尤其是蛋白质水平。
[0020] 在具体的实施方式中，表达水平是在尿液样本中测定的。
[0021] 根据另一些实施方式，还提供了一种用于诊断和/或预后胶质瘤或用于评价对脑胶质瘤的治疗效果的试剂盒或芯片，其包含选自以下的蛋白的鉴定试剂、或者由选自以下的蛋白的鉴定试剂组成：α-晶状蛋白B链、β-葡萄糖醛酸、CD276抗原、C型凝集素结构域家族4构件G、γ-谷氨酰水解酶、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶、Napsin-A、癌胚抗原相关细胞粘附分子1、氨肽酶N、白介素-1受体拮抗蛋白、肠型麦芽糖-葡糖淀粉酶、程序性细胞死亡蛋白1配体2、二肽基肽酶1、二氢蝶啶还原酶、谷氨酰氨基肽酶、胱抑素-C、核糖核酸酶抑制因子、胶原α-1(IV)、聚合免疫球蛋白受体、结合素-2、类似丝氨酸羧肽酶CPVL、膜联蛋白A7、粘附G蛋白偶联受体F5、溶酶体Pro-X羧肽酶、溶酶体相关膜糖蛋白1、溶酶体相关膜糖蛋白2、酸性神经酰胺酶、纤蛋白-1、线粒体10kDa热休克蛋白、线粒体苹果酸脱氢酶、硒结合蛋白1、血小板凝血酶敏感蛋白-4、组织蛋白酶D、肿瘤坏死因子受体超家族成员1B、及其组合。
[0022] 在一些实施方式中，试剂盒中包含上述蛋白的鉴定试剂。在另一些实施方式中，芯片上固定有上述蛋白的鉴定试剂。在一些实施方式中，所述鉴定试剂是抗体或其抗原结合片段。
[0023] 根据一些实施方式，提供了一种用于评价受试者胶质瘤治疗效果的方法，包括步骤：
[0024] 1)获得受试者治疗前和治疗后的尿液样本，
[0025] 2)任选地，从尿液样本中分离蛋白，
[0026] 3)确定所述受试者的尿液样本中选自以下的蛋白的表达水平：α-晶状蛋白B链、β-葡萄糖醛酸、CD276抗原、C型凝集素结构域家族4构件G、γ-谷氨酰水解酶、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶、Napsin-A、癌胚抗原相关细胞粘附分子1、氨肽酶N、白介素-1受体拮抗蛋白、肠型麦芽糖-葡糖淀粉酶、程序性细胞死亡蛋白1配体2、二肽基肽酶1、二氢蝶啶还原酶、谷氨酰氨基肽酶、胱抑素-C、核糖核酸酶抑制因子、胶原α-1(IV)、聚合免疫球蛋白受体、结合素-2、类似丝氨酸羧肽酶CPVL、膜联蛋白A7、粘附G蛋白偶联受体F5、溶酶体Pro-X羧肽酶、溶酶体相关膜糖蛋白1、溶酶体相关膜糖蛋白2、酸性神经酰胺酶、纤蛋白-1、线粒体10kDa热休克蛋白、线粒体苹果酸脱氢酶、硒结合蛋白1、血小板凝血酶敏感蛋白-4、组织蛋白酶D、肿瘤坏死因子受体超家族成员1B、及其组合。
[0027] 在具体的实施方式中，使用质谱方法、ELISA方法、或Western方法确定表达水平。
[0028] 当采用质谱方法确定蛋白及其表达水平时，在获得尿液样本的步骤之后，还可以包括消化步骤。在具体的实施方式中，用蛋白酶(如胰蛋白酶)消化尿液样本中的蛋白。
[0029] 根据一些实施方式，提供了一种用于评价受试者胶质瘤治疗效果的方法，包括步骤：
[0030] 1)获得受试者治疗前及治疗后的尿液样本，
