一种干性年龄相关性黄斑变性灵长类动物模型的诱导方法

摘要

本发明公开了一种干性年龄相关性黄斑变性灵长类动物模型的诱导方法，其是将高糖高脂半流质膳食灌入灵长类动物胃部，诱导灵长类动物产生高胆固醇血症，而得到干性年龄相关性黄斑变性灵长类动物模型。本发明可以量化每个动物每天摄入高糖高脂的数量，并且无口感变化造成动物摄入量不足的担忧，能定时定量的摄入高糖高脂，从而大大加快了高胆固醇血症的形成，同时也加速了干性AMD模型的诱导过程。本发明制作的灵长类干性AMD动物模型具有其他方法诱导的AMD模型无法比拟的优势，可用于抗干性AMD类药物的研发及评价，特别是啮齿类动物模型不适合的生物技术类药物的研发及评价。

权利要求

1.一种干性年龄相关性黄斑变性灵长类动物模型的诱导方法，其特征在于，将高糖高脂半流质膳食灌入灵长类动物胃部，诱导灵长类动物产生高胆固醇血症，而得到干性年龄相关性黄斑变性灵长类动物模型；所述高糖高脂半流质膳食是通过以下方法制备的：按质量比将蔗糖、猪油、胆固醇、胆酸盐＝5～15:5～15:0.5～1.5:0.1～1.0进行混合，加热搅拌均匀乳化制备成半流质状膳食，即为诱导干性年龄相关性黄斑变性灵长类动物模型的高糖高脂半流质膳食；

是将所述的诱导干性年龄相关性黄斑变性灵长类动物模型的高糖高脂半流质膳食按照9.2‑17.2g/kg灵长类动物的体重的量通过鼻饲管灌胃给予，每天一次，每周6天，连续给予15个月；

所述的灵长类动物为食蟹猴。

2.一种用于筛选和评价抗干性年龄相关性黄斑变性药物的方法，其特征在于，根据候选药物的特点，按照一定的剂量和频率给予按照权利要求1 所述干性年龄相关性黄斑变性灵长类动物模型的诱导方法诱导出的干性年龄相关性黄斑变性灵长类动物模型，根据效果评价候选药物是否具有抗干性年龄相关性黄斑变性作用，从而为候选药物提供筛选和/或评价研究结果。

说明书

一种干性年龄相关性黄斑变性灵长类动物模型的诱导方法

技术领域：

[0001] 本发明属于视网膜黄斑病变研究领域，具体涉及一种通过高糖高脂膳食诱导出灵长类动物出现年龄相关性黄斑变性(age‑related macular degeneration，AMD)的方法。背景技术：

[0002] 年龄相关性黄斑变性(age‑related macular degeneration，AMD)是视网膜色素上皮细胞和神经视网膜退行性病变造成的一种视力下降或丧失的不可逆性疾病，多发生于50岁以上的中老年人，双眼先后或者同时发病，视力出现进行性损伤，是一种严重威胁中老年人视功能的眼底疾病。据报道，西方国家由于老年化较早，AMD已经发展为第一位的致盲性疾病，亚洲国家由于老年化进程稍迟于西方国家，该病的发病率目前尚低于西方国家，但随着人口老龄化的逐渐增大，AMD在亚洲国家，特别是中国的发病率也呈现逐年增高的趋势。由于AMD发病原因较多，具体的病因很难判定，目前的治疗手段也比较有限，绝大多数AMD现在尚无非常有效的治疗手段，现在已经发展为眼科疾病中的难治性疾病，也是目前眼科疾病中研究的热点和眼科药物研发主要攻克的难点。根据发病的性质不同，AMD可分为干性AMD和湿性AMD，通常将有软性玻璃膜疣、色素异常和地图样萎缩的AMD称作干性AMD，大部分患者为干性AMD，约占AMD总发病人数的80～90％；通常将有脉络膜新生血管、视网膜色素上皮细胞脱离或盘状纤维化的AMD称为湿性或新生血管性AMD，湿性AMD患者约占总发病人数的10～20％，通常女性多于男性。

