一种检测外周血中胰腺癌细胞标志物的试剂盒

摘要

本发明提供一种检测外周血中胰腺癌细胞的试剂盒，包括结合有胰腺癌抗体的磁珠及相应缓冲试剂，该试剂盒采用磁珠分选，RT‑PCR等分子生物学的方法检测胰腺癌患者血液循环中的肿瘤细胞的生物学活性，确定药物治疗靶点的基因，通过检测EpCAM、KRT19和MUC16的表达水平，确定胰腺癌的发展及转归，对胰腺癌的个体化治疗提供理论依据和实验证据。本发明提供的试剂盒检测样本量小，对患者伤害小，检测灵敏度高，检出率可达80％以上。

权利要求

1.一种检测外周血中胰腺癌细胞标志物的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由如下组分组成：结合有胰腺癌抗体的磁珠：

结合有寡核苷酸Oligo(dT)的磁珠；

缓冲液A；100-200mL缓冲液B：100-200mL；

裂解/结合缓冲液150-250mL；

10×缓冲液4.0-5.0mL；

dNTPs，每种5mM 4.0-5.0mL逆转录酶，10000U/μL 2.0-3.0mLRNA酶抑制剂，40U/μL 0.4-0.6mL

2×热启动PCR混合液2-3mLRNase-free水1-2mL；

胰腺癌肿瘤标志物引物10μmol/L 3.0-5.0mL；

内标ACTIN引物；

其中所述胰腺癌肿瘤标志物为EpCAM、KRT19和MUC16；

所述EpCAM引物序列为：

上游引物如SEQ ID NO：1所示；

下游引物如SEQ ID NO：2所示；

所述KRT19引物序列为：

上游引物如SEQ ID NO：3所示；

下游引物如SEQ ID NO：4所示；

所述MUC16引物序列为：

上游引物如SEQ ID NO：5所示；

下游引物如SEQ ID NO：6所示；所述内标ACTIN引物序列为：上游引物如SEQ ID NO：7所示；

下游引物如SEQ ID NO：8所示；所述胰腺癌抗体为抗EpCAM单克隆抗体和抗CK20单克隆抗体。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述2×热启动PCR混合液中包含HotStarTaq DNA Polymerase 5U/μL。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述缓冲液A的配方为：10mM Tris-HCl,pH7.5；0.15M LiCl；1mM EDTA；0.1％LiDS。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述缓冲液B的配方为：10mM Tris-HCl,pH7.5；0.15M LiCl；1mM EDTA。

说明书

一种检测外周血中胰腺癌细胞标志物的试剂盒

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种胰腺癌检测试剂盒，具体涉及一种准确性高的检测外周血中胰腺癌细胞标志物的试剂盒。

背景技术

[0002] 1.1胰腺癌概述

[0003] 胰腺癌(pancreatic carcinoma)是一种常见的消化道恶性肿瘤，约90％为起源于导管上皮的导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)，其发病率和死亡率近年来明显上升，90％的胰腺癌患者生存期不超过一年，生存期超过五年的不足5％，是预后最差的恶性肿瘤之一。胰腺癌治疗效果不理想的影响因素有其早期症状不典型,复杂的病理生理学机制,早期诊断及预后标志物的缺乏等。尽管近年来肿瘤的诊断和治疗手段不断完善和进步，不少肿瘤的预后已获得改善，但据美国癌症协会统计，胰腺癌病人的预后改善最不明显。胰腺癌高死亡率的原因在于：1)尽管影像学方法在胰腺癌检测及治疗中发挥重要作用，然而，对小的病变，胰腺炎、胰腺上皮内瘤变及其它良性病变与胰腺癌仍很难鉴别，仅7％的胰腺癌在初期诊断。2)进展期胰腺癌无有效的治疗手段导致大多数患者预后差，外科手术可切除的局部病灶的患者5年相对生存率22％，而未切除的进展期转移病灶生存率仅1-2％。3)胰腺癌低存活率在于其侵入性生物学表型，表现为早期局部扩散和转移。

[0004] 从经济学的角度来看，生物学标志物可能成为更具成本效益的疾病早期检测及诊断方法，目前临床应用的糖类抗原CA199作为胰腺癌最经典的标志物，由于其在胰腺癌初期正常，在良性病变如胰腺炎或其他肿瘤也升高，使得它的灵敏度和特异度存在不足。鉴于目前尚无单一的生物学标志物达到胰腺癌初期诊断的要求，迫切需要研究开发新型胰腺癌相关的生物学标志物，区分健康个体和早期胰腺癌或前体病变，从而减少疾病的发病率和死亡率。循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)是指自发或因诊疗操作由实体瘤或转移灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞，其可以辅助早期诊断及良恶性判断，指导分期及分子分型，辅助治疗用药筛选及疗效实时监测，提示微转移及预后等,由于外周血样本易获得且创伤小等特点显示出了CTC的临床优势。

