乳腺癌标志物

摘要

本发明涉及生物医学检测领域，提供了一种乳腺癌标志物。所称的标志物包括以下糖蛋白中的至少一种：具有末端N‑乙酰葡萄糖胺糖基的血清转铁蛋白、具有末端N‑乙酰葡萄糖胺糖基的血浆蛋白酶C1抑制因子和具有末端N‑乙酰葡萄糖胺糖基的丝氨酸蛋白酶抑制剂B4。检测待测样本中这三种蛋白中的任一种、两种或者全部三种的量，能够判断或者辅助判断乳腺癌的发生和/或发展。这几种/类蛋白单独或者任意组合均能够作为乳腺癌的筛查或者辅助筛查诊断的标志物。

权利要求

1.一种乳腺癌标志物，其特征在于，所述标志物包括具有末端N-乙酰葡萄糖胺糖基的丝氨酸蛋白酶抑制剂B4和具有末端N-乙酰葡萄糖胺糖基的血清转铁蛋白,所述标志物能够和杨树菇凝集素2特异性结合。

2.权利要求1的标志物，其特征在于，所述标志物还包括具有末端N-乙酰葡萄糖胺糖基的血浆蛋白酶C1抑制因子。

3.权利要求1或2的标志物，其特征在于，所述末端N-乙酰葡萄糖胺糖基为非还原型末端N-乙酰葡萄糖胺糖基。

4.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于实施辅助诊断乳腺癌的用途，所述试剂盒包括能够与权利要求1-3任一所述标志物中的蛋白发生特异性结合的抗体，以及能够用于检测所述蛋白和所述抗体形成的复合物的试剂，所述试剂盒包含杨树菇凝集素2色谱柱。

5.一种检测乳腺癌的装置，其特征在于，包括：

第一量获取模块，该模块用于测定待测样本中的权利要求1-3任一标志物的量，获得第一量；

分析模块，该模块用于比较来自第一量获取模块的第一量与第二量，以及依据比较结果，判定待测样本的来源个体患有乳腺癌的风险，所述第二量为利用相同的测定方法获得的对照样本中的相应标志物的量。

6.权利要求5的装置，其特征在于，所述对照样本来自健康个体。

7.权利要求5的装置，其特征在于，所述对照样本来自乳腺癌患者。

8.权利要求5的装置，其特征在于，所述对照样本为体液样本，所述体液选自血液、血浆和血清中的至少一种。

9.权利要求5-8任一所述的装置，其特征在于，至少利用一种测定方法进行所述测定。

10.权利要求9的装置，其特征在于，所述测定方法选自化学发光法、放射免疫检测法、荧光免疫检测法、质谱、蛋白免疫印迹以及酶联免疫吸附中的至少一种。

说明书

乳腺癌标志物

技术领域

[0001] 本发明涉及生物医学领域，特别地，涉及疾病检测标志物，更特别地，涉及一种乳腺癌标志物。

背景技术

[0002] 乳腺癌是发生在乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤。全球乳腺癌发病率自20世纪70年代末开始一直呈上升趋势。根据国家癌症中心和卫生部疾病预防控制局2012年公布的乳腺癌发病数据显示：全国肿瘤登记地区乳腺癌发病率位居女性恶性肿瘤的第1位。

[0003] 根据美国癌症划分联合委员会(American Joint Commission for Cancer Staging，AJCC)的第七版乳腺癌临床分期标准，乳腺癌可分为Stage0：TisN0M0；Stage I：T1N0M0；Stage II A：T0N1M0，T1N1M0，T2N0M0；Stage II B：T2N1M0，T3N0M0；StageIIIA：
T0N2M0，T1N2M0，T2N2M0，T3N1-2 M0；StageIIIB：T4N0-2 M0；StageIIIC：任何TN3 M0；Stage IV：任何T任何N M1stage。其中Tis指原位癌，T代表原发性肿瘤，N表示区域淋巴结，M表示远处转移。

[0004] 原位乳腺癌并不致命；但由于乳腺癌细胞丧失了正常细胞的特性，细胞之间连接松散，容易脱落。癌细胞一旦脱落，游离的癌细胞可以随血液或淋巴液播散全身，形成转移，危及生命。

[0005] 乳腺癌筛查以及监测，特别是早期筛查、辅助诊断、诊断，利于乳腺癌的尽早发现以及跟踪判断，能够提高治愈乳腺癌的成功率，意义重大。

发明内容

[0006] 本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商业选择。

[0007] 依据本发明的第一方面，本发明提供一种乳腺癌标志物，所称的标志物包括以下糖蛋白中的至少一种：具有末端N-乙酰葡萄糖胺糖基的血清转铁蛋白(Serotransferrin)、具有末端N-乙酰葡萄糖胺糖基的血浆蛋白酶C1抑制因子(Plasmaprotease C1 inhibitor)和具有末端N-乙酰葡萄糖胺糖基的丝氨酸蛋白酶抑制剂B4(Serpin B4)。

