一种阪崎肠杆菌噬菌体EspYZU05及其用途

摘要

本发明属于生物工程领域，涉及一种阪崎肠杆菌噬菌体EspYZU05及其用途。所述的阪崎肠杆菌噬菌体(Enterobacter sakazakii phage)EspYZU05，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2016716。本发明还公开了该噬菌体作为生物抑菌剂的应用。

权利要求

1.一种阪崎肠杆菌噬菌体(Enterobacter sakazakii phage)EspYZU05，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2016716。

2.权利要求1所述的阪崎肠杆菌噬菌体(Enterobacter sakazakii phage)EspYZU05在制备抑菌剂中的应用。

3.一种阪崎肠杆菌抑菌剂，含有权利要求1所述的噬菌体EspYZU05。

说明书

一种阪崎肠杆菌噬菌体EspYZU05及其用途

技术领域

[0001] 本发明涉及一种阪崎肠杆菌噬菌体分离株，及其作为生物抑菌剂的应用，属于生物工程领域。

背景技术

[0002] 阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)是一种食源性致病菌，可引起新生儿脑膜炎、小肠结肠炎和菌血症等。目前在世界范围内报道过多起阪崎肠杆菌的感染事件，死亡率高达50％～80％。婴幼儿配方奶粉是新生儿感染的主要来源，同时在其他乳制品等及其生产环境中也经常分离到该菌。针对乳制品生产中阪崎肠杆菌的污染特点，采取相应杀菌措施降低阪崎肠杆菌带来的风险至关重要。阪崎肠杆菌在巴氏杀菌温度下无法生存，因此在奶粉热加工后续工艺阶段最有可能发生阪崎肠杆菌的污染。加工器具和生产环境中少量的阪崎肠杆菌在原料及产品中均可能繁殖生长达到致病剂量。目前，生产商常用化学消毒剂对加工器具、管道及生产环境等进行消毒以确保产品安全，但阪崎肠杆菌在适应自然环境生长过程中，其产生的胶囊状结构使阪崎肠杆菌极易吸附在食品、加工器具、输送管道等的表面形成生物被膜，被膜内细菌对化学消毒剂等不良环境的抵抗能力显著增强，很难被清除，从而导致持续性污染，给乳制品生产加工业带来严重危害。另一方面，近年来对食品安全和绿色食品的需求的增加，亟需开发天然无害的抑菌剂应用于乳制品安全控制。

[0003] 噬菌体是一类能够感染细菌的病毒。裂解性噬菌体感染细菌后，可在宿主菌内快速增殖，并使之裂解，故又称烈性噬菌体。噬菌体在自然界中的分布极为广泛，并且对宿主菌具有专一性。

发明内容

[0004] 本发明要解决的技术问题是提供一种对阪崎肠杆菌具有强裂解作用的噬菌体制剂，该制剂可以单独或复配使用，能够有效控制生物被膜形成、抑制阪崎肠杆菌的繁殖与代谢。

[0005] 本发明所述的阪崎肠杆菌噬菌体(Enterobacter sakazakii phage)EspYZU05，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2016716。

[0006] 本发明进一步公开了所述阪崎肠杆菌噬菌体(Enterobacter sakazakii phage)EspYZU05在制备抑菌剂中的应用。

[0007] 本发明还提供了一种阪崎肠杆菌抑菌剂，是含有所述的噬菌体EspYZU05的分离物或培养物。以所述的噬菌体EspYZU05的分离物或培养物作为抑菌成分。

[0008] 本发明从乳品厂污水样品中分离出一株阪崎肠杆菌噬菌体EspYZU05(Enterobacter sakazakii phage EspYZU05)，保藏在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏地址：武汉武汉大学；保藏编号：CCTCC NO：M 2016716；保藏日期：2016年12月2日。

[0009] 本发明中的阪崎肠杆菌噬菌体EspYZU05具有以下生物学特征：

[0010] (1)形态学特征：通过透射电镜观察，头部对称，直径约为55nm，尾长约为10nm，得的噬菌体的形态学特征应归于短尾噬菌体科。

[0011] (2)噬菌体核酸类型：噬菌体为dsDNA。

[0012] (3)噬菌体基因组特征：EspYZU05基因组全长为41,723bp，其中编码基因总长度分别为38,820bp，平均长度分别为826bp，占总长的93.04％，GC含量为55.69％，有47个开放阅读框(ORFs)。47个ORFs编码蛋白中有1个ORFs在数据库中搜不到同源性基因，46个ORFs编码的蛋白在数据库中找到同源性序列，其中30个ORFs编码的蛋白为假设蛋白，有16个蛋白序列功能明确，基因组数据显示EspYZU05为一种新的噬菌体。

