一种防控水产养殖动物气单胞菌出血病的减毒活疫苗

摘要

本发明公开了一种防控水产养殖动物气单胞菌出血病的减毒活疫苗。本发明提供了一种重组菌，是将维氏气单胞菌中的气溶素基因敲除得到的。所述重组菌可以用于制备水产动物维氏气单胞菌疫苗和/或嗜水气单胞菌疫苗和/或气单胞菌疫苗和/或出血病疫苗。本发明采用无抗生素标记敲除关键毒力因子技术构建的口服或浸浴减毒活疫苗可以在保留免疫抗原性的同时降低病原菌的致病性，免疫保护效果显著，增强天然免疫系统反应和细胞免疫，增强抵抗其它病原菌的感染能力，同时大大减少免疫工作量。

权利要求

1.维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）Hm091△aer，保藏编号为CGMCC No. 14776。

2.权利要求1所述的维氏气单胞菌（A. veronii）Hm091△aer在制备水产动物维氏气单胞菌疫苗中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述水产动物维氏气单胞菌疫苗为维氏气单胞菌引发的水产动物出血病疫苗。

4.一种制备水产动物维氏气单胞菌疫苗的方法，包括如下步骤：将权利要求1所述的维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）Hm091△aer作为水产动物维氏气单胞菌疫苗的活性成分进行包装。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述水产动物维氏气单胞菌疫苗为维氏气单胞菌引发的水产动物出血病疫苗。

6.权利要求1所述的维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）Hm091△aer在制备产品中的应用；所述产品的用途为增加水产动物对维氏气单胞菌的免疫力。

7.权利要求1所述的维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）Hm091△aer在制备产品中的应用；所述产品的用途为预防和/或治疗水产动物维氏气单胞菌感染。

8.权利要求1所述的维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）Hm091△aer在制备产品中的应用；所述产品的用途为预防和/或治疗维氏气单胞菌引发的水产动物出血病。

9.一种以权利要求1所述的维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）Hm091△aer为活性成分的产品。

10.根据权利要求9所述的产品，其特征在于：所述产品为水产动物维氏气单胞菌疫苗。

11.根据权利要求10所述的产品，其特征在于：所述水产动物维氏气单胞菌疫苗为维氏气单胞菌引发的水产动物出血病疫苗。

说明书

一种防控水产养殖动物气单胞菌出血病的减毒活疫苗

技术领域

[0001] 本发明涉及一种防控水产养殖动物气单胞菌出血病的减毒活疫苗。

背景技术

[0002] 中国是世界上最大的水产养殖生产国家，占世界水产养殖产量的60％以上。随着水产养殖在生产实践过程中的日益集约化和商业化，疾病暴发已经成为鱼类养殖业的主要问题。特别是气单胞菌引起的鱼类出血病已成为水产养殖业发展过程中的一个非常突出的问题。据估计，鱼类疾病爆发每年在全球水产养殖业中造成大约数十亿美元的经济。例如，由气单胞菌(Aeromonas spp.)引起的运动性气单胞菌败血症(MAS)的爆发,通常导致全球水产养殖中鱼类的高死亡率并造成严重的经济损失。在过去几十年中，抗生素是作为水产养殖中鱼类疾病的治理与控制以及促进鱼类生长的传统策略。然而，病原菌的耐药性问题以及动物产品中抗生素的残留问题已经成为全球人们所关注的问题，抗生素在水产养殖业中的禁用已势在必行。目前除使用抗生素外，灭活疫苗是气单胞菌所引起的出血病的主要防止方法，但灭活疫苗对抗原的破坏对导致免疫反应不稳定、缺少免疫原性作用时间不持久。因此开发病原菌疫苗将是防治气单胞菌出血病的重要无抗防治方法之一。

[0003] 目前对细菌性败血症的疫苗防治由于前期对致病机理不明，导致主要是集中在肠道/鳃屏障破坏后趁虚而入的感染细菌嗜水气单胞菌疫苗方面的研制上，而关于破坏宿主物理屏障的关键细菌维氏气单胞菌疫苗的开发报道很少，主要包括传统的高毒力菌株的灭活疫苗，此外还报道了维氏气单胞菌菌蜕以及引入特异性适体肽的维氏气单胞菌疫苗，且多数是以注射的方式进行免疫，存在以下缺陷：1)灭活过程导致部分或完全丧失保护性抗原，只能引起不稳定或者水平低下的免疫应答反应，甚至不能激发正确免疫反应及引发副作用等；2)维氏气单胞菌菌蜕存在生产产量低，裂解基因存在毒性的缺点；3)特异性适体肽的维氏气单胞菌疫苗无法避免自身毒力基因表达致病的缺点，4)鱼类注射免疫存在工作量大的缺点。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种防控水产养殖动物气单胞菌出血病的减毒活疫苗。