[0008] 上述三种具有特定糖基结构的糖蛋白，是发明人利用所在研究团队早前发现分离得的茶树菇凝集素2(Agrocybe agerita lectin 2，AAL2)、利用凝集素亲和层析联合高效液相色谱/质谱的方法，鉴定乳腺癌患者血浆中差异表达的糖蛋白，并通过进一步的筛选以及试验验证而来。发明人发现这三种具有特定糖基结构的糖蛋白分别在乳腺癌患者甚至在不同时期的乳腺癌患者中差异表达，检测待测样本中这三种蛋白中的任一种、两种或者全部三种的浓度，能够判断或者辅助判断乳腺癌的发生和/或发展，确定的这几种蛋白单独或者任意组合均能够作为乳腺癌的筛查或者辅助筛查诊断的标志物。

[0009] 根据本发明的实施例，所称的标志物为一种糖蛋白。在一个具体例子中，所称标志物为具有末端N-乙酰葡萄糖胺糖基的血清转铁蛋白。在另一个具体例子中，所称标志物为具有末端N-乙酰葡萄糖胺糖基的血浆蛋白酶C1抑制因子。在又一个具体例子中，所称标志物为具有末端N-乙酰葡萄糖胺糖基的丝氨酸蛋白酶抑制剂B4。

[0010] 根据本发明的实施例，所称的标志物为组合物，由多种糖蛋白组成。在一个具体例子中，所称标志物由具有末端N-乙酰葡萄糖胺糖基的血清转铁蛋白和具有末端N-乙酰葡萄糖胺糖基的血浆蛋白酶C1抑制因子组成。在一个具体例子中，所称的标志物为蛋白组合物，由具有末端N-乙酰葡萄糖胺糖基的血清转铁蛋白和具有末端N-乙酰葡萄糖胺糖基的丝氨酸蛋白酶抑制剂B4组成。在一个具体例子中，所称的标志物为蛋白组合物，由具有末端N-乙酰葡萄糖胺糖基的血浆蛋白酶C1抑制因子和具有末端N-乙酰葡萄糖胺糖基的丝氨酸蛋白酶抑制剂B4组成。在一个具体例子中，所称的标志物为蛋白组合物，由具有末端N-乙酰葡萄糖胺糖基的血清转铁蛋白、具有末端N-乙酰葡萄糖胺糖基的血浆蛋白酶C1抑制因子和具有末端N-乙酰葡萄糖胺糖基的丝氨酸蛋白酶抑制剂B4组成。

[0011] 根据本发明的实施例，所称的标志物具有的末端N-乙酰葡萄糖胺糖基为非还原型末端N-乙酰葡萄糖胺糖基。

[0012] 根据本发明的实施例，所称的标志物能够和凝集素AAL2特异性结合。AAL2的糖芯片实验表明，其糖结合特异性最高的是末端N乙酰葡糖胺(N-acetylglucosamine，GlcNAc)[Jiang S，Chen Y，，Wang M，et al.A novel lectin from Agrocybe aegerita shows high bindingselectivity for terminal N-acetylglucosamine[J].The Biochemical Journal，2012，443(2)：369-378]，AAL2对GlcNAc的特异性高于其他结合GlcNAc的凝集素，为已知凝集素中与GlcNAc结合特异性最高的。利用该凝集素与糖基化程度的糖蛋白的高特异结合能力，能够筛选到具有特定糖基结构的糖蛋白，在一个具体例子中，发明人利用自制的AAL2-琼脂糖凝胶层析柱对健康个体和/或患者的血清样本中的糖蛋白进行富集，获得多种具有末端N乙酰葡糖胺糖基的糖蛋白。

[0013] 本领域技术人员能够知晓，蛋白/肽经过糖基化可变为糖蛋白/糖肽，糖蛋白/糖肽去糖基化后可变成蛋白/肽。个体/体液/组织/细胞中的一种糖蛋白，可能会存在原态(非糖基化或者去糖基化)和糖基化两种形态，而且，对于糖基化形态蛋白(糖蛋白)常常由于糖基化位置(位点)和/或程度不一样，有多种存在形式，即糖蛋白上的糖链具有高度的宏观和微观不均一性。所称的糖蛋白Serotransferrin、Plasma protease C1 inhibitor和Serpin B4也不例外，在个体/体液/组织/细胞中，这三种蛋白可能都有非糖基化形态存在，而且各自的糖基化形态均存在多种不同的糖结构，即同一种糖蛋白的糖结构一般是多样的。例如，Serotransferrin可能不带糖基/糖链、或者可能在某个或某些位点上带有一条或多条糖链，而糖链由一种或多种糖基组成和/或糖基之间具有多种连接方式。所称的具有末端N-乙酰葡萄糖胺糖基的糖蛋白指，糖蛋白的至少一个糖链的末端为N-乙酰葡萄糖胺糖基，所称的糖链包括一个或多个糖基。

