一种好氧反硝化细菌及其应用

摘要

本发明公开了一种好氧反硝化细菌及其应用。本发明好氧反硝化细菌(Antarcticibacterium flavum)JB01H24，在分类学上属于拟杆菌门(Bacteroidetes)、黄杆菌科(Flavobacteriaceae)，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC No.60227，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2017年8月31日。本发明好氧反硝化细菌(Antarcticibacterium flavum)JB01H24在硝态氮初始浓度为14mg/L的脱氮培养基中180rpm、28℃培养72h后，对硝态氮的去除率大于95％，因此本发明好氧反硝化细菌(Antarcticibacterium flavum)JB01H24可用于处理氮氧化物，对脱氮技术发展具有重要意义。

权利要求

1.一种好氧反硝化细菌(Antarcticibacterium flavum)JB01H24，在分类学上属于拟杆菌门(Bacteroidetes)、黄杆菌科(Flavobacteriaceae)，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC No.60227，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2017年8月31日。

2.权利要求1所述好氧反硝化细菌(Antarcticibacterium flavum)JB01H24在处理氮氧化物中的应用。

3.根据权利要求2所述好氧反硝化细菌(Antarcticibacterium flavum)JB01H24的应用，其特征在于，将所述好氧反硝化细菌(Antarcticibacterium flavum)JB01H24在以硝态氮为唯一氮源的脱氮培养基中180rpm、28℃培养72h后，对硝态氮的去除率大于95％。

说明书

一种好氧反硝化细菌及其应用

技术领域

[0001] 本发明属微生物及环境科学技术领域，更具体地说，本发明涉及一种新型的好氧反硝化细菌(Antarcticibacterium flavum)JB01H24及其在处理氮氧化物中的应用。

背景技术

[0002] 随着工农业的发展和人类活动的加剧，大量氮素通过各种途径进入水体，导致水体氮素污染日益严重，危害生态系统安全、环境安全和人类健康。因此，水体脱氮已成为目前水处理研究的热点和重点。

[0003] 目前，在环境工程和污水/废水处理领域，微生物脱氮技术已成为应用最为广泛的脱氮技术，具有低成本、高效率、易操作、无二次污染、副产物无毒、选择性强等特点，极具发展潜力，受到国内外的广泛关注和认可。

[0004] 传统上认为，反硝化反应是在厌氧条件下实现的(因为氧气是比硝酸盐和亚硝酸盐更好的电子受体)。近来，随着好氧反硝化菌的发现，人们认识到反硝化反应在好氧和厌氧条件下均可进行。好氧反硝化菌株及其脱氮能力有助于突破传统技术的限制，简化脱氮工艺环节。因此，从自然界分离新型、高效的好氧反硝化菌，对脱氮技术和工艺的发展具有重要意义。

[0005] 目前已报道过的好氧反硝化细菌分别属于Pseudomonas、Alcaligenes、Paracoccus、Bacillus、Citrobacter、Hyphomicrobium、Klebsiella、Mesorhizobium、Rhodococcus、Thiobacillus、Zoogloea、Comamonas、Enterobacter、Magnetospirillum、Microvirgula、Nitrosomonas、Ochrobactrum、Psychrobacter、Rhodospirillum、Sphingomonas、Thauera等属。目前黄杆菌科中尚未发现好氧反硝化菌。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于：根据目前缺乏新型高效的好氧反硝化菌，提供一种从自然界分离的、新型的好氧反硝化细菌(Antarcticibacterium flavum)JB01H24及其应用。

[0007] 为了实现上述发明目的，本发明提供了一种从南极罗斯海海洋沉积物中分离筛选得到的好氧反硝化细菌(Antarcticibacterium flavum)JB01H24，在分类学上属于拟杆菌门(Bacteroidetes)、黄杆菌科(Flavobacteriaceae)，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC No.60227，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2017年8月31日。

[0008] 本发明好氧反硝化细菌(Antarcticibacterium flavum)JB01H24的生物学特征为：革兰氏染色阴性、好氧、不能滑行运动、呈杆状或短杆状；在Marine Agar平板上的菌落呈黄色、圆形、中凸、半透明、边缘整齐；能在4～40℃，pH 7.0～9.0，0～8％NaCl(w/v)下生长。

[0009] 本发明好氧反硝化细菌(Antarcticibacterium flavum)JB01H24可在Marine Agar培养基、Marine Broth培养基、216L培养基(乙酸钠1g，硝酸铵0.2g，柠檬酸钠0.5g，普通肉汤培养基0.5g，蛋白胨10g，酵母提取物2g，海水1L，pH 7.5)等多种培养基中生长。