[0005] 本发明首先提供了一种重组菌，是将维氏气单胞菌中的气溶素基因敲除得到的。

[0006] 所述气溶素基因为编码气溶素蛋白的基因。

[0007] 所述气溶素蛋白如下(1)或(2)：

[0008] (1)由序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

[0009] (2)将序列表中序列6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列6衍生的蛋白质。

[0010] 所述气溶素基因为如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)：

[0011] (a1)序列表的序列5所示的DNA分子；

[0012] (a2)编码区如序列表的序列5所示的DNA分子；

[0013] (a3)在严格条件下与(a1)或(a2)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能的蛋白质的DNA分子；

[0014] (a4)与(a1)或(a2)或(a3)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码具有相同功能的蛋白质的DNA分子。

[0015] 所述敲除为敲除整个开放阅读框或敲除部分基因区段。

[0016] 所述敲除具体可为将维氏气单胞菌基因组DNA中序列表的序列5自5’端第91至1381位敲除。

[0017] 所述敲除是通过同源重组实现的。

[0018] 所述同源重组是将特异DNA片段导入维氏气单胞菌实现的；所述特异DNA片段包括气溶素基因的上同源臂和下同源臂；所述上同源臂如序列表的序列3自5’端第3092-4276位核苷酸所示；所述下同源臂如序列表的序列3自5’端第4277-5408位核苷酸所示。所述特异DNA片段如序列表的序列3自5’端第3092-5408位核苷酸所示。

[0019] 所述同源重组是将含有所述特异DNA片段的重组载体导入维氏气单胞菌实现的；所述重组载体是将线性化质粒载体、片段甲和片段乙连接得到的；所述片段甲如序列表的序列1所示；所述片段乙如序列表的序列2所示。所述连接是通过无缝克隆实现的。所述质粒载体为质粒pRE112。所述重组载体具体为序列表的序列3所示。

[0020] 本发明还保护一种重组菌，是将特异DNA片段导入维氏气单胞菌进行同源重组后得到的具有所述特异DNA片段的重组菌；所述特异DNA片段包括气溶素基因的上同源臂和下同源臂；所述上同源臂如序列表的序列3自5’端第3092-4276位核苷酸所示；所述下同源臂如序列表的序列3自5’端第4277-5408位核苷酸所示。

[0021] 所述同源重组是将含有所述特异DNA片段的重组载体导入维氏气单胞菌实现的；所述重组载体是将线性化质粒载体、片段甲和片段乙连接得到的；所述片段甲如序列表的序列1所示；所述片段乙如序列表的序列2所示。所述连接是通过无缝克隆实现的。所述质粒载体为质粒pRE112。所述重组载体具体为序列表的序列3所示。

[0022] 以上任一所述维氏气单胞菌具体可为维氏气单胞菌A.veronii Hm091。

[0023] 以上任一所述重组菌具体可为维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)Hm091△aer。

[0024] 维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)Hm091△aer，已于2017年10月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编：100101)，保藏编号为CGMCC No.14776。

