包含从鱼类的精液或精巢分离出来的DNA片段混合物的缺血性肠炎的预防或治疗用组合物

摘要

本发明涉及包含从鱼类的精液或精巢分离出来的DNA片段混合物的缺血性肠炎的预防或治疗用组合物，证实了本发明的组合物对缺血性肠炎的预防或治疗具有优异的效果。另外，证实了本发明的缺血性肠炎预防或治疗用组合物在长期给药时也安全且几乎没有副作用。因此，可以期待利用本发明的缺血性肠炎预防或治疗用组合物开发安全无副作用且治疗效果优异的缺血性肠炎治疗剂，从而对于缺血性肠炎治疗有大的帮助。

权利要求

1.一种缺血性肠炎的预防或治疗用组合物，其特征在于，包含DNA片段混合物作为有效成分，所述DNA片段混合物是从鱼类的精液或精巢分离出来的，所述DNA片段混合物的分子量为50kDa至l500kDa。

2.根据权利要求1所述的缺血性肠炎的预防或治疗用组合物，其特征在于，所述鱼类属于鲑科。

说明书

包含从鱼类的精液或精巢分离出来的DNA片段混合物的缺血

性肠炎的预防或治疗用组合物

技术领域

[0001] 本发明涉及包含从鱼类的精液或精巢分离出来的DNA片段混合物的缺血性肠炎的预防或治疗用组合物。

背景技术

[0002] 随着工业社会的发展，由于各种压力和环境因素，消化道系统疾病的患者有增加的趋势。作为在消化道系统中多发的疾病，有缺血(ischemic)，它是指由血管收缩或闭塞所诱发的向身体器官、组织或部位的血液供给减少的状态。缺血后发生血液的再灌注(reperfusion)，从而引起神经细胞损伤等多种后遗症。缺血最终形成非可逆性的损伤，即细胞及组织的坏死，可能发生缺血性肠炎之类的疾病。

[0003] 缺血性肠炎(ischemic colitis，IC)是累及大肠的血管性疾病中的最常见的一种疾病，约占所有缺血性胃肠道疾病的50～60％(Suh D.C.等人，2 007)。缺血性肠炎在不严重的情况下为腹痛和腹泻之类的非特异性症状，大多在去医院之前症状得到好转，有的在去医院的情况下，大致以出血性腹泻和腹痛为主要症状，但是用保守性治疗大多能够得到好转。

[0004] 缺血性肠炎的病因大部分难确定，主要在老年人中肠系膜动脉由于血栓症或栓塞症而堵塞，或者由于心肌梗塞或心功能不全而发生内脏动脉收缩。有时肠系膜静脉血栓症、诱发血液的高凝固状态或低血压的药物、血管炎也会成为缺血性肠炎的病因(Reinus J.F.等人，1981；Hunter G.C.等人，1988)。缺血性肠炎在病理学上大致分为三种。第一种是暂时性的可逆型，仅在粘膜和粘膜下组织引起缺血，仅采用保守治疗就能恢复。第二种是慢性型，连内侧圆形肌肉也缺血。第三种是闪电型，在壁全层引起急性缺血(Toursarkissian B等人，1997；Bower T.C.，1993；Deana D.G.等人，1995)。缺血性肠炎中，能够自然治愈的暂时性的可逆型占一半左右，因此仅用保守性治疗也足够，但是剩下的一半可能造成肠全层坏死或肠穿孔，此时由于死亡率高，所以需要考虑手术等积极的治疗(Green B.T.等人，2005；Jung S.H.等人，2008)。

[0005] 为此，本发明的发明人利用从鱼类的精液或精巢提取的DNA片段混合物进行研究的过程中，证实了在缺血性肠炎小鼠模型中DNA片段混合物抑制细胞的坏死，从而完成了本发明。

[0006] 作为现有技术，在韩国授权专利第0818752号中公开了以抑制人FAF1蛋白的siRNA作为有效成分的缺血性疾病治疗用组合物，但是没有提及D NA片段混合物。另外，在韩国公开专利第2003-0001370号中公开了利用具有EGF活性的肽和生长激素分泌促进六肽可以治疗内脏缺血，但是与本发明的DNA片段混合物的构成存在差异。