[0010] 本发明好氧反硝化细菌(Antarcticibacterium flavum)JB01H24的16S rRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。在NCBI/GenBank数据库中，其16S rRNA基因序列在目前已分离得到的细菌中，与Flavobacterium sp.V4.BS.09具有最高的相似性(97％)。

[0011] 本发明好氧反硝化细菌(Antarcticibacterium flavum)JB01H24在以硝态氮为唯一氮源的脱氮培养基中180rpm、28℃培养72h后，对硝态氮的去除率大于95％，因此，可用于处理氮氧化物。

[0012] 相对于现有技术，本发明具有如下优点：

[0013] 本发明发现了一种新的好氧反硝化细菌(Antarcticibacterium flavum)JB01H24，在硝态氮初始浓度为14mg/L的脱氮培养基中180rpm、28℃培养72h后，对硝态氮的去除率大于95％，因此本发明好氧反硝化细菌(Antarcticibacterium flavum)JB01H24可用于处理氮氧化物，对脱氮技术发展具有重要意义。

[0014] 保藏信息：好氧反硝化细菌(Antarcticibacterium flavum)JB01H24，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC No.60227，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2017年8月31日。

附图说明

[0015] 下面结合附图和具体实施方式，对本发明以及有益效果进行详细说明。

[0016] 图1为本发明好氧反硝化细菌(Antarcticibacterium flavum)JB01H24细胞的透射电镜照片。

[0017] 图2为本发明好氧反硝化细菌(Antarcticibacterium flavum)JB01H24及相近菌株的系统进化树；其中，分别使用NJ法和ML法建树，以NJ法为蓝本作图，以黑色圆圈表示ML树中一致的分支，图中仅显示＞70％的bootstrap系数(重复1000次)。

[0018] 图3为本发明好氧反硝化细菌(Antarcticibacterium flavum)JB01H24极性脂双向展层图；其中，PE为磷脂酰乙醇胺，AL为氨脂；APL,氨基磷酸脂；L,未知极性脂。

具体实施方式

[0019] 为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明，实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。若无特别说明，实施例中所述方法均为常规方法，所用试剂均为常规试剂或按常规方式配制的试剂。

[0020] 实施例1好氧反硝化细菌(Antarcticibacterium flavum)JB01H24的分离

[0021] 海洋沉积物样品采集自南极罗斯海海域(165°34'9.84"E,77°35'17.88"S)，水深774m。1g沉积物样品(湿重)加入到10mL无菌海水中，充分震荡混匀，采用标准的稀释涂布法将悬浮液稀释液涂布到Marine Agar 2216(MA，BDDifco)平板上，置于4℃培养1个月；然后从平板上挑取菌落并划线纯化，所得菌株JB01H24的细胞透射电镜照片如图1所示。

[0022] 纯化后的菌株JB01H24分别作甘油管(-80℃)和冻干管(4℃)保藏。实验发现，菌株JB01H24一般使用Marine Agar或Marine Broth 2216(MB，BDDifco)培养，培养温度为25～28℃。

[0023] 实施例2好氧反硝化细菌(Antarcticibacterium flavum)JB01H24的鉴定

[0024] 采用CTAB法提取实施例1所得菌株JB01H24的基因组：使用27F和1492R引物扩增其16S rRNA基因，并连接到克隆载体PCR2.1上。测序后得到的16SrRNA序列长度为1482bp，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。使用MEGA 7.0.25、Kimura 2-parameter模型、NJ和ML算法建树(bootstrap重复1000次)，最终得到的进化树结果如图2。鉴定结果：实施例1分离得到的菌株JB01H24是一个新属，定名为Antarcticibacterium，是该属细菌的模式种；该菌株还是一个新种，定名为Antarcticibacterium flavum，是该种细菌的模式种模式株，该菌株的全称定名为：好氧反硝化细菌(Antarcticibacterium flavum)JB01H24。

[0025] 在EzBioCloud数据库中，好氧反硝化细菌(Antarcticibacterium flavum)JB01H24的16S rRNA基因序列与Gillisia mitskevichiae DSM 19839T具有最高的相似性T(95.3％)，接下来依次是Salinimicrobium soli CAU 1287 (94.9％),Salinimicrobium gaetbulicola BB-My20T(94.8％),Salinimicrobium sediminis JC207T(94.7％),Salinimicrobium marinum KMM 6270T(94.7％),Gillisia marina CBA3202T(94.6％),Gillisia myxillae UST050418-085T(94.5％),Gillisia hiemivivida IC154T(94.4％),T T
Salinimicrobium xinjiangense BH206 (94.3％),Gillisia limnaea DSM 15749
(94.2％),Salinimicrobium terrae YIM C338T(94.1％)和Salinimicrobium catena HY1T(94.0％)等。