[0014] 本领域技术人员能够理解，所称的三种蛋白，在示例中，若以糖结构来区分，各自都可以称为一类蛋白，为具有一种或多种糖结构的蛋白，该类蛋白的糖结构具有一个共同的特征为包含至少一个末端N-乙酰葡萄糖胺糖基。

[0015] 在本文以下的描述中，除特殊说明，血清转铁蛋白或者Serotransferrin表示具有末端N-乙酰葡萄糖胺糖基的血清转铁蛋白，血浆蛋白酶C1抑制因子或者Plasma protease C1inhibitor表示具有末端N-乙酰葡萄糖胺糖基的血浆蛋白酶C1抑制因子，丝氨酸蛋白酶抑制剂B4或者Serpin B4表示具有末端N-乙酰葡萄糖胺糖基的丝氨酸蛋白酶抑制剂B4。

[0016] 依据本发明的第二方面，提供上述一方面或者任一实施例中的标志物在筛查、诊断或者辅助诊断乳腺癌中的用途。前述对本发明一方面或者任一实施例中的标志物的技术特征和优点的描述，仍旧适用本发明这一方面的用途，在此不再赘述。

[0017] 根据本发明的实施例，所称的筛查、诊断或者辅助诊断乳腺癌包括：测定待测样本中的标志物的量，获得第一量，标志物为上述任一方面或者任一实施例中的标志物；比较第一量与第二量，以及依据获得的比较结果，判定待测样本的来源个体患有乳腺癌的风险和/或者乳腺癌发展时期，所称第二量为利用相同的测定方法获得的对照样本中的相应标志物的量。所称的量为蛋白/糖蛋白表达量，可以为绝对含量，也可以为相对含量，如浓度。

[0018] 根据本发明的实施例，所述对照样本为体液样本，所述体液选自血液、血浆和血清中的至少一种。

[0019] 所称的第二量可以在进行所述筛查、诊断和/或辅助诊断乳腺癌时与第一量同时测定，也可以预先测定记录或保存下来。根据本发明的实施例，量为蛋白浓度，对测定方法的选择没有特别的限制，能够对目标蛋白进行定量的方法均可。较佳地，选择能够和目标蛋白的糖结构能特异性识别/结合的测定方法。在一个具体例子中，测定方法选自化学发光法、放射免疫检测法、荧光免疫检测法、质谱、蛋白免疫印迹(Western Blot，WB)以及酶联免疫吸附(ELISA)中的至少一种。在一个具体例子中，选择的测定方法为酶联免疫吸附，具体地，所称的酶联免疫吸附为包含凝集素的酶联免疫吸附，更具体地，这里的凝集素为能够和标志物中的糖蛋白的糖结构特异性结合，例如，可以先利用抗体来获得某种蛋白以及该种蛋白的复合物(若有)，接着利用凝集素选择其中的具有特定糖结构的蛋白，以进行检测。在一个具体例子中，利用的ELISA为反向凝集素ELISA(Reverse-Lectin ELISA)，更具体地，为反向AAL2凝集素ELISA，例如，可以先利用AAL2凝集素特异性结合具有末端GlcNAc的糖蛋白，接着利用抗体选择其中的特定种类糖蛋白，以进行检测。根据本发明的实施例，标志物包括Serotransferrin，利用反向AAL2凝集素ELISA进行检测，待测样本中的Serotransferrin含量的测定结果显著高于其在健康对照样本中的含量时，判定待测样本来自的个体患有乳腺癌的风险高。

[0020] 根据本发明的实施例，标志物包括Plasma protease C1 inhibitor，利用反向AAL2凝集素ELISA进行检测，待测样本中的Plasma protease C1 inhibitor含量的测定结果显著高于其在健康对照样本中的含量时，判定待测样本来自的个体患有乳腺癌的风险高。

[0021] 根据本发明的实施例，标志物包括Serpin B4，利用反向AAL2凝集素ELISA进行检测，待测样本中的SerpinB4含量的测定结果显著低于其在健康对照样本中的含量时，判定待测样本来自的个体患有乳腺癌的风险高。