发明内容

[0007] 发明要解决的问题

[0008] 本发明的目的是提供包含从鱼类的精液或精巢分离出来的DNA片段混合物的缺血性肠炎的预防或治疗用组合物。

[0009] 用于解决问题的方案

[0010] 本发明涉及包含DNA片段混合物的缺血性肠炎的预防或治疗用组合物。

[0011] 所述DNA片段混合物可以是从鱼类的精液或精巢分离出来的DNA片段混合物。

[0012] 上述鱼类可以为鲑科。

[0013] 上述DNA片段混合物的分子量可以为30kDa至2500kDa。

[0014] 以下详细说明本发明。

[0015] 上述DNA片段混合物是指由磷酸、4种碱基、脱氧核糖(deoxyribose)构成的相当于生物体高分子的DNA以分子量减少的片段形态混合存在。

[0016] 上述鱼类可以为鲑科的鱼类，可以优选为鲑鱼或鳟鱼，可以最优选为鲑鱼。

[0017] 上述DNA片段混合物的分子量可以为30kDa至2500kDa，优选为40kDa至2000kDa，最优选为50kDa至l500kDa。

[0018] 另外，本发明提供包含上述DNA片段混合物和药物赋形剂的缺血性肠炎的预防或治疗用药物组合物。以全部组合物总重量计，优选上述DNA片段混合物添加0.001至50重量％，更优选添加0.001至40重量％，最优选添加0.001至30重量％。

[0019] 上述药物组合物可以分别按照通常的方法制成散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、悬浮剂、乳液、糖浆、气雾剂等口服型剂型、外用剂、栓剂和灭菌注射溶液的形态而使用。作为可以包含于上述药物组合物中的载体、赋形剂和稀释剂，可以举出乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。制剂化时，使用通常使用的填充剂、增量剂、结合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂等稀释剂或赋形剂来制造。

[0020] 本发明的包含DNA片段混合物的缺血性肠炎的预防或治疗用组合物优选以口服或注射剂的方式进行给药。

[0021] 用于口服给药的固体制剂包括片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等，这样的固体制剂是在本发明的提取物或化合物中混合至少一种以上的赋形剂，例如淀粉、碳酸钙、蔗糖或乳糖、明胶等而制造。另外，除了单纯的赋形剂以外，也可以使用硬脂酸镁、滑石之类的润滑剂。作为用于口服的液态制剂，有悬浮液、内溶液剂、乳剂、糖浆剂等，除了常用的单纯稀释剂水、液体石蜡以外，还可以包含各种赋形剂，例如润湿剂、甜味剂、芳香剂、保存剂等。

[0022] 注射剂可以按通常的方法制成灭菌注射溶液的形态而使用。优选地，可以溶于注射用水(韩国药典标准)而以灭菌注射溶液的形式利用。

[0023] 本发明的治疗用组合物的给药量根据接受治疗的对象的年龄、性别、体重、疾病的病理状态、病理状态的严重度、给药途径和开处方医生的判断而不同。

[0024] 上述DNA片段混合物可以给药2mg/kg至25mg/kg。优选地可以按2mg/kg至16mg/kg的浓度进行给药。给药浓度小于2mg/kg时，难以获得治疗效果，大于25mg/kg时，相对于给药量，治疗效果上升程度不大。

[0025] 上述DNA片段混合物可以一日一次或一日多次进行给药。

[0026] 本发明的治疗用组合物可以为了缺血性肠炎的预防或治疗而对小鼠、家畜以及人等哺乳动物按多种途径进行给药。给药的所有方式均可以预想，例如可以通过口服、直肠或静脉、肌肉、皮下、子宫内硬膜静脉或脑血管内注射来进行给药。

[0027] 发明效果

[0028] 本发明涉及包含从鱼类的精液或精巢分离出来的DNA片段混合物的缺血性肠炎的预防或治疗用组合物，证实了本发明的组合物对缺血性肠炎的预防或治疗具有优异的效果。另外，证实了本发明的缺血性肠炎预防或治疗用组合物在长期给药时也安全且几乎无副作用。

[0029] 由此，可以期待利用本发明的缺血性肠炎预防或治疗用组合物开发安全、无副作用、治疗效果优异的缺血性肠炎治疗剂，从而对缺血性肠炎的治疗有大的帮助。

附图说明

[0030] 图1示出患部的温度随缺血性肠炎发病程度的变化。

[0031] 图2示出用肉眼观察的向患有缺血性肠炎的小鼠给药DNA片段混合物所带来的肠组织的变化的结果。

[0032] 图3示出通过H&E染色来呈现的向患有缺血性肠炎的小鼠给药DNA片段混合物所带来的肠的组织学变化。

[0033] 图4示出通过MASSON三色染色来呈现的患有缺血性肠炎的小鼠的大肠粘膜分裂随DNA片段混合物的给药的变化。

[0034] 图5示出患有缺血性肠炎的小鼠的细胞凋亡相关因子的蛋白质表达随DNA片段混合物的给药的变化。

[0035] 在各图中，A表示未患有缺血性肠炎的正常组，B表示患有缺血性肠炎的组，C表示给药DNA片段混合物2mg/kg的组，D表示给药DNA片段混合物4mg/kg的组，E表示给药DNA片段混合物8mg/kg的组，F表示给药DNA片段混合物16mg/kg的组。