[0003] AMD发病的因素较多，如年龄、性别、遗传、药物、眼部因素、心血管疾病、血脂水平、糖尿病、环境因素等均与AMD的发病相关。除年龄因素之外，AMD的发病并无明确的诱因，因此，在日常生活中非常难以提前防范。治疗方面，目前用于AMD治疗的手段比较有限，用于治疗的药物有抗新生血管内皮因子类的药物(目前主要有Lucentis、Macugen和小干扰RNA，能够阻止新生血管的形成和血管内皮细胞的增殖，从而使血管渗漏得到有效的干预和控制)、皮质类固醇激素(主要有曲安奈德注射液，该类药物具有抑制形成新生血管、抑制炎症反应、稳定血视网膜屏障、抗增殖、减轻血管渗漏等作用)、抗氧化维生素药物(主要有维生素C和E以及胡萝卜素，该类药物具有抗氧化、抑制脂质过氧化反应从而产生显著的抑制作用)、血管他汀类药物(该类药物能够对内源性的胆固醇产生抑制作用，并促进限速酶还原酶的合成，降低细胞当中胆固醇的合成，稳定粥样斑块，阻断疾病的进展)、中药辨证治疗等。此外，还有非药物的手术疗法、光动力疗法等。前述药物和方法多数用于湿性AMD的治疗，对于干性AMD的治疗手段尚比较有限。

[0004] 虽然治疗AMD的方法和药物有一定的选择空间，但总体上来说，上述疗法对AMD的治疗作用非常有限，现急需开发出针对AMD的特效药物来缓解众多的AMD患者的痛苦，改善他们的生活质量。众所周知，良好药物的研发离不开良好的疾病动物模型，目前用于抗AMD药物研发的动物模型多数为各种方法诱导的湿性AMD模型，如激光法诱导的湿性AMD模型(小鼠、大鼠、猪、猴)，该类模型与人类湿性AMD有一定的相似性，但该模型伴有视网膜的损伤，这在人类中是不存在的，且其病因与人类AMD的成因也相距较远。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导的AMD模型，该模型没有基底膜沉淀物、玻璃膜疣、RPE脱离和视网膜下出血等人类脉络膜新生血管的表现，且bFGF不稳定，体内半衰期短；血管内皮生长因子(VEGF)诱导的AMD模型，该模型成模率高，但模型不存在AMD相应视网膜变性，Bruch膜也无沉积物形成；此外，还有视网膜下注射自体玻璃体诱导的AMD模型、脂质过氧化物诱导AMD模型以及通过基因修饰获得的AMD模型，前述模型多数可对动物视网膜造成一定的损害，但与人类AMD尚存在一定的差距。并且多数的AMD模型均为湿性AMD模型，干性AMD模型研究报道相对较少，而临床上干性AMD的发病率远高于湿性AMD，干性AMD模型的研究远不能满足临床的需求。在生物技术突飞猛进的今天，由于药物的特异性(如生物技术类药物具有动物种属的高度选择特异性)上述模型已经不能完全满足药物研发的需求。因此，建立与人类干性AMD发病相似的动物模型对新型抗AMD药物的研发具有非常重要的意义。

[0005] 随着社会的进步和物质生活水平的提高，人类膳食结构发生了较大的改变，从以素食为主逐渐过渡到以高脂、高糖为主的膳食结构。由于物质生活水平的提高，高脂高糖的大量摄入，疾病的发生发展也发生了相应的变化，而AMD发病诱因之一就是高脂饮食和心血管疾病，有学者认为高血脂在诱发血管疾病的时候也会在脉络膜上沉积，从而形成AMD。目前尚无使用高脂膳食方法诱导食蟹猴干性AMD的报道，本研究根据高脂致病理论，采用高脂膳食的方法诱导出食蟹猴干性AMD。由于灵长类动物生性顽劣，在摄食时喜爱用饲料玩耍。在模型的复制过程中若将高脂成份混入饲料之中，多数的饲料将被食蟹猴玩耍丢弃而浪费，不能准确的计算每个动物每天摄入的饲料数量，无法量化。且由于饲料含热量较高，且饲料本身的口感发生了较大的变化，动物在摄入一定量的饲料后会有饱涨感，出于自我保护的作用，动物会停止摄入更大量的饲料，导致高脂的摄入量会相对减少，从而使得造模时间大大延长。
发明内容：