[0005] 1.2影响胰腺癌预后的相关因素

[0006] 多年来，手术治疗依然是根治胰腺癌的唯一有效手段，其在胰腺癌治疗中具有首要地位，只有根治性切除肿瘤组织，才能使病人获得较长的生存时间。而胰腺癌起病隐匿，85％的病人确诊时已是晚期，错过了手术时机。对不可切除的胰腺癌，明确诊断后，即使行辅助化疗，生存时间一般不超过6个月。大多数研究报告显示，胰腺癌的预后与年龄、性别、肿瘤家族史以及肿瘤部位无密切关系。糖尿病与胰腺癌的关联性一直存有争议，有研究表明，糖尿病史能够增加胰腺癌的患病风险，而糖尿病也能降低胰腺导管腺癌患者的术后生存率。胰腺癌患者预后与胰周侵犯、远处转移相关，而这些也是胰腺癌临床分期的主要依据(胰腺癌分期见表1：AJCC第8版胰腺癌分期系统)。胰腺癌早期症状不明显，部分患者得益于早期发现，得以根治性切除而使生存率明显提高，因此实现胰腺癌的早期诊断能有效的提高胰腺癌的生存期。

[0007] 表1 AJCC第8版胰腺癌分期系统

[0008]

[0009]

[0010] 1.3临床常用胰腺癌检测技术

[0011] 目前临床上针对胰腺癌的血清学肿瘤标志物的检测主要有CA199、CA242、CEA及MUC16等。其中CA199是最常用的胰腺癌血清学标志物检测之一，CA199是一种黏蛋白型糖类蛋白肿瘤标志物，在消化道肿瘤患者血清中存在上升趋势，因此常作为消化道肿瘤的标志物，同时也是目前胰腺癌敏感性最强的标志物。还有研究表明，CA199与患者癌症分期呈正相关，即CA199的表达水平随胰腺癌分期进展而升高，此外其水平与病人预后也有一定相关性。然而其在I期胰腺癌的阳性率仅为57.69％，对于早期胰腺癌的发现帮助不大。而由于CA199在梗阻性黄疸、胰腺炎以及其他多种非胰腺肿瘤中也升高，容易出现假阳性，因此不能单独作为鉴别胰腺癌的诊断标准。MUC16是癌胚发育过程中体腔上皮细胞表达的一种糖蛋白抗原，常被用作卵巢癌等妇科肿瘤标志物。研究表明，胰腺癌患者中MUC16也明显高于正常水平，同时在各分期中，MUC16表达水平及阳性率呈上升趋势，可作为胰腺导管腺癌预后不良的独立预测因子。然而这些因子均有自身的缺陷，无法单独作为胰腺癌诊断标志物。因此临床需要一种创伤小，有助于早期诊断且能实时检测肿瘤进展的有效的检测方法。

[0012] 1.4胰腺癌转移的机制

[0013] 长久以来，人们一直被“是什么决定了哪个器官发生转移”这个问题所困扰，1889年，Stephen Paget观察到乳腺癌患者更偏向发生肝转移，Pagett认为这是不寻常的因为其他的器官如脾脏也会同样的收到相同的影响，因为脾脏和肝脏有相同的血流量，这个发现促使Pagett提出了“种子-土壤”学说，他假设某些肿瘤细胞，也就是种子，选择性克隆至远端器官，也就是土壤，其提供了一个适合肿瘤细胞生长的环境“当植物开始播种，它的种子可以播撒向任何方向但是其只会落在合适的土壤中生长”因此某些器官必须提供合适的适合器官特异性转移的环境从而导致器官的选择性。胰腺癌发生转移的过程也印证了这一假说，胰腺癌的生存率极低，易发生远处转移，其中肝转移最为常见。血行转移是胰腺癌发生转移的主要途径，肿瘤细胞从原发癌组织脱落入血，随血流播散至远处组织并形成转移灶。