[0013] (4)具有强烈的阪崎肠杆菌裂解性能。

[0014] (5)能够抑制阪崎肠杆菌生物被膜形成。

[0015] 本发明将上述的阪崎肠杆菌噬菌体EspYZU05制备成一种阪崎肠杆菌噬菌体抑菌剂，制备方法特征在于：分别取100μL EspYZU05噬菌体液与相应对数期生长期的阪崎肠杆菌液100μL混合，室温放置10min，然后加到10mL营养肉汤液体培养基中，37℃摇床过夜培养；培养物经5000×g，10min离心后收集上清液，通过0.22μm微孔滤膜过滤除菌，得到噬菌体增殖液。加0.93g PEG 8000，0.58g NaCl，摇匀至溶解，4℃过夜；10000×g 4℃离心20min，去上清液；加0.5mL SM(1L：NaCl 5.8g，MgSO4·7H2O 2.0g，1M Tris-HCl(pH7.4)
50mL)溶液，室温作用1h；通过加入等体积的氯仿抽提30s；3000×g 4℃离心15min回收含有噬菌体颗粒的亲水相。将获得的纯化的EspYZU05噬菌体颗粒与SM缓冲液按1：10比例混合形成噬菌体抑菌剂母液。

[0016] 由于本发明采用噬菌体EspYZU05特异性裂解阪崎肠杆菌，可以有效抑制阪崎肠杆菌繁殖；本发明涉及的噬菌体通过传统的方法很容易配制成喷洒液或淋洗液。

附图说明

[0017] 图1为不同噬菌体分离株的抑菌能力。

[0018] 图2噬菌体EspYZU05单层平板抑菌结果。

[0019] 图3噬菌体EspYZU05微观形态电镜图。

[0020] 图4噬菌体EspYZU05全基因组图谱。

[0021] 图5噬菌体EspYZU05对菌膜形成的抑制效果，其中，Control表示未加噬菌体的对照组；Blank表示纯培养基空白对照组；A、B、C、D组表示加105PFU/mL、106PFU/mL、107PFU/mL、108PFU/mL浓度的EspYZU05处理组，每组5个平行，“*”号表示与对照组差异显著(p<0.01)。

[0022] 图6噬菌体EspYZU05在培养基中的抑菌作用，其中，方块数据点表示未加噬菌体的对照组；圆形数据点为添加噬菌体的实验组；图A、B分别为37℃、25℃培养测定的结果。

[0023] 图7噬菌体EspYZU05在牛奶保藏过程中的抑菌作用，其中，方块数据点表示未经噬菌体处理的牛奶(对照组)；圆形数据点为噬菌体处理的牛奶(实验组)；图A、B分别为37℃、25℃贮藏条件测定的结果。

[0024] 本发明中阪崎肠杆菌噬菌体EspYZU05(Enterobacter sakazakii phage EspYZU05)，保藏在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏地址：武汉武汉大学；保藏编号：CCTCC NO：M 2016716；保藏日期：2016年12月2日。

具体实施方式

[0025] 以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

[0026] 本发明试验用噬菌体宿主菌阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii，菌株号：CICC 21569)，及其它阪崎肠杆菌菌株CICC 21545、CICC 21673、CICC 22919均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。

[0027] 除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

[0028] 除非特别说明，本发明实施例所用培养基和试验条件为本领域常规培养基和试验。除非特别说明，本发明实施例所用试剂均为市购。

[0029] 实施例1、噬菌体分离及纯化制备

[0030] 噬菌体分离

[0031] 本发明样品采自江苏省扬大康源乳业有限公司污水。取30mL样品放入50mL离心管中，5000×g离心10min，取5mL上清液加入到5mL营养肉汤液体培养基中，同时加入100μL对数生长期的阪崎肠杆菌CICC 21569，放置37℃摇床过夜培养，次日，将各试管中的培养物转至无菌离心管中，4℃，5000×g离心10min，取上清过0.22μm微孔滤膜除菌，得到的噬菌体原液，可放置在4℃冰箱中保存。

[0032] 用无菌的SM缓冲液对噬菌体原液进行倍比稀释，取合适稀释度的噬菌体液体100μL与100μL对数生长期的阪崎肠杆菌CICC 21569在室温下混合10min，再加入5mL营养肉汤半固体培养基，混匀，快速倾倒在事先制好的营养肉汤固体培养基上，制成双层平板，凝固后倒置放在37℃恒温培养箱中培养。