[0006] 本发明的第一个目的是提供一种灵长类动物干性AMD模型的诱导方法，其是将高脂高糖半流质膳食灌入灵长类动物的胃部，诱导灵长类动物产生高胆固醇血症，日久而得到灵长类动物干性AMD模型，所述高脂高糖半流质膳食是通过以下方法制备的：按质量比将蔗糖、猪油、胆固醇、胆酸盐＝5～15:5～15:0.5～1.5:0.1～1.0进行混合，加热搅拌均匀乳化制备成半流质状膳食，即为诱导灵长类动物AMD模型的高脂高糖半流质膳食。

[0007] 作为一种优选技术方案，所述诱导方法是将所述的诱导干性年龄相关性黄斑变性灵长类动物模型的高糖高脂半流质膳食按照9.2‑17.2g/kg灵长类动物的体重的量通过鼻饲管灌胃给予，每天一次，每周6天，连续给予15个月，可诱导出食蟹猴干性AMD模型，并伴有高胆固醇血症。

[0008] 作为一种优选技术方案，所述的灵长类动物优选为食蟹猴。

[0009] 本发明的第二个目的是提供一种用于筛选和评价抗干性年龄相关性黄斑变性药物的方法，其是根据候选药物的特点，按照一定的剂量和频率给予按照所述干性年龄相关性黄斑变性灵长类动物模型的诱导方法诱导出的干性年龄相关性黄斑变性灵长类动物模型，根据效果评价候选药物是否具有抗干性年龄相关性黄斑变性作用，从而为候选药物提供筛选和/或评价研究结果。

[0010] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

[0011] (1)本发明诱导出灵长类动物干性AMD模型的高脂高糖半流质膳食中使用的糖类和脂肪分别为人类日常生活中摄入量比较大的蔗糖、猪油、胆固醇和胆酸盐，将上述四种物质按一定的比例混合，制备成半流质膳食，将其通过鼻饲管将其灌入灵长类动物胃部，可使灵长类动物按照体重、被动地按照一定的时间和频率精准的摄入上述高脂高糖混合物，模拟人类因物质生活条件提高而导致的饮食失节而产生疾病。

[0012] (2)本发明可以量化每个动物每天摄入高脂高糖的数量，并且可解除动物因摄入物口感变化造成饲料摄入量不足的担忧，能定时定量的摄入高脂高糖，从而大大加快了高胆固醇血症的形成，同时也加速了干性AMD模型的诱导过程。本发明制作的灵长类干性AMD动物模型具有其他方法诱导的AMD模型无法比拟的优势，可用于抗干性AMD类药物的研发及评价，特别是啮齿类动物模型不适合的生物技术类药物的研发及评价。附图说明：