[0014] 1.5循环肿瘤细胞

[0015] 循环肿瘤细胞是指原发肿瘤或转移灶脱落入血的肿瘤细胞，第一次被提出是在1869年，部分入血的CTC可能具备了在组织支持的微环境中克隆生长形成转移灶的能力，因此CTC数目和分子特征可以作为一种实时无创的实时“液体活检”手段提供关于预后、治疗选择及有效性等临床信息。现今CTC研究已成为相当活跃的领域，大量研究表明了CTC在恶性肿瘤中的存在及其临床意义，这些研究提示CTC是预后不良的独立预测因素，CTC检测阳性患者的无进展生存期和总生存期明显短于CTC检测阴性的患者，而有效的细胞减灭术或放化疗后CTC数目下降，提示CTC可以辅助检测治疗效果从而对进一步的治疗做出指导；另外，CTC中还会携带原发组织的遗传信息，通过分子水平的变化可以为个体化治疗提供依据。

[0016] 在胰腺导管腺癌中，EpCAM、KRT19和MUC16的高表达，与胰腺癌的不良预后相关。

[0017] 综上所述，检测胰腺癌患者血液中循环肿瘤细胞的数量对于胰腺癌诊断及评估预后具有重大的理论和实际意义。

发明内容

[0018] 本发明的目的是提供一种可以准确检测胰腺癌标志物的试剂盒，主要是指一种通过采集胰腺癌患者外周血液中的胰腺癌细胞的检测试剂盒及复合的检测技术，具体地说是一种准确性高的检测胰腺癌细胞(恶性肿瘤细胞)的检测技术和试剂盒，特别是能够检测经过放、化疗治疗后残存在血液中的游离胰腺癌细胞的检测试剂盒，该检测结果对胰腺癌治疗方案的选择和预后具有重要指导意义。

[0019] 本发明的发明思路为：采用磁珠分离，RT-PCR等分子生物学的方法检测胰腺癌患者血液循环中的肿瘤细胞的生物学活性，通过检测EpCAM、KRT19和MUC16的表达水平，确定胰腺癌的发展及转归，对胰腺癌的个体化治疗提供理论依据和实验证据。

[0020] 为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

[0021] 本发明提供一种检测外周血中胰腺癌标志物的试剂盒，所述试剂盒由如下组分组成：

[0022] 结合有胰腺癌抗体的磁珠：

[0023] 结合有寡核苷酸Oligo(dT)的磁珠；

[0024] 缓冲液A；100-200mL

[0025] 缓冲液B：100-200mL；

[0026] 裂解/结合缓冲液150-250mL；

[0027] 10×缓冲液4.0-5.0mL；

[0028] dNTPs，5mM each 4.0-5.0mL

[0029] 逆转录酶，10000U/μL 2.0-3.0mL

[0030] RNA酶抑制剂，40U/μL 0.4-0.6mL

[0031] 2×热启动PCR混合液2-3mL

[0032] RNase-free水1-2mL；

[0033] 胰腺癌肿瘤标志物引物10μmol/L 3.0-5.0mL；

[0034] 其中所述胰腺癌肿瘤标志物为EpCAM、KRT19、MUC16中的一种或多种；

[0035] 所述EpCAM引物序列为：

[0036] 上游引物如SEQ ID NO：1所示：5’-TGAGCGAGTGAGAACCTA-3’；

[0037] 下游引物如SEQ ID NO：2所示：5’-CACAACAATTCCAGCAAC-3’；

[0038] 所述KRT19引物序列为：

[0039] 上游引物如SEQ ID NO：3所示：5’-CTGACACCATTCCTCCCT-3’；

[0040] 下游引物如SEQ ID NO：4所示：5’-CCGACGACTGGCGATA-3’；

[0041] 所述MUC16引物序列为：

[0042] 上游引物如SEQ ID NO：5所示：5’-TCCCTGGATGCTGCTA-3’；

[0043] 下游引物如SEQ ID NO：6所示：5’-TGCTGAGGTGGCTATG-3’；

[0044] 所述胰腺癌抗体为抗EpCAM单克隆抗体和抗CK20单克隆抗体。

[0045] 其中，所述2×热启动PCR混合液中包含HotStarTaq DNA Polymerase 5U/μL。

[0046] 其中，所述缓冲液A的配方为：10mM Tris-HCl,pH7.5；0.15M LiCl；1mM EDTA；0.1％LiDS。

[0047] 其中，所述缓冲液B的配方为：10mM Tris-HCl,pH7.5；0.15M LiCl；1mM EDTA。

[0048] 其中，所述裂解/结合缓冲液配方：100mM Tris-HCl,pH7.5；500mM LiCl；10mM EDTA,pH8；1％LiDS；5mM dithiothreitol。