[0033] 在上述出现噬菌斑的双层平板上挑取透明单个空斑至1mL SM缓冲液中，混匀，4℃放置24h；次日用无菌的SM缓冲液对噬菌体液进行倍比稀释，取合适稀释度的噬菌体液体100μL与100μL对数生长期的阪崎肠杆菌在室温下混合10min，再加入5mL营养肉汤半固体培养基，混匀，快速倾倒在事先制好的营养肉汤固体培养基上，制成双层平板，凝固后倒置放在37℃恒温培养箱中培养。重复双层平板法的操作3～5次，得到的噬菌斑大小一致后，即认为分离到的是纯的噬菌体。分离获得的噬菌体，用双层平板检测纯化噬菌体裂解效果。在
5mL融化好的营养肉汤半固体培养基中加入100μL阪崎肠杆菌培养物，立即倾倒在底层营养肉汤固体培养基上，待培养基凝固后，在划分好的区域中分别滴加增殖后的噬菌体10μL，在无菌操作台中放至培养基表面干燥，然后将平板倒置于37℃培养箱中培养，筛选对宿主菌CICC21569、CICC 21545、CICC 21673、CICC 22919均产生明亮清澈裂解圈的噬菌体分离株。

[0034] 分别取10μL阪崎肠杆菌噬菌体分离株EspYZU05、EspYZU05-1、EspYZU05-2、EspYZU05-3、EspYZU05-4、EspYZU05-5的悬液加入100μL对数期生长期的阪崎肠杆菌悬液(菌株CICC 21545、CICC 21569、CICC 21673和CICC 22919等体积混合)，以同体积的SM缓冲液为对照(Blank)，室温放置10min，然后加到20mL营养肉汤培养基中，接种物放置在25℃培养箱中恒温培养，在0h、24h取样1mL，用分光光度计测量波长在600nm处的吸光值，每组设置3个平行，取平均值用于比较不同噬菌体分离株的抑菌能力，结果如图1所示，EspYZU05在
24h的OD 600nm值显著小于其他的噬菌体分离株(P<0.01)，与0h没有显著差异，表明EspYZU05具有最强的阪崎肠杆菌抑制能力。

[0035] 噬菌体的纯化

[0036] 分别取100μL分离得到的阪崎肠杆菌噬菌体与对数期生长期的阪崎肠杆菌液100μL混合，室温放置10min，然后加到10mL营养肉汤液体培养基中，37℃摇床过夜培养；将试管中的培养物转至灭菌离心管中，经5000×g，10min离心后收集上清液，通过0.22μm微孔滤膜过滤除菌，得到噬菌体增殖液。加0.93g PEG 8000，0.58g NaCl，摇匀至溶解，4℃过夜；10000×g 4℃离心20min，去上清液；加0.5mL SM(1L：NaCl 5.8g，MgSO4.7H2O 2.0g，1M Tris-HCl(pH7.4)50mL)溶液，室温作用1h；通过加入等体积的氯仿抽提30s；3000×g 4℃离心15min回收含有噬菌体颗粒的亲水相。获得纯化的噬菌体，用双层平板检测纯化噬菌体裂解效果。结果显示EspYZU05对阪崎肠杆菌产生强烈的裂解效应(如图2所示)。

[0037] 噬菌体形态特征

[0038] 用透射电镜观察噬菌体形态特征。采用磷钨酸负染法，将铜网有膜的一面朝上，取30μL高效价的噬菌体液滴于铜网上，吸附10min后用吸水纸将铜网上的液滴吸干，滴加2％的磷钨酸水溶液(PTA)进行染色，2min后用吸水纸吸去负染液，铜网置于红外灯下烘干，使用透射电镜进行观察，选取清晰的噬菌体图像进行拍照分析。

[0039] 结果如图3所示，噬菌体EspYZU05头部对称，直径约为55nm，尾长约为10nm，属于短尾噬菌体科。

[0040] 噬菌体基因组特征

[0041] 将纯化的噬菌体悬液加DNase I至终浓度5μg/mL，RNase A至终浓度1μg/mL，37℃温育1h；加入EDTA(pH 8.0)至终浓度为20mmol/L；加蛋白酶K至终浓度为50μg/mL，加SDS至终浓度为0.5％，颠倒混匀，56℃温浴1h；加入等体积苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)振荡抽提，12000×g，离心5min，收集上层水相；用等体积氯仿/异戊醇(24:1)再抽提一次，12000×g，离心5min，收集上层水相；加入等体积异丙醇沉淀核酸，-20℃过夜，4℃，12000×g离心10min；沉淀用1mL预冷70％乙醇洗涤2次，去乙醇，室温下干燥沉淀；用适量TE(pH 8.0)混悬沉淀，在GeneQuant核酸定量仪上粗略定量，暂按ds DNA设置参数，-20℃保存；提取的噬菌体DNA送至深圳恒创基因生物有限公司由Illumina Hiseq 2500PE150平台进行全基因组测序及分析。