[0031] 2)确定受试者尿液样本中选自以下的蛋白的表达水平：α-晶状蛋白B链、β-葡萄糖醛酸、CD276抗原、C型凝集素结构域家族4构件G、γ-谷氨酰水解酶、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶、Napsin-A、癌胚抗原相关细胞粘附分子1、氨肽酶N、白介素-1受体拮抗蛋白、肠型麦芽糖-葡糖淀粉酶、程序性细胞死亡蛋白1配体2、二肽基肽酶1、二氢蝶啶还原酶、谷氨酰氨基肽酶、胱抑素-C、核糖核酸酶抑制因子、胶原α-1(IV)、聚合免疫球蛋白受体、结合素-2、类似丝氨酸羧肽酶CPVL、膜联蛋白A7、粘附G蛋白偶联受体F5、溶酶体Pro-X羧肽酶、溶酶体相关膜糖蛋白1、溶酶体相关膜糖蛋白2、酸性神经酰胺酶、纤蛋白-1、线粒体10kDa热休克蛋白、线粒体苹果酸脱氢酶、硒结合蛋白1、血小板凝血酶敏感蛋白-4、组织蛋白酶D、肿瘤坏死因子受体超家族成员1B、及其组合
[0032] 3)将受试者治疗后的样品中所述蛋白的表达水平和治疗前的样品所述蛋白的表达水平进行比较，
[0033] 4)确定所述受试者的胶质瘤的治疗效果。
[0034] 在具体的实施方式中，相较于治疗前，治疗后受试者中选自以下的蛋白的表达水平降低指示所述受试者胶质瘤治愈：N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶、白介素-1受体拮抗蛋白、胶原α-1(IV)链、核糖核酸酶抑制因子、血小板凝血酶敏感蛋白-4、纤蛋白-1及其组合。
[0035] 在具体的实施方式中，相较于治疗前，治疗后选自以下的蛋白的表达水平升高指示所述受试者胶质瘤治愈：α-晶状蛋白B链、β-葡萄糖醛酸、CD276抗原、C型凝集素结构域家族4构件G、γ-谷氨酰水解酶、Napsin-A、癌胚抗原相关细胞粘附分子1、氨肽酶N、肠型麦芽糖-葡糖淀粉酶、程序性细胞死亡蛋白1配体2、二肽基肽酶1、二氢蝶啶还原酶、谷氨酰氨基肽酶、胱抑素-C、聚合免疫球蛋白受体、结合素-2、类似丝氨酸羧肽酶CPVL、膜联蛋白A7、粘附G蛋白偶联受体F5、溶酶体Pro-X羧肽酶、溶酶体相关膜糖蛋白1、溶酶体相关膜糖蛋白2、酸性神经酰胺酶、线粒体10kDa热休克蛋白、线粒体苹果酸脱氢酶、硒结合蛋白1、组织蛋白酶D、肿瘤坏死因子受体超家族成员1B、及其组合。
附图说明
[0036] 图1A至1D：胶质瘤患者手术前后脑部MRI。图1A和1B：手术前；图1C和1D：手术后。
[0037] 图2：胶质瘤患者病理结果。
具体实施方式
[0038] 下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本公开。本领域技术人员公知，在不背离本公开精神的情况下，可以对本公开做出许多修改，这样的修改也落入本公开的范围。如无特别说明，所使用的实验材料均可从商业公司获取。
[0039] 实施例
[0040] 实施例1.胶质瘤患者手术前后尿液的收集及分析
[0041] 1.获取行肿瘤切除术的胶质瘤患者术前及术后恢复两周出院前的晨尿样品，通过术前术后患者尿液蛋白组的比较，观察患者术前患病与术后恢复正常的变化，对临床上判断胶质瘤术后治愈情况具有重要的指导意义。
[0042] 2.材料与试剂
[0043] (1)仪器：
[0044] Orbitrap Fusion Lumos三合一质谱仪购自Thermo Fisher公司；
[0045] 高效液相色谱仪EASY-nLC 1200购自Thermo Fisher公司。
[0046] (2)主要试剂：