[0013] 图1从左至右依次为阴性组动物造模前、造模7月、15月眼底照片(A01号)；

[0014] 图2从左至右依次为低糖低脂组动物造模前、造模7月、15月眼底照片(B01号)；

[0015] 图3从左至右依次为低糖高脂组动物造模前、造模7月、15月眼底照片(C01号)；

[0016] 图4从左至右依次为高糖低脂组动物造模前、造模7月、15月眼底照片(D01号)；

[0017] 图5从左至右依次为高糖高脂组动物造模前、造模7月、15月眼底照片(E01号)。具体实施方式：

[0018] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

[0019] 实施例1：

[0020] 1.实验材料

[0021] 1.1蔗糖：500g/瓶，分析纯，西陇化工。

[0022] 1.2猪油：15kg/桶，食品级，海南省鼎升食品有限公司。

[0023] 1.3胆固醇：500g/瓶，分析纯，上海博奥生物科技有限公司。

[0024] 1.4胆酸盐：500g/瓶，分析纯，天津市恒兴化学试剂制造有限公司。

[0025] 1.5食蟹猴：10‑18岁，29只雄性，普通级，从广东蓝岛生物技术有限公司购入，购入前预先排除近视、眼底有病变的动物。

[0026] 1.6甘油三酯测定试剂盒，浙江伊利康生物技术有限公司。

[0027] 1.7胆固醇测定试剂盒，浙江伊利康生物技术有限公司。

[0028] 1.8高密度脂蛋白测定试剂盒：浙江伊利康生物技术有限公司。

[0029] 1.9低密度脂蛋白测定试剂盒：浙江伊利康生物技术有限公司。

[0030] 2.主要仪器

[0031] 2.1 7020生化分析仪：7020型，日本日立公司。

[0032] 2.2手持式眼底照相机：型号为GENESIS‑Df，生产厂家为Kowa Company.Ltd。

[0033] 3.实验方法

[0034] 3.1半流质高脂高糖膳食的制备：蔗糖、猪油、胆固醇、胆酸盐按质量百分比为下述比例混合：猪油、蔗糖、胆固醇、胆酸盐＝5～15:5～15:0.5～1.5:0.1～1.0进行混合，加热至约70摄氏度，搅拌均匀乳化，即制备成半流质状膳食，即为诱导灵长类动物AMD模型同时伴有高胆固醇血症的高糖高脂半流质膳食。

[0035] 3.2选取正常的10‑18岁的雄性中老年食蟹猴29只，按体重随机分为5组，分别为阴性对照组、低脂低糖组、低脂高糖组、高脂低糖组、高脂高糖组，阴性组5只动物，其余各组6只。高脂高糖组膳食质量比配方为：猪油、蔗糖、胆固醇、胆酸盐＝10：10：1：0.5，将各组份按其含量混合均匀，加热至约70摄氏度，搅拌均匀乳化即得，膳食给予量为17.2g/kg；低脂高糖组膳食质量比配方为：猪油、蔗糖、胆固醇、胆酸盐＝5：10：1：0.5，将各组份按其含量混合均匀，加热至约70摄氏度，搅拌均匀乳化即得，膳食给予量为13.2g/kg；高脂低糖组膳食质量比配方为：猪油、蔗糖、胆固醇、胆酸盐＝10：5：1：0.5，将各组份按其含量混合均匀，加热至约70摄氏度，搅拌均匀乳化即得，膳食给予量为13.2g/kg；低脂低糖组膳食质量比配方为：猪油、蔗糖、胆固醇、胆酸盐＝5：5：1：0.5，将各组份按其含量混合均匀，加热至约70摄氏度，搅拌均匀乳化即得，膳食给予量为9.2g/kg；各试验组动物分组后按照设定的方案灌胃给予高脂高糖膳食，每天一次，每周6天，连续15个月。按要求测定食蟹猴眼底病变情况和空腹胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL‑C)、低密度素质蛋白(LDL‑C)等指标。

[0036] 眼底病变观察方法：将食蟹猴麻醉后固定头部，手动分离猴眼睑，阿托品滴眼液散瞳，然后再用手持式眼底照相机观察眼底病变情况并保存眼底照片。

[0037] 血脂测定方法：食蟹猴使用氯胺酮麻醉后，从头静脉和/或隐静脉采血约2.0ml，离心后取血清，用日立7020生化分析仪测定。

[0038] 4.实验结果

[0039] 4.1眼底病变研究结果(具体见图1～5)：造模前各实验组视盘大小相近，边界清晰；视网膜动脉、静脉比约为2:3，动静脉管径均匀、形态和颜色未见明显异常、未见搏动及交叉压迫征；黄斑及中央凹反射未见明显异常；视网膜未见出血、渗出、色素增生或脱失。各试验组动物造模前眼底未见明显差异。造模7个月之后，与造模前相比，阴性对照组眼底结构未见明显差异；低糖低脂组有3例动物、低糖高脂组有2例动物、高糖低脂组有3例动物、高糖高脂组有1例动物眼底黄斑区域出现不均匀的色素点，呈灰色反光，色素点直径较小，约0.5‑2mm不等，眼底其他结构变化不明显。造模15个月之后，与造模前相比，阴性对照组眼底结构未见明显改变，低糖低脂组、低糖高脂组、高糖低脂组、高糖高脂组分别有5、3、5、2例动物眼底结构发生改变，黄斑区域出现不均匀的色素点，部分呈灰色反光，色素斑点较小，约
1‑2mm，部分圆斑色素脱离，有金箔样反光，圆斑直径可达到3‑4mm，部分动物甚至出现脉络膜变白，血管变细，视盘色淡等，上述眼底改变以低糖低脂组和高糖低脂组最为明显，低糖高脂组其次，高糖高脂组再次。