[0049] 本发明中用于富集循环血中胰腺癌细胞的肿瘤标志物为EpCAM、CK20；而鉴定胰腺癌的标志物为EpCAM、KRT19和MUC16。

[0050] 引物配制：

[0051] 引物为每个先稀释至10μM(即10μmol/L)，然后将引物混合加水至每个引物浓度为2μM，多重PCR反应体系中每个引物终浓度为0.2μM。

[0052] 使用时每1mL血液使用25μL抗体标记后的磁珠。

[0053] 反应结果分析：

[0054] 采用Agilent 2100生物分析仪对PCR产物物进行分析：

[0055] 本发明的有益效果在于：

[0056] 本发明提供一种检测外周血中胰腺癌标志物的试剂盒，该试剂盒要求的检测样本量小，对患者伤害小，检测灵敏度高，对癌细胞的检出量可低至2细胞水平，即样品中含有2个游离癌细胞即可检出，并且可根据胰腺癌肿瘤标志物的含量确定检出为胰腺癌细胞还是胰腺癌干细胞，检出率可达80％，对胰腺癌患者治疗后是否复发及复发的个性化治疗提供理论依据和实验证据。

附图说明

[0057] 图1为多重PCR验证各因子在胰腺导管腺癌外周血DNA中的表达情况图。

[0058] 图2为本发明提供的试剂盒中EpCAM、KRT19和Muc16的量效关系图。

[0059] 图3为本发明提供的试剂盒中EpCAM、KRT19和Muc16在胰腺癌患者CTC中的表达结果。

具体实施方式

[0060] 本发明中所用试剂与仪器：

[0061] 1.抗EpCAM单克隆抗体和抗CK20单克隆抗体购自Abcom公司。

[0062] 2.用于结合抗体的磁珠选用美国invitrogen公司 M-450Tosylactivated，单克隆抗体标记量为每100μg抗体标记500μL磁珠，标记方法并按照其说明书进行操作。

[0063] 3.结合有寡核苷酸Oligo(dT)的磁珠选用美国invitrogen公司Oligo(dT)25磁珠。

[0064] 4.10×缓冲液：为美国QIAGEN公司的Sensiscript Reverse Transcriptase反应缓冲液(10x Buffer RT)。

[0065] 5.2×热启动PCR混合液：为美国QIAGEN公司Multiplex PCR Master Mix，其中含有HotStarTaq DNA Polymerase规格为浓度：5U/μL。

[0066] 6.Agilent 2100生物分析仪购自安捷伦科技(中国)有限公司。

[0067] 未标明的试剂与仪器均为实验室常规用品。

[0068] 实施例1：结合胰腺癌抗体的磁珠的制备：

[0069] 使用的抗体为抗EpCAM单克隆抗体和抗CK20单克隆抗体，分别标记上述2种抗体后将上述2种已经标记的磁珠混合使用。

[0070] 标记方法：磁珠使用美国invitrogen公司生产的 M-450 Tosylactivated。标记的方法严格按照产品说明书进行。

[0071] 标记比例为：每100μg抗体标记500μL磁珠，标记后等量混合。

[0072] 实施例2：胰腺癌细胞的分离：

[0073] 2.1样品处理：

[0074] 取胰腺癌患者外周血5mL，EDTA抗凝，4度保存，48小时之内使用。

[0075] 2.2磁珠处理：

[0076] 将结合有胰腺癌抗体的磁珠(抗体标记磁珠，为标记两种抗体的混合磁珠，且按1mL样本加25μL磁珠的比例准备抗体标记磁珠)用PBS反复清洗三次，分离出磁珠，冰上备用；

[0077] 具体操作为：吸取125μL标记好的磁珠加入1.5mL的离心管中，用移液器轻轻的吹吸混匀(注意不能使用混旋仪)后放在磁珠富集器上静置1min，使磁珠贴附到离心管壁上，弃去上清；然后加入1mL PBS，放在磁珠富集器上1min，使磁珠贴附到离心管壁上，弃去上清；采用相同方法使用PBS共清洗3次，以清除防腐剂；移去上清后加入200μL PBS，冰上备用。

[0078] 后续步骤磁珠分离也均使用磁珠富集器进行分离。

[0079] 2.3胰腺癌细胞的分选：

[0080] 将样本和抗体标记磁珠均加入15mL锥形离心管中，将反应管放在4℃的试管旋转混合器上，以10rpm的速度孵育30min，分离磁珠，弃去上清；加1mL PBS洗涤磁珠，移去上清液以去除不要的细胞，加入1mL PBS混匀磁珠后，转移到新的1.5mL离心管中，备用。

[0081] 2.4胰腺癌细胞裂解：

[0082] 去除PBS，在结合了抗体标记磁珠的细胞中加入裂解/结合缓冲液200μL混匀，55℃水浴(或金属浴)反应5min使磁珠上结合的细胞裂解，mRNA释放到上清液中，将离心管放到磁铁上静置5min，将上清液转移到新的1.5mL离心管中，将抗体标记磁珠弃去。