[0022] 根据本发明的实施例，当标志物为组合蛋白时，任一蛋白表达量检测结果与健康对照的比较结果符合上述该蛋白实施例的描述，判定待测样本来自的个体患有乳腺癌的风险高。

[0023] 根据本发明的实施例，当标志物为组合蛋白时，各种蛋白表达量检测结果与健康对照的比较结果都符合上述该蛋白实施例的描述，判定待测样本来自的个体患有乳腺癌的风险高。

[0024] 所称的显著高于或者显著低于，可以是一般所说的明显大于或者明显小于，例如二者中的较大者为较小者的5倍、3倍、2倍或者1.5倍以上，也可以是差异具有统计意义上的显著性，例如利用一种测定方法获得的第一量和第二量均为多个值，在预定的置信水平下，比较这两组值的差异是否具有统计意义。

[0025] 依据本发明的第三方面，提供一种试剂盒，该试剂盒用于实施上述任一实施例中的筛查、检测、诊断或者辅助诊断乳腺癌的用途，该试剂盒包括能够与上述任一实施例中的标志物中的至少一种糖蛋白发生特异性结合的抗体，以及能够用于检测该糖蛋白和所称抗体形成的复合物的试剂。

[0026] 根据本发明的实施例，试剂盒还包括AAL2凝集素色谱柱，和/或进行质谱的试剂。

[0027] 依据本发明的第四方面，提供一种检测、筛查、诊断或者辅助诊断乳腺癌的方法，该方法包括：测定待测样本中的上述任一方面或者任一实施例中的标志物的量，获得第一量；比较所述第一量与第二量，所述第二量为利用相同的测定方法获得的对照样本中的相应标志物的量，以及依据比较结果，判定待测样本的来源个体患有乳腺癌的风险和/或者乳腺癌发展时期。所称的量为蛋白/糖蛋白表达量，可以为绝对含量，也可以为相对含量，如浓度。

[0028] 根据本发明的实施例，所述对照样本为体液样本，所述体液选自血液、血浆和血清中的至少一种。

[0029] 所称的第二量可以在进行所述筛查、诊断和/或辅助诊断乳腺癌时进行测定，也可以预先测定记录或保存下来。在本发明的实施例中，量为蛋白浓度，至少利用一种测定方法进行浓度的测定，本发明对测定方法的选择没有特别的限制，能够对目标蛋白进行定量的方法均可。较佳地，选择能够和目标蛋白的糖结构能特异性识别/结合的测定方法。在一个具体例子中，测定方法选自化学发光法、放射免疫检测法、荧光免疫检测法、质谱、蛋白免疫印迹(Western Blot，WB)以及酶联免疫吸附(ELISA)中的至少一种。在一个具体例子中，选择的测定方法为酶联免疫吸附，具体地，所称的酶联免疫吸附为包含凝集素的酶联免疫吸附，更具体地，这里的凝集素为能够和标志物中的糖蛋白的糖结构特异性结合，例如，可以先利用抗体来获得某种蛋白以及该种蛋白的复合物(若有)，接着利用凝集素选择其中的具有特定糖结构的蛋白，以进行检测。在一个具体例子中，利用的ELISA为反向凝集素ELISA(Reverse-Lectin ELISA)，更具体地，为反向AAL2凝集素ELISA，例如，可以先利用AAL2凝集素特异性结合具有末端GlcNAc的糖蛋白，接着利用抗体选择其中的特定种类糖蛋白，以进行检测。

[0030] 根据本发明的实施例，标志物包括Serotransferrin，利用反向AAL2凝集素ELISA进行检测，待测样本中的Serotransferrin含量的测定结果显著高于其在健康对照样本中的含量时，判定待测样本来自的个体患有乳腺癌的风险高。

[0031] 根据本发明的实施例，标志物包括Plasma protease C1 inhibitor，利用反向AAL2凝集素ELISA进行检测，待测样本中的Plasma protease C1 inhibitor含量的测定结果显著高于其在健康对照样本中的含量时，判定待测样本来自的个体患有乳腺癌的风险高。

[0032] 根据本发明的实施例，标志物包括Serpin B4，利用反向AAL2凝集素ELISA进行检测，待测样本中的SerpinB4含量的测定结果显著低于其在健康对照样本中的含量时，判定待测样本来自的个体患有乳腺癌的风险高。

[0033] 根据本发明的实施例，当标志物为组合蛋白时，任一蛋白表达量检测结果与健康对照的比较结果符合上述该蛋白实施例的描述，判定待测样本来自的个体患有乳腺癌的风险高。