[0025] 本发明还保护以上任一所述重组菌在制备疫苗中的应用；所述疫苗为如下(b1)-(b4)中的任一种：

[0026] (b1)水产动物维氏气单胞菌疫苗；

[0027] (b2)水产动物嗜水气单胞菌疫苗；

[0028] (b3)水产动物气单胞菌疫苗；

[0029] (b4)水产动物出血病疫苗。

[0030] 本发明还保护一种制备疫苗的方法，包括如下步骤：将以上任一所述重组菌作为疫苗的活性成分进行包装；所述疫苗为如下(b1)-(b4)中的任一种：

[0031] (b1)水产动物维氏气单胞菌疫苗；

[0032] (b2)水产动物嗜水气单胞菌疫苗；

[0033] (b3)水产动物气单胞菌疫苗；

[0034] (b4)水产动物出血病疫苗。

[0035] 本发明还保护以上任一所述重组菌在制备产品中的应用；所述产品的用途为增加水产动物的免疫力。

[0036] 本发明还保护以上任一所述重组菌在制备产品中的应用；所述产品的用途为如下(c1)-(c4)中的至少一种：

[0037] (c1)预防和/或治疗水产动物维氏气单胞菌感染；

[0038] (c2)预防和/或治疗水产动物嗜水气单胞菌感染；

[0039] (c3)预防和/或治疗水产动物气单胞菌感染；

[0040] (c4)预防和/或治疗水产动物出血病。

[0041] 本发明还保护水产动物维氏气单胞菌疫苗，其活性成分为以上任一所述重组菌。

[0042] 本发明还保护水产动物嗜水气单胞菌疫苗，其活性成分为以上任一所述重组菌。

[0043] 本发明还保护水产动物气单胞菌疫苗，其活性成分为以上任一所述重组菌。

[0044] 本发明还保护水产动物出血病疫苗，其活性成分为以上任一所述重组菌。

[0045] 本发明还保护一种产品，活性成分为以上任一所述重组菌；所述产品的用途为如下(d1)-(d5)中的至少一种：

[0046] (d1)预防和/或治疗水产动物维氏气单胞菌感染；

[0047] (d2)预防和/或治疗水产动物嗜水气单胞菌感染；

[0048] (d3)预防和/或治疗水产动物气单胞菌感染；

[0049] (d4)预防和/或治疗水产动物出血病；

[0050] (d5)增加水产动物的免疫力。

[0051] 以上任一所述疫苗的使用方式具体可为口服或浸浴。

[0052] 以上任一所述产品具体可为水产动物饲料添加剂。

[0053] 以上任一所述气单胞菌具体可为维氏气单胞菌或嗜水气单胞菌。

[0054] 以上任一所述维氏气单胞菌具体可为维氏气单胞菌A.veronii Hm091。

[0055] 以上任一所述嗜水气单胞菌具体可为嗜水气单胞菌A.hydrophila NJ-1。

[0056] 以上任一所述水产动物具体可为斑马鱼、草鱼、鲫、鳙、鲢、鳜、鲤、青鱼、罗非鱼、鳗鲡、白鲫、银鲫、鲟、黄尾鲴、鳊、斑点叉尾鮰、金鱼、黄鳝、牙鲆等鱼类或蛙、大鲵、虾、蟹、鳖、龟等水生动物。

[0057] 本发明的发明人对2009-2014期间中国华南地区出血病爆发机制研究发现维氏气单胞菌占主导地位，维氏气单胞菌及维氏气单胞菌与嗜水气单胞菌的混合感染是华南地区引起鱼类败血症爆发的主要原因，维氏气单胞菌是造成混合感染的前提条件，进一步通过转座子敲除筛选明确了维氏气单胞菌II型分泌系统分泌的气溶素(Aerolysin)是关键致病因子，在混合感染过程中，维氏气单胞菌的气溶素首先破坏宿主的肠道/鳃屏障，可先引起鱼头部口腔周围以及肠道部位造成严重的损伤，然后可以使维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌以及其他细菌通过损伤部位进入到斑马鱼体内，对宿主的全身性侵入，最终引起斑马鱼败血症发生和死亡。

[0058] 本发明具有以下优点：

[0059] 1)本发明基于维氏气单胞菌的气溶素导致斑马鱼感染部位损伤进一步促进相关细菌进入鱼体内是引起出血病爆发的主因这一致病机制，从引发感染的维氏气单胞菌出发研制防治出血病的疫苗，避免了长期以来因气单胞菌出血病致病机理不明导致重视引起后期感染细菌而忽视了引发损伤的关键细菌疫苗的开发，导致长期以来细菌性败血症的疫苗防治效果差这一现状；

[0060] 2)本发明采用的是同源重组原理定点缺失特定基因片段导致基因失活，使获得的基因缺失菌株具有较好的遗传稳定性，避免使用转座子等不稳定基因工程方法构建减毒菌株带来的遗传不稳定的风险。本发明的减毒活疫苗不带有任何抗生素标记，不存在向环境释放抗性菌株或抗生素抗性基因的带来的潜在危害；

[0061] 3)本发明中使用基因敲除的方法敲除气溶素(Aerolysin)关键毒力因子从而获得减毒株，毒力与亲本菌株相比显著降低，同时较好避免灭活疫苗灭活不彻底带了的安全性问题和灭活试剂带来的副作用；