[0042] 结果如图4所示，EspYZU05基因组全长为41,723bp，其中编码基因总长度分别为38,820bp，平均长度分别为826bp，占总长的93.04％，GC含量为55.69％，有47个开放阅读框(ORFs)。47个ORFs编码蛋白中有1个ORFs在数据库中搜不到同源性基因，46个ORFs编码的蛋白在数据库中找到同源性序列，其中30个ORFs编码的蛋白为假设蛋白，有16个蛋白序列功能明确，基因组数据显示EspYZU05为一种新的噬菌体。分析表明EspYZU05基因组中未检测到已知的毒力相关基因。

[0043] 实施例2、噬菌体EspYZU05对阪崎肠杆菌菌生物膜的抑制作用

[0044] 取对数生长期的阪崎肠杆菌用营养肉汤培养基进行稀释，最终浓度为1×107CFU/mL，实验组：在无菌96孔板中每孔分别加入稀释菌液(107CFU/mL)和噬菌体EspYZU05悬液(105PFU/mL、108PFU/mL)各150μL；对照组：在无菌96孔板中每孔加入稀释菌液(107CFU/mL)和营养肉汤培养基各150μL；空白组：每孔加300μL营养肉汤培养基；37℃培养24h；取出96孔板，吸出悬浮菌液，用无菌PBS清洗96孔板3次，吹干，充分除去浮游菌体；每孔加入200μL浓度为0.2％的结晶紫染色液，染色30min；吸出染色液，用无菌PBS彻底清洗96孔板至洗出液呈无色，吹干；每孔加入200μL的33％醋酸脱色剂，振荡充分溶解，于酶标仪测定600nm处的OD值。每组平行测定5次。

[0045] 结果如图5所示，加入105PFU/mL、106PFU/mL、107PFU/mL、108PFU/mL EspYZU05悬液的试验组(A、B、C、D组)测定的OD600nm显著低于对照组(p<0.01)，表明EspYZU05抑制了阪崎肠杆菌生物膜的形成。

[0046] 实施例3、噬菌体EspYZU05在培养基中的抑菌作用

[0047] 配制营养肉汤培养基分装至20mL带塞试管中，121℃灭菌15min。将阪崎肠杆菌5 7
(10CFU/mL)接种100μL到10mL培养基中，实验组中加入100μL噬菌体EspYZU05悬液(10PFU/mL)，对照组中加入100μL SM缓冲液，接种物分别放置在37℃培养箱、25℃培养箱中恒温培养，培养物每隔6h取样1mL，用分光光度计测量波长在600nm处的吸光值，每组设置3个平行，取平均值用于分析。

[0048] 结果如图6所示，随着培养时间延长，对照组OD600nm快速增长，分别在24h(37℃)、24h(25℃)时达到0.5、0.25和0.1，而添加EspYZU05悬液的实验组OD600nm始终保持在较低的水平(OD600nm<0.1(37℃)、OD600nm<0.01(25℃)，表明本发明中的EspYZU05噬菌体在37℃、25℃条件下均能对阪崎肠杆菌起到显著抑制作用(P<0.01)。

[0049] 实施例4、噬菌体EspYZU05在牛奶贮藏过程中的抑菌作用

[0050] 采用市售奶粉按12％的量配制牛奶培养基，每40mL分装至带塞锥形瓶中，105℃灭菌15min。阪崎肠杆菌(105CFU/mL)接种5mL到40mL牛奶培养基中，实验组中加入5mL噬菌体EspYZU05悬液(107PFU/mL)，对照组中加入5μL SM缓冲液，接种物分别放置在37℃培养箱、25℃培养箱中恒温培养，37℃培养的培养物每隔2h取样100μL，25℃培养的培养物每隔3h取样100μL，采用平板计数法计算菌落总数，每组设置3个平行，取平均值用于分析[0051] 37℃、25℃和4℃培养条件下细菌总数(TAC)测定结果如图7。在两种温度下，初期对照组和实验组细菌总数分别为：6.46log CFU/mL、6.27log CFU/mL，随着培养时间的增加，噬菌体处理的牛奶细菌总数在整个培养过程始终低于对照组，比对照组分别减少了
3.93log CFU/mL、3.70log CFU/g，表明本发明中的噬菌体EspYZU05抑菌剂在两种培养温度对牛奶中的崎肠杆菌均起到显著的抑菌作用。