[0047] 色谱级乙腈、甲酸和甲醇为Fisher公司生产；碘乙酰铵(IAA)、碳酸氢铵、二硫苏糖醇(DTT)从Sigma公司购买；质谱级胰酶从Promega公司购买。
[0048] 3.实验方法
[0049] (1)样本收集流程：在胶质瘤患者肿瘤切除手术前，对颅部进行影像学检查，收集术前患者的尿液。同时在患者手术后康复1-2周出院前进行影像检查确认肿瘤切除干净，并收集患者术后的尿液样品。
[0050] (2)提取患者尿液蛋白：患者尿液5000g离心30min取上清，将尿液与无水乙醇按体积比1:3进行混合，-20℃过夜沉淀尿液蛋白。4℃以12000g离心30min，弃上清，沉淀自然风干后加裂解液复溶。
[0051] (3)蛋白组样品制备：尿蛋白进行膜上酶切，参见Wisniewski JR,Zougman A,Nagaraj N,Mann M.Universal sample preparation method for proteome analysis.Nature methods 2009；6:359-62。
[0052] (4)质谱鉴定：对酶切的肽段用Orbitrap Fusion Lumos三合一质谱仪进行串联质谱分析。以高灵敏模式获取质谱数据：使用最高速模式(3秒)进行二级谱图全扫描，在Orbitrap中二级扫描的分辨率为30000，以30％的HCD能量进行碰撞，筛选电荷数为+2到+7的母离子，动态排除时间为30秒。
[0053] (5)蛋白组定量分析：质谱结果用mascot软件(版本2.5.1)进行数据库检索。所用数据库为SwissProt_Human(08/2013)。检索条件为：胰酶酶切；允许有2个漏切位点；半胱氨酸+57Da的固定修饰；可变修饰：Oxidation(M)。质谱数据检索容许误差为：母离子10ppm，子离子0.05Da。数据库检索的结果通过Scaffold软件(版本4.4.0)进行蛋白组数据定量分析，蛋白水平设定FDR<1％，多肽水平设定至少2个独特多肽用于定量。将术前和术后的蛋白组数据进行统计分析，筛选出于与术前相比谱图数变化倍数在1.5倍以上，p值小于0.05的蛋白作为差异蛋白。
[0054] 测试例
[0055] 测试例1.头部核磁检查
[0056] 患者手术前通过核磁检查确定肿物大小及位置，手术后结合病理确诊胶质瘤；患者手术后康复1-2周出院前复查核磁确认肿物切除干净。在手术前及术后康复出院前对患者头颅进行磁共振MRI检查，发现手术后肿瘤组织清除干净(图1A至1D)。
[0057] 测试例2.组织病理学检查
[0058] 胶质瘤患者手术切除的肿瘤样品进行HE染色病理检查及胶质瘤常见分子标志物的免疫组化检查，确认胶质瘤患病及WHO的分级。
[0059] 对手术后摘除的肿块进行HE染色，发现肿瘤细胞排列密集，可见多核瘤细胞，核分裂象易见(图2)。
[0060] 测试例3.蛋白鉴定
[0061] 收集5例确诊的胶质瘤患者(胶质母细胞瘤和少突胶质细胞瘤)手术前后共10个尿液样品，在蛋白鉴定FDR<1％的水平，共鉴定到蛋白数1422个。
[0062] 手术前与手术后1至2周的样品比对，筛选出变化倍数在1.5倍以上且配对样品t检验p<0.05的差异蛋白。
[0063] 表1显示，在手术前后共筛选出差异蛋白34个，术后6个蛋白降低，术后28个蛋白升高。蛋白ID是SwissProt中的编号。
[0064] 表1.胶质瘤患者手术前后差异尿液蛋白质标志物
[0065]
[0066]