[0040] 4.2胆固醇研究结果表明(具体见表1～2)：与阴性对照组相比，造模1月，各实验组胆固醇水平均有一定程度的升高，均具有统计学差异(P<0.05或0.01)，但无生物学意义。造模3‑13月后各试验组食蟹猴血清胆固醇含量均明显升高，有统计学意义(P<0.01)和生物学意义。

[0041] 表1食蟹猴血浆胆固醇含量变化表

[0042]

[0043] 与阴性对照组相比，*表示P<0.05,**表示P<0.01

[0044] 表2食蟹猴血浆胆固醇含量变化表

[0045]

[0046] 与阴性对照组相比，*表示P<0.05,**表示P<0.01

[0047] 4.3甘油三酯研究结果表明(具体见表3～4)：造模1‑3月，与阴性对照组相比，各试验组食蟹猴血清TG水平均未见明显升高，未见统计学差异(P>0.05)。低糖低脂组和高糖高脂组造模5月血清TG水平升高，有统计学差异(P<0.05)，低糖低脂组、高糖低脂组造模5月血清TG水平未见明显改变。造模7月后，各试验组血清TG水平未见明显改变；造模9‑13月各试验组食蟹猴TG水平均有不同程度的升高，有统计学差异(P<0.05或0.01)，但由于TG水平总体较低，因此，可判断无生物学意义。

[0048] 表3食蟹猴血浆甘油三酯含量变化表

[0049]

[0050] 与阴性对照组相比，*表示P<0.05,**表示P<0.01

[0051] 表4食蟹猴血浆甘油三酯含量变化表

[0052]

[0053] 与阴性对照组相比，*表示P<0.05,**表示P<0.01

[0054] 4.4高密度脂蛋白胆固醇研究结果(具体见表5～6)：与阴性对照组相比，造模1‑3月，各试验组食蟹猴血清HDL‑C含量明显升高，有统计学差异(P<0.05)；造模5‑13月，各试验组食蟹猴血清HDL‑C含量未见明显升高，未见统计学差异(P>0.05)。

[0055] 表5食蟹猴血浆高密度脂蛋白胆固醇含量变化表

[0056]

[0057]

[0058] 与阴性对照组相比，*表示P<0.05,**表示P<0.01

[0059] 表6食蟹猴血浆高密度脂蛋白胆固醇含量变化表

[0060]

[0061] 与阴性对照组相比，*表示P<0.05,**表示P<0.01

[0062] 4.5低密度脂蛋白胆固醇研究结果(具体见表7～8)：与阴性对照组相比，造模1月，各实验组食蟹猴血清LDL‑C水平均有一定程度的升高，均具有统计学差异(P<0.05或0.01)，但无生物学意义。造模3‑13月后各试验组食蟹猴血清LDL‑C含量均明显升高，有统计学意义(P<0.01)和生物学意义，且各试验组食蟹猴血清LDL‑C随着造模时间的延长而逐渐升高。

[0063] 表7食蟹猴血浆低密度脂蛋白胆固醇含量变化表

[0064]

[0065] 与阴性对照组相比，*表示P<0.05,**表示P<0.01

[0066] 表8食蟹猴血浆低密度脂蛋白胆固醇含量变化表

[0067]

[0068]

[0069] 与阴性对照组相比，*表示P<0.05,**表示P<0.01

[0070] 根据前述研究结果可知，本发明的低糖低脂组、低脂高糖组、高糖低脂组、高糖高脂组都可成功的诱导出灵长类动物AMD模型，但低糖低脂和高糖低脂组发病率最高，诱导13个月干性AMD发病率可达到80％以上，其次为低糖高脂组，诱导13个月后干性AMD发病率可达50％以上，再次为高糖低脂组和高糖高脂组，诱导13个月后干性AMD发病率可达到30％以上，本发明中的干性AMD模型均伴有不同程度的高胆固醇血症。根据前述研究结果还可判断，脂肪(胆固醇、猪油、胆酸盐)的摄入对于食蟹猴胆固醇的升高具有决定性的影响，但脂肪的摄入量与AMD的形成并非呈现正相关，而是脂肪和糖按照一定的比例摄入对AMD的形成影响最大。即当蔗糖、猪油、胆固醇、胆酸盐的给药比例为4g‑8g：4g：0.8g：0.4g/kg时，食蟹猴最容易形成干性AMD。