[0083] 胰腺癌细胞选择步骤结束，样品mRNA用于进一步实验或-20℃储存mRNA最长1周，长期储存采用-70℃储存。

[0084] 实施例3：胰腺癌细胞标记物的检测：

[0085] 3.1mRNA纯化

[0086] 将40μL带有寡核苷酸Oligo(dT)的磁珠混匀加入到1.5mL离心管中，加入500μL裂解/结合缓冲液冲洗2次，分离磁珠，加入上清液，混匀，室温孵育10min，使mRNA与磁珠结合；然后分离磁珠，使用500μL缓冲液A清洗2次磁珠，分离磁珠，再用500μL缓冲液B清洗2次磁珠，分离磁珠，再用100μL RNase-free水清洗一次，分离磁珠，用29.5μL RNase-free水重悬磁珠，55℃水浴(或金属浴)中孵育5min，冰上放置2min，获得mRNA/磁珠混合物。

[0087] mRNA/磁珠混合物不能储存，需立即进行逆转录。

[0088] 3.2逆转录：

[0089] 逆转录步骤如下：

[0090]

[0091] 逆转录程序：

[0092] 37℃60min，93℃5min，4℃保存。

[0093] 逆转录结束后继续进行PCR或储存在-20℃(最长可以保存2周)。

[0094] 反应同时以RNase-free水替代样品作为阴性对照。

[0095] 3.3PCR

[0096] 引物序列：

[0097]

[0098] 阳性对照为：将胰腺癌细胞系BxPC-3收集提取RNA逆转录翻译获得阳性对照的cDNA；

[0099] 阴性对照为：高纯水。

[0100] 反应体系

[0101]

[0102] PCR:程序

[0103] 95℃15min；94℃30s，58℃90s，72℃60s，35个循环；60℃30min；4℃∞[0104] PCR产物置于冰上或-20℃保存。

[0105] 3.5结果分析

[0106] 实验结构均采用Agilent生物分析仪分析对PCR产物进行分析。

[0107] 1)所有患者的样品必须有Actin基因的条带(内标)；

[0108] 2)RT的阴性对照不能有大于80个核苷酸的条带；

[0109] 3)如果产物大于1kb，说明被基因组DNA污染(内含子)；

[0110] 4)在本实验中PCR产物中的3个阳性条带中任何一个条带为阳性均可以判定结果为阳性；

[0111] 5)在PCR结果中，除Actin外的3个PCR产物均存在于肿瘤细胞，而EpCAM的PCR产物与肿瘤细胞的来源是上皮细胞有关；

[0112] 6)在PCR结果中，除Actin外为每次必须出现的条带外，其他的3个条带可以随机出现。但是采用本方法检测，最低的PCR检出应该为2个细胞，即在被测样品中只要存在2个及2个以上的肿瘤细胞或肿瘤干细胞，均可以检测到3个PCR产物中的任何一个。

[0113] 首先多重PCR确定三种鉴定Marker的可靠性，图1所示为BxPC-3胰腺癌细胞系中三种marker的鉴定结果。对胰腺癌细胞系提取RNA逆转录cDNA后，分别做EpCAM、KRT19和MUC16的PCR结果，内参选择Actin。其次通过阳性对照分析试剂盒的灵敏度，如图2所示，图2为EpCAM、KRT19和MUC16三种标记物的量效关系结果，可见当癌细胞数量在2个及2个以上时，即可使用本发明提供的试剂盒检出胰腺癌细胞。并且随着癌细胞数量的增多，PCR产物的量也增多，具有明显的量效关系。这对于胰腺癌患者预后评估有重大的应用价值。图3显示三种Marker对病人外周血标本的灵敏性，BxPC-3胰腺癌细胞系为阳性对照，高纯水为阴性对照，选取病人术前和术后外周血，按照上述实验流程富集CTC之后提取RNA，逆转录成cDNA，随后多重PCR验证三种标记物的结果。结果显示患者术前术后外周血中均检出了游离的胰腺癌CTC。

[0114] 从上述实施例可以看出，本发明检测外周血中胰腺癌细胞的试剂盒检测方法简便，且检测样本量小，对患者伤害小，检测灵敏度高，外周血液样本中含有2个胰腺癌细胞即可检出，检测准确率可以达到80％，检测结果可信。

[0115] 本发明提供的试剂盒主要针对胰腺癌患者治疗后的监测，为医生对胰腺癌患者治疗后是否复发及治疗效果评价提供可靠的实验数据。