[0026] 在MA平板、25℃培养5天后，通过如下方式鉴定其生物学特征：

[0027] 观察好氧反硝化细菌(Antarcticibacterium flavum)JB01H24的菌落形态；

[0028] 使用电子显微镜(H7650,Hitachi)观察好氧反硝化细菌(Antarcticibacterium flavum)JB01H24的菌株细胞形态；

[0029] 使用环凯公司(HKM)革兰氏染色试剂盒对细胞进行染色；

[0030] 采用穿刺培养法和厌氧袋(MGC，Mitsubishi)测定好氧反硝化细菌(Antarcticibacterium flavum)JB01H24的需氧类型；

[0031] 采用Bernardet所述方法检测好氧反硝化细菌(Antarcticibacterium flavum)JB01H24的细胞滑行运动能力(Bernardet JF&Nakagawa Y等，2002)；

[0032] 使用环凯公司(HKM)氧化酶试剂盒检测好氧反硝化细菌(Antarcticibacterium flavum)JB01H24的细胞氧化酶活性；

[0033] 使用3％H2O2检测好氧反硝化细菌(Antarcticibacterium flavum)JB01H24的的接触酶活性；

[0034] 使用BIOLOG  GEN III和API  ZYM、20E、20NE试剂条检测好氧反硝化细菌(Antarcticibacterium flavum)JB01H24的生理生化特征；

[0035] 使用气相色谱法和Sherlock Microbial Identification System(MIDI)系统鉴定好氧反硝化细菌(Antarcticibacterium flavum)JB01H24的脂肪酸成分；

[0036] 使用双向展层法检测极性脂成分(Tindall BJ&Sikorski J等，2007；Minnikin DE&O'donnell AG等，1984)；

[0037] 使用HPLC检测醌型(Collins MD&Pirouz T等，1977；Hiraishi A&Ueda Y等，1996)和G+C含量(Mesbah M&Premachandran U等，1989)。

[0038] 鉴定得到的生物学特征如下：好氧反硝化细菌(Antarcticibacterium flavum)JB01H24在MA平板上，菌落呈黄色，圆形，中凸，半透明，边缘整齐；细胞专性好氧，不能滑行运动，使用革兰氏染色试剂盒(环凯)对细胞进行染色，其为革兰氏阴性，呈杆状，长约1-2μm，宽约0.6-0.9μm(图1)；能在4-40℃(最适温度25-30℃)，pH 7.0-9.0(最适pH 7.5-8.0)，NaCl(w/v)浓度0-8％(最适盐浓度3％)下生长；水解Tween 20，Tween 80和明胶；不水解淀粉、酪蛋白、木聚糖、纤维素和L-酪氨酸；碱性磷酸酶，酯酶(C4)，酯酶-脂肪酶(C8)，脂肪酶(C14)，亮氨酸芳香基酰胺酶，缬氨酸芳香基酰胺酶，胱氨酸芳香基酰胺酶，胰蛋白酶，α-胰凝乳蛋白酶，酸性磷酸酶，萘酚-AS-Bl-磷酰胺酶，α-葡萄糖苷酶，β-半乳糖苷酶为阳性；N-acetyl-β-氨基葡萄糖苷酶为弱阳性；α-半乳糖苷酶，β-葡萄糖醛酸酶，β-葡萄糖苷酶，α-甘露糖苷酶，α-岩藻糖苷酶，精氨酸双水解酶，赖氨酸脱羧酶，鸟氨酸脱羧酶，脲酶，色氨酸脱氨酶，明胶酶为阴性；能利用蜜二糖，阿拉伯糖，葡萄糖，甘露醇，肌醇，山梨糖醇，鼠李糖，蔗糖，苦杏仁苷，产H2S，吲哚和羟基丁酮；利用柠檬酸钠，L-阿拉伯糖，N-乙酰氨基葡萄糖，葡萄糖酸钾，癸酸，己二酸，苹果酸，苯乙酸，糊精，D-麦芽糖，D-海藻糖，龙胆二糖，蔗糖，水苏糖，D-水杨苷，α-D-葡萄糖，D-甘露糖，D-果糖，D-半乳糖，明胶，L-天冬氨酸，吐温40，乙酰乙酸和乙酸；微弱地利用D-纤维二塘，D-棉子糖，α-D-乳糖，D-蜜二糖，N-acetyl-β-D-甘露糖胺，N-乙酰-D-半乳糖胺，D-甘露醇，L-精氨酸和L-谷氨酸；不能利用D-松二糖，β-甲基-D-葡萄糖苷，N-乙酰-D-葡萄糖胺，N-乙酰-神经氨酸，3-甲基-葡萄糖，D-海藻糖，L-海藻糖，L-鼠李糖，肌苷，D-山梨醇，D-阿拉伯糖醇，m-肌醇，甘油，D-葡萄糖-6-磷酸，D-果糖-6-磷酸，D-天冬氨酸，D-丝氨酸，氨基乙酰基-L-脯氨酸，L-丙氨酸，L-组氨酸，L-焦谷氨酸，L-丝氨酸，果胶，D-半乳糖醛酸，L-半乳糖酸内酯，D-葡萄糖酸，D-葡萄糖醛酸，葡萄糖醛酰胺，粘液酸，金鸡纳酸，D-糖质酸，p-羟基-苯乙酸，甲基丙酮酸酯，D-乳酸甲酯，L-乳酸，柠檬酸，α-keto-戊二酸，D-苹果酸，L-苹果酸，溴代琥珀酸，γ-氨基丁酸，α-羟基-丁酸，β-羟基-D,L-丁酸，α-keto-丁酸，丙酸和甲酸.；基因组DNA G+C含量为42.4mol％。