具体实施方式

[0036] 以下，详细说明本发明的优选实施例。但是，本发明不限于在这里说明的实施例，可以按其他方式实施。以下实施例是为了使这里介绍的内容彻底且完整、向本领域技术人员充分地传递本发明的思想而提供的。

[0037] <实施例1.实验动物的准备>

[0038] 实验动物使用180±5g重量的7周龄的S/D(Sprague Dawley，大鼠)系雄性小白鼠。

[0039] 所有小鼠自由摄取固体饲料和水，并且在于22～24℃维持湿度60％、昼夜周期调节为12小时间隔的实验室环境中饲养。饲养的小白鼠分为下述表1的实验组，每组各使用10只。

[0040] [表1]

[0041]

[0042] <实施例2.缺血性肠炎动物模型的制造>

[0043] 对实施例1中饲养的小鼠腹腔注射舒泰50 来进行麻醉。切开麻醉的小鼠的腹部中央开腹后，结扎降结肠4cm范围的周边部血管。对手术完的小鼠进行切开部缝合后，用1％碘液消毒，之后在恒温恒湿装置内进行恢复。

[0044] <实施例3.给药>

[0045] 将本发明的DNA片段混合物对实施例2的缺血性肠炎动物模型进行给药，证实了对缺血性肠炎的治疗效果。

[0046] 在诱发缺血性肠炎的手术结束后经过48小时再开始给药DNA片段混合物(分子量50kDa～1500kDa)。DNA片段混合物按2、4、8、16mg/kg的浓度以1天1次每次500μl向腹腔注射，共给药21天。此时，作为对照组，采用了未患有缺血性肠炎的正常组和没有给药DNA片段混合物的缺血性肠炎模型组。

[0047] <实施例4.患部的温度测定>

[0048] 基于发生炎症的患部发热严重程度来确认是否患有缺血性肠炎，利用激光温度计(MT6，雷泰Raytek Co.，CA.US)，对缺血性肠炎患病前和患病后以1周为单位检测3次，共检测4次，将其结果示于图1。

[0049] 参照图1，发现除了正常组A以外，所有实验组在患有缺血性肠炎后患部温度均增加，第2次检测时，发现患部温度的降低有赖于DNA片段混合物浓度。尤其发现给药16mg/kg的DNA片段混合物的组F的降低效果最为显著。并且在给药DNA片段混合物3周后的检测中也证实了将DNA片段混合物进行给药的群组的患部温度在统计学上显著减低。

[0050] <实施例5.肠观察>

[0051] 将DNA片段混合物进行给药21天后，对小鼠腹腔注射l0mg/kg的舒泰50来麻醉，之后打开腹腔，露出诱发缺血性肠炎的肠组织，并以同一角度和距离
拍摄肠组织，将其结果示于图2。

[0052] 如图2所示，在患有缺血性肠炎的组B的情况下，发现缺血的大肠部位坏死增加，还发现肠外部的血管出血。相反地，将DNA片段混合物进行给药的情况(C、D、E、F)下，发现由缺血引起的坏死得到好转，从而维持与正常组A的状态相似的大肠形态。

[0053] 由此可知，DNA片段混合物的给药能够抑制或治疗患有缺血性肠炎的大肠部位的坏死。

[0054] <实施例6.组织染色>

[0055] 实施例6-1.组织处理

[0056] 利用实施例5中的被拍摄过肠组织的小鼠，摘出该小鼠的肠组织。其中，将组织的一部分放进溶于l00mM磷酸缓冲液中的4％多聚甲醛(paraformaldehyde)固定液中24小时，实施组织固定。然后，依次放入于70％、80％、90％和100％乙醇中进行脱水，用二甲苯(xylene)沉着后，再使用硬石蜡(徕卡Leica，USA)溶液，经过这3个阶段，使石蜡浸渗到组织中。为了制作切片，将浸渗结束的组织制成块，将已固定的石蜡组织利用石蜡切片机(Shandon Finesse 325，Thermo Electron Co.，England)切成5μm厚度的切片。将组织切片贴在涂覆载玻片上后，在37℃的载玻片烘箱中放置16～18小时。