[0034] 根据本发明的实施例，当标志物为组合蛋白时，各种蛋白表达量检测结果与健康对照的比较结果各自都符合上述该蛋白实施例的描述，判定待测样本来自的个体患有乳腺癌的风险高。

[0035] 所称的显著高于或者显著低于，可以是一般所说的明显大于或者明显小于，例如二者中的较大值为较小值的5倍、3倍、2倍或者1.5倍以上，也可以是差异具有统计意义上的显著性，例如利用一种测定方法获得的第一量和第二量均为多个值，在预定的置信水平下，比较这两组值的差异是否具有统计意义。

[0036] 依据本发明的第五方面，提供一种检测、筛查、诊断或者辅助诊断乳腺癌的装置，该装置用以实施上述任一方面或者任一实施例中的乳腺癌检测/筛查方法的部分步骤或者全部步骤，该装置包括：第一量获取模块，该模块用于测定待测样本中的上述任一任一实施例中的标志物的量，获得第一量；分析模块，该模块用于比较来自第一量获取模块的第一量与第二量，所述第二量为利用相同的测定方法获得的对照样本中的相应标志物的量，以及依据比较结果，判定待测样本的来源个体患有乳腺癌的风险和/或者乳腺癌发展时期。

[0037] 上述对本发明一方面或者任一实施例中的乳腺癌检测方法的技术特征和优点的描述，同样适用本发明这一方面的乳腺癌检测装置，在此不再赘述。

[0038] 本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

[0039] 图1为本发明实施例中的AAL2糖结合特异性检测结果示意图；

[0040] 图2为本发明实施例中的凝集素AAL2亲和层析柱富集各组糖蛋白的电泳图；

[0041] 图3为本发明实施例中的iTRAQ-LC-MS/MS鉴定Serotransferrin的质谱图；

[0042] 图4为本发明实施例中的iTRAQ-LC-MS/MS鉴定Plasma protease C1 inhibitor的质谱图；

[0043] 图5为本发明实施例中的iTRAQ-LC-MS/MS鉴定Serpin B4的质谱图；

[0044] 图6为本发明实施例中的蛋白免疫印迹检测蛋白表达的结果示意图；

[0045] 图7为本发明实施例中的反向Lectin-ELISA检测Serotransferrin表达的结果示意图；

[0046] 图8为本发明实施例中的反向Lectin-ELISA检测Plasma protease C1inhibitor表达的结果示意图；

[0047] 图9为本发明实施例中的反向Lectin-ELISA检测Serpin B4表达的结果示意图。

具体实施方式

[0048] 以下结合具体实施例对本发明的乳腺癌标志物及应用进行详细的描述。下面示例，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

[0049] 除另有交待，以下实施例中涉及的未特别交待的试剂、试剂盒、仪器及软件，都是常规市售产品或者开源的，比如琼脂糖凝胶购自美国eBioscience公司，iTRAQ试剂盒购自辉骏生物公司等。

[0050] 实施例1

[0051] 利用凝集素亲和层析联合高效液相色谱/质谱的方法，鉴定乳腺癌患者血浆中差异表达的糖蛋白，以期获得乳腺癌候选标志物。

[0052] 1.样本来源及信息

[0053] 血浆标本收集于东莞第六人民医院和中山市小榄医院，根据美国癌症划分联合委员会(American Joint Commission for Cancer Staging，AJCC)的第七版乳腺癌临床分期标准，分为Stage0：TisN0M0；Stage I：T1N0M0；Stage II A：T0N1M0，T1N1M0，T2N0M0；Stage II B：T2N1M0，T3N0M0；StageIIIA：T0N2M0，T1N2M0，T2N2M0，T3N1-2M0；Stage IIIB：T4N0-2 M0；StageIIIC：任何T N3 M0；StageIV：任何T任何N M1stage。其中Tis是原位癌，T代表原发性肿瘤，N即为区域淋巴结，M表示远处转移。依据其性别，年龄及标本数目将乳腺癌标本在此分组为：健康女性对照组，BC1，BC2，BC3。用于血浆蛋白质组学分析的样本资料统计如表1。

[0054] 表1

[0055]

[0056]

[0057] 2.凝集素亲和层析柱富集糖蛋白

[0058] 基于前期研究表明凝集素AAL2(Agrocybe agerita lectin 2)具有与末端乙酰葡萄糖胺糖基(末端GlcNAc)高度结合特异性，AAL2为已知凝集素中与GlcNAc结合特异性最高的，AAL-2结合排名前60位的糖基的末端均为GlcNAc。图1显示第五代糖芯片检测AAL-2糖结合特异性的结果，从图1可看出AAL-2结合能力排名前十位的糖基结构，末端均为非还原性GlcNAc；结合热图显示AAL-2的糖结合谱，可看出，AAL-2的糖基结合特异性从0.1μg/ml到200μg/ml非常一致，在该浓度范围内，其与末端GlcNAc的特异性结合能力不会随着AAL-2的浓度变化而变化。