[0062] 4)本发明中的减毒活疫苗对不同来源的气单胞菌具有一定的交叉保护力，具有广谱性；

[0063] 5)本发明中的减毒活疫苗在斑马鱼中具有一定的免疫保护力，说明本发明的减毒活疫苗能有效激活斑马鱼的免疫反应。

[0064] 6)使用本发明提供的疫苗，可显著增强水产动物的免疫力，提高抗病表型。

[0065] 本发明采用无抗生素标记敲除关键毒力因子技术构建的口服或浸浴减毒活疫苗可以在保留免疫抗原性的同时降低病原菌的致病性，免疫保护效果显著，增强天然免疫系统反应和细胞免疫，增强抵抗其它病原菌的感染能力，同时大大减少免疫工作量。

附图说明

[0066] 图1为实施例1敲除质粒的构建流程示意图。

[0067] 图2为实施例1敲除菌鉴定结果。

[0068] 图3为实施例2荧光定位结果。

[0069] 图4为实施例3安全性检测结果。

[0070] 图5为实施例4免疫保护效果统计结果。

具体实施方式

[0071] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

[0072] 维氏气单胞菌气溶素基因的基因组DNA参考序列如序列表的序列5所示。序列5所示的DNA编码序列6所示的蛋白质。

[0073] 质粒pRE112：BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心，货号：3573410。

[0074] 维氏气单胞菌A.veronii Hm091：参考文献：张德锋,刘礼辉,李宁求,等.我国南方地区鱼源气单胞菌不同种类的流行特征[J].水产科学,2015,34(11):673-682.；公众可以从中国农业科学院饲料研究所获得。

[0075] 嗜水气单胞菌A.hydrophila NJ-1：参考文献：Li J,Ni X D,Liu Y J,et al.Detection of three virulence genes alt,ahp and aerA in Aeromonas hydrophila and their relationship with actual virulence to zebrafish[J].Journal of Applied Microbiology,2011,110(3):823-30.；公众可以从中国农业科学院饲料研究所获得。

[0076] E.coli MC1061：BioVector NTCC典型培养物保藏中心，编号：MC1061。

[0077] E.coli S17-1(λpair)：BioVector NTCC典型培养物保藏中心，编号：s17-1。

[0078] MC1061感受态细胞：将E.coli MC1061单菌落接种于50ml LB液体培养基中，37℃、200rpm培养过夜，按5％的接种量接种到含有500ml LB液体培养基的1l三角瓶中，37℃、
250rpm培养，当OD600nm值为0.35～0.4时，将三角瓶冰浴15-30min(期间摇晃一下三角瓶，使菌液均匀的冷却)，然后将菌液转移至提前冰浴预冷的离心管中，1000g、4℃离心15min，弃上清，用500ml冰浴预冷的去离子水重悬菌体；1000g、4℃离心20min，去掉上清，收集菌体并重悬于250ml冰浴预冷的10％(提及百分比)甘油水溶液中，1000g、4℃离心20min，去掉上清，用1ml冰浴预冷的GYT液体培养基重悬菌体；将菌液分装到冰浴预冷的1.5ml无菌EP管中，每管50μl，用液氮迅速冷却后，放-80℃冰箱保存。

[0079] S17(λ)感受态细胞：将E.coli S17-1(λpair)单菌落接种于50ml LB液体培养基中，37℃、200rpm培养过夜，按5％的接种量接种到含有500ml LB液体培养基的1l三角瓶中，37℃、250rpm培养，当OD600nm值为0.35～0.4时，将三角瓶冰浴15-30min(期间摇晃一下三角瓶，使菌液均匀的冷却)，然后将菌液转移至提前冰浴预冷的离心管中，1000g、4℃离心
15min，弃上清，用500ml冰浴预冷的去离子水重悬菌体；1000g、4℃离心20min，去掉上清，收集菌体并重悬于250ml冰浴预冷的10％(提及百分比)甘油水溶液中，1000g、4℃离心20min，去掉上清，用1ml冰浴预冷的GYT液体培养基重悬菌体；将菌液分装到冰浴预冷的1.5ml无菌EP管中，每管50μl，用液氮迅速冷却后，放-80℃冰箱保存。

[0080] 斑马鱼：北京大学斑马鱼水体实验室提供的Tu品系斑马鱼。

[0081] 实施例1、维氏气单胞菌敲除菌的构建

[0082] 一、敲除质粒的构建

[0083] 敲除质粒的构建流程示意图见图1，具体步骤如下：

[0084] 1、用PCR的方法(反应程序：98℃，5min，32×[98℃，20s；58℃，20s；72℃，1min]，72℃，5min)将质粒pRE112线性化，得到线性化质粒片段。