[0057] 实施例6-2.H&E(苏木精-曙红(Hematoxylin and eosin))染色

[0058] 将实施例6-1中制作的组织切片在迈耶苏木精(Mayer's hematoxyline)(Sigma，USA)溶液中反应30秒后，在流动的水中清洗10分钟。然后在曙红(eosin)(Sigma，USA)溶液中反应3秒钟。完成染色的组织经过脱水过程后封入 封片剂(费希尔科学Fischer scientific，USA)。利用显微镜观察H&E染色的组织切片，确认组织的变化，将其示于图3。

[0059] 如图3所示，患有缺血性肠炎的组B与正常组A相比，在大肠内粘膜部位发现了如凝缩和分裂这种组织损伤。但是，发现将DNA片段混合物进行给药的组C、D、E、F的由缺血引起的大肠内粘膜的凝缩和分裂减少，可以确认这有赖于DNA片段混合物浓度。

[0060] 实施例6-3.MASSON三色(Masson's trichrome)染色

[0061] 通过确认总胶原纤维(total collagen fiber)的表达来作为用于确认患有缺血性肠炎后的DNA片段混合物给药带来的大肠粘膜的分裂程度的方法。由此，实施了MASSON三色染色。

[0062] 将实施例6-1中被石蜡包埋的组织沉着在二甲苯(xylene)中且除去石蜡，进行水合后，在包因氏(Bouin's)溶液(Sigma，USA)中处理1小时。然后在魏格纳铁苏木精(Weigner's iron hematoxylin)溶液(Sigma，USA)中处理10分钟后清洗，在比布列西猩红-酸性品红(Biebrich scarlet-acid fuchsin)溶液(Sigma，USA)中处理2分钟后清洗。将清洗的组织在磷钼酸-磷钨酸溶液(Sigma，USA)中处理10～15分钟后，在苯胺蓝溶液(Sigma，USA)中处理5分钟，在亮绿(light green)溶液中处理1分钟后清洗，然后在乙酸溶液中处理5分钟后，用95％乙醇和二甲苯处理，然后封入 封片剂(Fischer scientific，USA)。利用显微镜观察进行MASSON三色染色的组织，将其结果示于图4。

[0063] 如图4所示，发现与正常组A相比，患有缺血性肠炎的组B因缺血，大肠粘膜的分裂增加，相反地，将DNA片段混合物进行给药的组C、D、E、F的由缺血引起的大肠粘膜的分裂的减少有赖于DNA片段混合物浓度。

[0064] <实施例7.确认细胞凋亡相关因子的蛋白表达>

[0065] 关于缺血性肠炎导致的细胞坏死，欲证实细胞凋亡相关因子的表达程度。

[0066] 将从实施例5的被拍摄肠组织的小鼠中摘出的大肠组织用裂解缓冲液(lysis buffer)提取蛋白质后，进行离心分离，得到上清液，然后使用伯乐(Bio-Rad)的蛋白质定量试剂来定量蛋白质浓度，得到了50μg的蛋白质。

[0067] 将上述获得的蛋白质50μg用10％SDS-PAGE进行电泳后，用硝酸纤维素膜(nitrocellulose membrane)使蛋白质转移(tranfer)。将转移了蛋白质的膜用5％脱脂奶粉(skim milk)封闭(blocking)后，将抗Bax或抗Bcl-2的一次抗体在4℃处理16～18小时。此时，作为定量对照组，利用GAPDH抗体。将用一次抗体处理过的膜利用TBST溶液(含有
0.05％吐温20的Tris缓冲盐水)以每次10分钟清洗3次。对清洗后的膜加入对抗各自的一次抗体的2次抗体，在常温反应1小时后，再次利用TBST溶液以每次15分钟清洗3次。对清洗过的膜用ECL溶液(enhanced chemiluminescence solution，增强化学发光溶液)进行处理而确认了蛋白质条带。将其结果示于5。

[0068] 如图5所示，当细胞凋亡因子(apoptotic factor)为Bax的情况下，发现与正常组A相比，患有缺血性肠炎的组B中其表达增加。可知将2mg/kg和4mg/kg的DNA片段混合物进行给药的情况下，Bax的表达增加，但是在将8mg/kg和16mg/kg的DNA片段混合物进行给药的情况下，Bax的表达的减少有赖于浓度。相反地，作为抗细胞凋亡因子(anti-apoptotic factor)的Bcl-2的情况下，可知与患有缺血性肠炎的组B相比，将DNA片段混合物进行给药的组C、D、E、F中Bcl-2的表达增加。

[0069] 由此可以预测DNA片段混合物抑制患有缺血性肠炎的部位的细胞坏死，从而能够治疗缺血性肠炎。