[0059] 发明人基于以上，利用SepharoseTM 4B填料欧联凝集素AAL2层析柱富集血浆中末端乙酰葡萄糖胺化的糖蛋白，进而希望能够筛选到乳腺癌患者血浆中的早期标志物。

[0060] 选用8例健康女性混合血浆和乳腺癌患者各组(BC1，BC2，BC3)各8例患者混合血浆，每组血浆样本通过凝集素AAL2亲和层析柱进行富集，并通过SDS-PAGE结合银染进行初步分析，具体操作步骤如下：

[0061] 将1ml AAL2SepharoseTM4B亲和层析柱用5ml结合缓冲液充分冲洗，流速为1ml/min，以平衡柱内环境。经BCA试剂盒定量，将约含有900μg血浆蛋白量的健康女性对照组和乳腺癌患者各组样本混合血浆(每组8人)稀释于2ml的结合缓冲液中，上柱，于4℃冰箱中旋转孵育30min。用4ml结合缓冲液洗涤未结合糖蛋白3次，每次10min。继而用4ml的洗脱液(200mM N-乙酰葡萄糖胺溶于结合缓冲液中)洗脱结合的目的糖蛋白，洗脱2次，每次10min。收集各组洗脱液分别置于不同超滤管中去盐浓缩，将25μl蛋白浓缩液与蛋白质SDS-PAGE上样缓冲液混匀，100℃加热10min，等体积上样进行SDS-PAGE并银染。

[0062] 结果所示，通过亲和层析柱，大量未结合蛋白被洗去，洗脱液中有若干蛋白条带得TM到富集(尤其是分子量在116kD、80kD、66.2kD、40kD的蛋白)。Sepharose 4B偶联凝集素AAL2亲和层析柱分别富集健康女性对照组混合血浆(8例)和乳腺癌患者组BC1，BC2，BC3混合血浆(各8例)中与AAL2特异性结合的糖蛋白，分别通过3次洗涤，最后洗脱富集的糖蛋白。通过SDS-PAGE联合银染方法对每一步样品进行分离，如图2所示，图2a中的四张电泳图分别对应健康女性混合血浆、BC1、BC2和BC3，各电泳图中的泳道从左至右依次均为，M：marker；1：混合血浆总蛋白；2：血浆蛋白样品穿透峰；3：第一次洗涤未结合蛋白；4：第二次洗涤未结合蛋白；5：第三次洗涤未结合蛋白；6：竞争洗脱的目的糖蛋白。图2b中，泳道从左至右依次为M：
marker 1：健康组洗脱的目的糖蛋白；2：BC1组洗脱目的糖蛋白；3：BC2组洗脱的目的糖蛋白；4：BC3组洗脱的目的糖蛋白。

[0063] 3.i-TRAQ标记结合LC-MS/MS质谱对富集糖蛋白进行定性定量分析

[0064] 凝集素亲和层析柱富集的四组血浆标本糖蛋白用iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantitation，同位素标记相对与绝对定量)试剂盒标记(Health组，iTRAQ114；BC1组，iTRAQ115；BC2组，iTRAQ116；BC3，iTRAQ117)，通过液相色谱-二级质谱联用(LC-ESI-MS/MS)对其中的蛋白进行定性定量检测，其中共鉴定出116个蛋白。

[0065] 具体地，iTRAQ试剂盒标记按照试剂盒说明书进行。LC-MS/MS鉴定主要采用TripleTOF 5600+(AB SCIEX，Mississauga，ON)与splitless Ultra 1D Plus系统(Eksigent，Dublin，CA)的联合分析。经过SCX筛选的到的干燥肽段于100μl的Swtichos缓冲液(0.1％的甲酸，98％的ACN)中复溶，纳喷雾针取每组分20μl复溶样本量注射于nano-LC-MS/MS色谱柱喷雾接口，以待系统分析。与电喷雾飞行时间质谱串联的是在线毛细血管液相色谱层析系统。混合的肽段于PepMap C-18RP的毛细血管柱中以300μl/min的流速洗脱分离。液相色谱洗脱梯度开始于3％的BufferB(双蒸水∶甲酸∶AN＝3∶0.1∶97)和97％的BufferA(双蒸水∶甲酸∶AN＝97∶0.1∶3)洗脱3min，再用3％～25％或30％的BufferB洗脱60min，90％的BufferB洗脱7min，最后用3％的BufferB洗脱8min。数据采集时，机器的参数设置如下：电喷雾正离子化(ESI+)检测，扫描范围为m/z 300～m/z2000，干燥气温度350℃，干燥气流速10L/min，辅助气压力50psi，毛细管电压4000V。挑选带电量从2+到4+时间积累为3s的肽前体离子，MALDI-TOP质谱自动采取模式采集强度最高的5个前体峰的MS/MS信息。