[0085] 2、以维氏气单胞菌A.veronii Hm091的基因组DNA为模板，采用引物Aer-up-F和引物Aer-up-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(序列表的序列1，具有上游同源臂)。

[0086] Aer-up-F：5'-TGAATTCCCGGGAGAATGATCTCGGCGGTACCTGG-3'；

[0087] Aer-up-R：5'-GATCCACACCGGTAAATCAGGGTAGACAGGTTCAG-3'。

[0088] 3、以维氏气单胞菌A.veronii Hm091的基因组DNA为模板，采用引物Aer-down-F和引物Aer-down-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(序列表的序列2，具有下游同源臂)。

[0089] Aer-down-F：5'-CCTGTCTACCCTGATTTACCGGTGTGGATCTGGAC-3'；

[0090] Aer-down-R：5'-GCTTCTTCTAGAGGTTGAGTGAAGGTGGAGCTGAG-3'。

[0091] 4、使用 HiFi DNA Assembly Master Mix(NEB，货号：E2621L)将步骤1得到的线性化质粒、步骤2得到的PCR扩增产物和步骤3得到的PCR扩增产物进行同源重组连接(方法参照试剂盒说明书)，得到敲除质粒(序列表的序列3所示的环状质粒，已测序验证)。

[0092] 二、敲除菌的构建和鉴定

[0093] 1、将步骤一得到的敲除质粒转化MC1061感受态细胞，25uF、2.5kV、200ohm进行电转。电转后，立即加1ml LB液体培养基，37℃、摇床200r/min培养1-1.5h后，离心，去掉900μl，留100μl重悬，然后全部涂到含30ug/ml氯霉素(Cm)的LB固体平板上，37℃培养过夜。对过夜后长出的单菌落通过菌落PCR检测筛选出阳性菌落(采用引物Aer-up-F和引物Aer-up-R进行PCR检测得到2348bp大小的条带)。

[0094] 2、将步骤1鉴定为阳性的单菌落接种至含30ug/ml氯霉素(Cm)的30ml LB液体培养基中，37℃、摇床200r/min培养12h，挑取单菌落提取质粒，采用Hind III限制性内切酶进行酶切鉴定，得到8029bp大小的条带的为阳性质粒。

[0095] 3、将步骤2鉴定正确的阳性质粒转化S17(λ)感受态细胞，25uF、2.5kV、200ohm进行电转。电转后，立即加1ml LB液体培养基，37℃、摇床200r/min培养1-1.5h后，离心，去掉900μl，留100μl重悬，然后全部涂到含30ug/ml氯霉素(Cm)的LB固体平板上，37℃培养过夜。对过夜后长出的单菌落通过菌落PCR检测筛选出阳性菌落(采用引物Aer-up-F和引物Aer-up-R进行PCR检测得到2348bp大小的条带)。

[0096] 4、将步骤3鉴定为阳性的单菌落用接种环重新划线到含30ug/ml氯霉素(Cm)的LB固体平板上，37℃培养24h。

[0097] 5、将维氏气单胞菌A.veronii Hm091接种划线到含30ug/ml氯霉素(Cm)的LB固体平板上，37℃培养24h。

[0098] 6、分别刮取步骤4得到的菌落和步骤5得到的菌落进行结合(刮取步骤4获得菌落在步骤5的平板上划线)，37℃结合8h。

[0099] 7、完成步骤6后，将菌落刮下，用LB液体培养基稀释后涂布到含30μg/ml氯霉素(Cm)+100μg/ml氨苄青霉素(Amp)的LB固体平板上，37℃培养24h。

[0100] 8、完成步骤7后，挑取单菌落，接种到含30μg/ml氯霉素(Cm)+100μg/ml氨苄青霉素(Amp)的LB固体平板上，37℃培养24h。

[0101] 9、完成步骤8后，挑取单菌落，接种到不含有抗生素的LB固体平板上37℃培养24h。

[0102] 10、完成步骤9后，用接种环刮取适量菌落划线到含15％(质量百分比)蔗糖的LB固体平板上，15-25℃低温培养3天，筛选质粒丢失菌株。

[0103] 11、完成步骤10后，挑取50-80个单克隆分别对应划线到含30μg/ml氯霉素(Cm)+100μg/ml氨苄青霉素(Amp)的LB固体平板上，37℃培养24h。