[0039] 表1为好氧反硝化菌(Antarcticibacterium flavum)JB01H24及其相近菌株的生理生化差异表，其中，1为好氧反硝化菌(Antarcticibacterium flavum)JB01H24，2为Gillisia limnaea DSM 15749T；3为Salinimicrobium catena HY1T。+，阳性；-，阴性；w，弱阳性。

[0040] 表1

[0041]

[0042]

[0043] 表2为好氧反硝化菌(Antarcticibacterium flavum)JB01H24及其相近菌株的脂肪酸成分差异表，其中，1为好氧反硝化菌(Antarcticibacterium flavum)JB01H24，2为Gillisia limnaea DSM 15749T；3为Salinimicrobium catena HY1T。tr表示微量成分(＜1％)，nd表示未检出。

[0044] 表2

[0045]

[0046]

[0047] 实施例3好氧反硝化菌(Antarcticibacterium flavum)JB01H24的脱氮效率研究[0048] 按1％的接种量在脱氮培养基中接入好氧反硝化细菌(Antarcticibacterium flavum)JB01H24，28℃，180rpm培养5d，分别在0h、4h、8h、12h、16h、24h、32h、40h、48h、60h、72h、96h、120h时取样，测定培养OD，并检测NO3-(麝香草酚比色法)，结果如图3。

[0049] 其中，脱氮培养基包括如下组分：2g KNO3，2.5g琥珀酸钠，2.5g柠檬酸钠，1g K2HPO4、1g KH2PO4、0.2g MgSO4·7H2O，330mL海水，加双蒸水至1L，调pH至7.4，湿热灭菌，使用前加1/50复合碳源，1/500复合维生素液，1/1000复合微量元素混合液。

[0050] 微量微量元素混合液制备方法如下：将ZnSO4·7H2O 0.1g，MnCl2·4H2O 0.4g，H3BO3 1.24g，CoCl2·6H2O 0.5g，CuCl2·2H2O，0.5g，NiCl2·6H2O 0.02g，Na2MoO4·2H2O 0.4g，KI 0.2g，CaCl2 5g，FeSO4·7H2O 1.1g，EDTA-Na 10g混合、过滤除菌。

[0051] 复合维生素液制备方法如下：将生物素10mg，叶酸100mg，吡哆醇100mg，硫胺素200mg，烟酸200mg，泛酸钙100mg，维生素B12 2mg，核黄素20mg，硫辛酸20mg，Na-EDTA 400mg混合，调pH至7.5，过滤除菌。

[0052] 复合碳源制备方法如下:将D-葡萄糖6.9g，D-果糖6.9g，D-乳糖6.9g，乙酸钠9.5g，90％乳酸6.4mL，甘露醇7g，乙醇7mL，甘油6.3mL，苯甲酸钠4.8g，水杨酸4.6g混合溶于500mL水，调pH至7.4，过滤除菌。

[0053] 由图3可见，好氧反硝化细菌(Antarcticibacterium flavum)JB01H24的极性脂主要包括PE、2种氨脂、1种磷酸氨脂和7种未知极性脂。

[0054] 根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。