[0066] 发明人将其中的干扰性蛋白如角蛋白等排除掉，与健康对照组相比，BC1组上调蛋白有59个(＞1.5)，下调蛋白有12个(＜0.67)其中有显著差异表达的蛋白有71个，包括后续经过验证的具有末端N-乙酰葡萄糖胺糖基的血清转铁蛋白(Serotransferrin)、具有末端N-乙酰葡萄糖胺糖基的血浆蛋白酶C1抑制因子(Plasmaprotease C1 inhibitor)和具有末端N-乙酰葡萄糖胺糖基的丝氨酸蛋白酶抑制剂B4(Serpin B4)。使用Pro QUANT软件系统对筛选的肽段依据同位素报告基因对蛋白质组在其数据库系统中进行蛋白鉴定分析，Quant Ration Script软件系统选择置信度在95％以上的蛋白质同时用m/z115、116、117和114报告离子的峰面积积分进行定量分析。以m/z114为对照，按照115/114、116/114、117/114比值，选择显著差异性结果(P≤0.05)进行报告，以比值＞1.50或＜0.67作为阈值选取差异性蛋白，并作为候选分子的参考范围。

[0067] 为了缩小候选分子的范围，发明人通过查阅大量文献，选择未查到报道与乳腺癌有关的糖蛋白且可购买到抗体的五种蛋白作为进一步验证的对象：Serotransferrin、Vitamin K-dependent protein S、Plasma protease C1 inhibitor、Serpin B4、C4b-bing protein  beta chain。图3、图4和图5显示质谱鉴定到的这五种蛋白多肽中的Serotransferrin、Plasma protease C1 inhibitor和SerpinB4的结果。表2显示后续经过验证的三种蛋白的信息。这三种蛋白在肿瘤患者与健康人之间表达具有显著性差异，相对于健康人，患者血浆中的Plasma protease C1 inhibitor上调，Serotransferrin、Serpin B4下调。BC1/H表示蛋白在BC1组中的表达量与在健康对照组中的表达量的比值；BC2/H和BC3/H同理。

[0068] 表2

[0069]

[0070] 实施例2

[0071] 利用蛋白免疫印迹进一步对上述候选标志物进行验证。

[0072] 为进一步验证这三种蛋白的表达变化，发明人通过Western blot检测19例BC1、9例BC2、8例BC3、4例BC4及12例健康人共52例血浆标本中蛋白的表达变化。对于每一组Western blot实验，选取健康对照H1作为标准，利用WB灰度分析软件对其他各条带进行定量，以密度测定法(densitometry)量化每个蛋白条带。结果如图6所示，Serotransferrin蛋白在Stage1组与健康对照组比较中，其表达下调(与质谱数据是一致)；Plasma protease C1 inhibitor与健康对照组相比，Stage4组表达出现显著下调(与质谱数据不一致)；SerpinB4分别与健康对照组和Stage1组比较，于Stage4组出现显著下调(与质谱数据不一致)。

[0073] 上述出现这三种候选标志物分子的含量的质谱定量结果与Western blot结果一致或不一致的情况，发明人认为，原因可能包括：质谱的检测对象是经AAL2凝集素富集的糖蛋白，为或者主要为具有末端GlcNAc的糖蛋白，而WB直接检测血浆样本中的糖蛋白，为包括非糖基化的蛋白以及各种不同糖结构的糖蛋白。这种不一致暗示具有末端GlcNAc的Plasma protease C1 inhibitor和/或具有末端GlcNAc的Serpin B4的量的变化与乳腺癌的发生发展相关，可以作为潜在的乳腺癌检测标志物。

[0074] 实施例3

[0075] 利用反向凝集素ELISA(Reverse-Lectin ELISA)进一步对上述候选标志物进行验证。以下是Reverse-Lectin ELISA试验流程。