[0104] 12、完成步骤11后，挑取单菌落通过菌落PCR检测筛选出敲除突变菌株。

[0105] 采用维氏气单胞菌A.veronii Hm091(WT)作为对照。分别采用引物Aer-up-F和引物Aer-down-R组成的引物对、引物Aer-confirm-F和引物Aer-confirm-R组成的引物对进行鉴定。引物序列和预期产物片段长度见表1。

[0106] 表1引物信息和预期结果

[0107]

[0108] 结果如图2所示。引物Aer-confirm-F和引物Aer-confirm-R是针对Aer基因设计的引物，野生菌(WT)扩增到目的片段1722bp，敲除菌(Hm091△aer)未扩增到目的片段；引物Aer-up-F和引物Aer-down-R是针对Aer基因上游序列和下游序列设计的引物，野生菌(WT)扩增片段的序列大约是4000bp，敲除菌(Hm091△aer)扩增片段的序列约为2300bp，正好比野生菌少Aer基因片段大小的约1700bp。

[0109] 对野生菌和敲除菌进行测序，结果表明，敲除菌是将序列表中序列4所示的DNA片段取代了野生菌基因组气溶素基因中的相应片段得到的。

[0110] 将其中一株通过上述方法得到的所有敲除菌命名为维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)Hm091△aer，维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)Hm091△aer简称为维氏气单胞菌A.veronii Hm091△aer，将其中一株进行保藏。

[0111] 三、维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)Hm091△aer的保藏

[0112] 维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)Hm091△aer，已于2017年10月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；邮编：100101)，保藏编号为CGMCC No.14776。

[0113] 实施例2、维氏气单胞菌A.veronii Hm091△aer在斑马鱼中的定位

[0114] 1、将维氏气单胞菌A.veronii Hm091接种至30ml LB液体培养基中，37℃、摇床200r/min培养18h；取2ml菌液，5000r/mim离心10min，去掉上清，用PBS洗两次，离心去掉上清，加1ml 0.1M的碳酸氢钠缓冲液重悬菌体，得到A.veronii Hm091碳酸氢钠缓冲液。

[0115] 2、将嗜水气单胞菌A.hydrophila NJ-1接种至30ml LB液体培养基中，37℃、摇床200r/min培养18h；取2ml菌液，5000r/mim离心10min，去掉上清，用PBS洗两次，离心去掉上清，加1ml 0.1M的碳酸氢钠缓冲液重悬菌体，得到A.hydrophila NJ-1碳酸氢钠缓冲液。

[0116] 3、将维氏气单胞菌A.veronii Hm091△aer接种至30ml LB液体培养基中，37℃、摇床200r/min培养18h；取2ml菌液，5000r/mim离心10min，去掉上清，用PBS洗两次，离心去掉上清，加1ml 0.1M的碳酸氢钠缓冲液重悬菌体，得到A.veronii Hm091△aer碳酸氢钠缓冲液。

[0117] 4、将红色荧光染料(Texas )(赛默飞世尔科技T7471)按10mg/ml的浓度添加DMSO进行溶解，得到红色荧光染料溶液。将蓝色荧光染料(Pacific BlueTM)(Invitrogen P10163)按10mg/ml的浓度添加DMSO进行溶解，得到蓝色荧光染料溶液。

[0118] 5、取50μl步骤4得到的红色荧光染料溶液加至步骤2得到的A.hydrophila NJ-1碳酸氢钠缓冲液中，室温避光轻微摇晃孵育1.5h，然后离心取上清，用PBS洗2次，离心去掉上清，最后用1ml PBS重悬，得到A.hydrophila NJ-1红色荧光标记溶液。

[0119] 6、将50μl步骤4得到的红色荧光染料溶液加至步骤1得到的A.veronii Hm091碳酸氢钠缓冲液中，室温避光轻微摇晃孵育1.5h，然后离心取上清，用PBS洗2次，离心去掉上清，最后用1ml PBS重悬，得到A.veronii Hm091红色荧光标记溶液。

[0120] 7、将50μl步骤4得到的蓝色荧光染料溶液加至步骤1得到的A.veronii Hm091碳酸氢钠缓冲液中，室温避光轻微摇晃孵育1.5h，然后离心取上清，用PBS洗2次，离心去掉上清，最后用1ml PBS重悬，得到A.veronii Hm091蓝色荧光标记溶液。