[0076] 制备4μg/ml的AAL2于15mmol/l碳酸钠缓冲溶液中(ph 9.6)，包被ELISA 96孔板，每孔100μl，4℃过夜；次日，弃去包被液，PBST清洗一次；用5％脱脂奶粉封闭液(5％的脱脂奶粉溶于PBST溶液中，pH7.4)每孔300μl封闭孵育，4℃过夜；弃去封闭液，每孔加入300μl洗涤液，洗涤五次，每次3min，将板在滤纸上拍干；PBST稀释适合倍数的血浆标本(根据预实验稀释结果)，每孔加入100μl，室温下孵育1h；弃去样本，每孔加入300μl PBST洗涤液，洗涤五次，每次3min，将板在滤纸上拍干；孵育目的糖蛋白单克隆抗体，根据预实验的抗体稀释倍数选择稀释比例，于室温下孵育1h；去除一抗，每孔加入300μl PBST洗涤液，洗涤五次，每次3min，将板在滤纸上拍干；HRP链霉亲和素(1：1000)每孔100ul加入孔板中孵育1h；去除酶溶液，每孔加入300μl洗涤液，洗涤五次，每次3min，将板在滤纸上拍干；每孔100μlTMB工作液加入板中，反应15min～30min；50ul的终止液(2mol/L硫酸)终止反应，于波长450nm下15min内读板。

[0077] 选取乳腺癌患者血浆标本40例，包括BC1组19例，BC2组9例，BC3组8例，BC4组4例及健康女性血浆20例，每个样本血浆设置3个平行复孔，按照上述预实验条件，通过Reverse lectin ELISA方法对这60例血浆样本中的糖蛋白Serotransferrin、Plasma protease C1 inhibitor和Serpin B4表达水平进行检测。

[0078] 如图7所示，相对于健康对照组，糖基化的Serotransferrin(具有末端GlcNAc的Serotransferrin)的表达在Stage1，Stage2，Stage3，Stage4各组中显著上调，**P＜0.05，***P＜0.01。

[0079] 如图8所示，相对于健康对照组，糖基化的Plasma protease C1 inhibitor(具有末端GlcNAc的Plasma protease C1 inhibitor)的表达在Stage1，Stage2，Stage3，Stage4各组中显著上调，**P＜0.05，***P＜0.01。

[0080] 如图9所示，相对于健康对照组，糖基化的SerpinB4(具有末端GlcNAc的Serpin B4)的表达在Stagel，Stage2，Stage3，Stage4各组中显著下调，**P＜0.05，***P＜0.01。各图中的方块点、三角形点表示各蛋白的reverse Lectin-ELISA实验数据。

[0081] 该示例出现的这三种候选标志物分子在疾病组和健康组样本中的表达量变化与示例1或2中质谱或Western blot结果不一致或者不完全一致的情况，发明人认为，原因可能包括：质谱的检测对象是经AAL2凝集素富集的糖蛋白，为或者主要为具有末端GlcNAc的糖蛋白，而WB直接检测血浆样本中的糖蛋白，为包括非糖基化的蛋白以及各种不同糖结构的糖蛋白，而这里ELISA的检测对象为和AAL2凝集素特异性结合的糖蛋白，主要为具有末端GlcNAc的糖蛋白。这种不一致暗示具有末端GlcNAc的Serotransferrin、Plasma protease C1 inhibitor和/或具有末端GlcNAc的Serpin B4的量的变化与乳腺癌的发生发展相关，可以作为潜在的乳腺癌检测标志物。

[0082] 实施例4

[0083] 取前面示例中的任意10个健康个体和任意20个乳腺癌病患的血浆样本，遮蔽各样本来源个体的信息以及打乱原先的放置位置，分别利用Serotransferrin(蛋白一)、Plasma protease C1inhibitor(蛋白二)和/或SerpinB4(蛋白三)蛋白或蛋白组合作为检测标志物：1)蛋白一，2)蛋白二，3)蛋白三，4)蛋白一和蛋白二，5)蛋白一和蛋白三，6)蛋白二和蛋白三，7)蛋白一、蛋白二和蛋白三；进行以下测定比较：

[0084] 参照示例3的方法(反向AAL2凝集素ELISA)对各样本中的标志物中的各蛋白的表达量进行多次检测，将每个样本获得的某一种蛋白的一组检测值与示例3的健康组样本中的该蛋白的表达量的检测值进行比较，判定样本来自乳腺癌个体还是健康个体。

[0085] 结果表明，检测蛋白或蛋白组合1)-7)的表达量以检测乳腺癌，能够用于乳腺癌诊断或者辅助诊断。具体的，单种蛋白1)-3)各自的检出率均高于80％，分类正确率均不小于70％；蛋白组合型4)-7)，各种蛋白均存在且检测判定结果不冲突的才计，检出率均不小于
55％，分类正确率均大于92％。

[0086] 在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

[0087] 尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。