[0121] 8、将50μl步骤4得到的红色荧光染料溶液加至步骤3得到的A.veronii Hm091△aer碳酸氢钠缓冲液中，室温避光轻微摇晃孵育1.5h，然后离心取上清，用PBS洗2次，离心去掉上清，最后用1ml PBS重悬，得到A.veronii Hm091△aer红色荧光标记溶液。

[0122] 9、将嗜水气单胞菌A.hydrophila NJ-1接种至30ml LB液体培养基中，37℃、摇床200r/min培养18h；取2ml菌液，5000r/mim离心10min，去掉上清，用PBS洗两次，离心去掉上清，加PBS重悬菌体，得到A.hydrophila NJ-1溶液。

[0123] 10、将维氏气单胞菌A.veronii Hm091△aer接种至30ml LB液体培养基中，37℃、摇床200r/min培养18h；取2ml菌液，5000r/mim离心10min，去掉上清，用PBS洗两次，离心去掉上清，加PBS重悬菌体，得到A.veronii Hm091△aer溶液。

[0124] 11、将孵化后2天的斑马鱼随机分为如下5组(将每组鱼分装到6孔板中，每孔10ml水，15尾鱼)：

[0125] 组A(对照组)：采用PBS感染斑马鱼；

[0126] 组B(A.hydrophila NJ-1红色荧光标记感染组)：采用A.hydrophila NJ-1红色荧光标记溶液感染斑马鱼，A.hydrophila NJ-1在感染孔中的浓度为4×107CFU/ml；

[0127] 组C(A.veronii Hm091红色荧光标记感染组)：采用A.veronii Hm091红色荧光标记溶液感染斑马鱼，A.veronii Hm091在感染孔中的浓度为4×107CFU/ml；

[0128] 组D(A.hydrophila NJ-1红色荧光标记+无标记A.veronii Hm091感染组)：采用A.hydrophila NJ-1红色荧光标记溶液和A.veronii Hm091溶液感染斑马鱼，A.hydrophila NJ-1在感染孔中的浓度为4×107CFU/ml，A.veronii Hm091在感染孔中的浓度为4×107CFU/ml；

[0129] 组E(A.hydrophila NJ-1红色荧光标记+A.veronii Hm091蓝色荧光标记)：采用A.hydrophila NJ-1红色荧光标记溶液和A.veronii Hm091蓝色荧光标记液感染斑马鱼，A.hydrophila NJ-1在感染孔中的浓度为4×107CFU/ml，A.veronii Hm091在感染孔中的浓度为4×107CFU/ml；

[0130] 组F(A.veronii Hm091△aer红色荧光标记感染组)：采用A.veronii Hm091△aer7
红色荧光标记溶液感染斑马鱼，A.veronii Hm091△aer在感染孔中的浓度为4×10 CFU/ml；

[0131] 组G(A.hydrophila NJ-1红色荧光标记+无标记A.veronii Hm091△aer感染组)：采用A.hydrophila NJ-1红色荧光标记溶液和A.veronii Hm091△aer溶液感染斑马鱼，
7
A.hydrophila NJ-1在感染孔中的浓度为4×10CFU/ml，A.veronii Hm091△aer在感染孔中的浓度为4×107CFU/ml。

[0132] 上述各组感染4h后用4％的多聚甲醛分别将小鱼进行固定；固定好的小鱼在激光共聚焦显微镜下拍照观察细菌在斑马鱼中的定位。

[0133] 结果如图3所示。在对照组斑马鱼小鱼中，没有观察到任何的荧光信号(A)；在红色荧光标记的嗜水气单胞菌A.hydrophila NJ-1感染组(B)、红色荧光标记的维氏气单胞菌A.veronii Hm091△aer感染组(F)、红色荧光标记的嗜水气单胞菌A.hydrophila NJ-1+维氏气单胞菌A.veronii Hm091△aer感染组中(G)，在斑马鱼小鱼的肠道中可以观察到红色荧光信号，但仅仅局限于肠腔内。然而，在红色荧光标记或蓝色荧光标记的维氏气单胞菌A.veronii Hm091感染组中，在斑马鱼的肠道中不仅可以观察到很强的荧光信号，而且在肠道的周围以及头部都可以检测到荧光信号(C和E)；有趣的是，在红色荧光标记的嗜水气单胞菌NJ-1+有无蓝色荧光标记的维氏气单胞菌A.veronii Hm091感染组中，NJ-1的荧光信号同样可以在斑马鱼肠道的周围以及头部能检测到(D和E)。这些数据表明由维氏气单胞菌分泌的气溶素可以破坏斑马鱼的肠道屏障，促使它本身以及其他气单胞菌特别是嗜水气单胞菌进入到鱼的体内，导致鱼的溶血及死亡。而维氏气单胞菌A.veronii Hm091△aer则不具备破坏斑马鱼的肠道屏障的能力。

[0134] 实施例3、维氏气单胞菌A.veronii Hm091△aer疫苗的安全性

[0135] 1、将维氏气单胞菌A.veronii Hm091接种至LB固体培养基上，37℃培养12h，然后挑取单克隆接种至30ml的LB液体培养基中，37℃，摇床200r/min培养18h。

[0136] 2、将维氏气单胞菌A.veronii Hm091△aer接种至LB固体培养基上，37℃培养12h，然后挑取单克隆接种至30ml的LB液体培养基中，37℃，摇床200r/min培养18h。

[0137] 3、分别将步骤1和步骤2培养的维氏气单胞菌A.veronii Hm091和维氏气单胞菌A.veronii Hm091△aer以不同的浓度(2.5×108CFU/ml、1.0×108CFU/ml、5.0×107CFU/ml、3.33×107CFU/ml、2.5×107CFU/ml和1.67×107CFU/ml)感染孵化后5天的斑马鱼(浸浴)，统计96h内斑马鱼的死亡情况。

[0138] 结果如图4所示。维氏气单胞菌A.veronii Hm091△aer分别在3.3×107CFU/ml、2.5×107CFU/ml、1.67×107CFU/ml的浸浴浓度下没有斑马鱼出现死亡，而感染野生株后，在
24小时内可造成斑马鱼100％的死亡率。结果表明敲除Aer明显降低维氏气单胞菌的毒力，维氏气单胞菌A.veronii Hm091△aer在感染浓度≤3.3×107CFU/ml下浸浴是安全的。

[0139] 实施例4、维氏气单胞菌A.veronii Hm091△aer疫苗保护性研究

[0140] 一、维氏气单胞菌A.veronii Hm091△aer疫苗对斑马鱼血清免疫球蛋白含量的影响

[0141] 将3月龄的斑马鱼随机分为如下三组：

[0142] 组1(对照组)：正常饲养斑马鱼2周，每天两次饱食投喂基础饲料；

[0143] 组2(饲喂免疫组)：正常饲养斑马鱼2周，每天两次饱食投喂含维氏气单胞菌7
A.veronii Hm091△aer(2×10CFU/g)的基础饲料；

[0144] 组3(浸浴免疫组)：正常饲养斑马鱼2周，每周浸浴含维氏气单胞菌A.veronii Hm091△aer的水一次(2×107CFU/ml，浸浴时间12h)，每天两次饱食投喂基础饲料。

[0145] 经过各组处理后，每组斑马鱼经尾静脉采血，按鱼IGM试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)说明书对进行斑马鱼免疫球蛋白指标检测。

[0146] 根据试剂盒方案测定Logistic曲线，得出免疫球蛋白方程y＝(A-D)/[1+(x/C)B]+D(其中：A＝5.61378；B＝0.36217；C＝0.14147；D＝-0.12176；r2＝0.99394)。经测定，三组斑马鱼免疫球蛋白浓度平均值如下：对照组:7.304175ng/ml；饲喂免疫组:13.646945ng/ml；浸浴免疫组:16.00466ng/ml。结果表明，经疫苗免疫后斑马鱼血清免疫球蛋白含量均有一定提升。

[0147] 二、维氏气单胞菌A.veronii Hm091△aer疫苗斑马鱼的血清抗体凝集效价[0148] 将3月龄的斑马鱼随机分为如下三组：

[0149] 组1(对照组)：正常饲养斑马鱼2周，每天两次饱食投喂基础饲料；

[0150] 组2(饲喂免疫组)：正常饲养斑马鱼2周，每天两次饱食投喂含维氏气单胞菌7
A.veronii Hm091△aer(2×10CFU/g)的基础饲料；

[0151] 组3(浸浴免疫组)：正常饲养斑马鱼2周，每周浸浴含维氏气单胞菌A.veronii Hm091△aer的水一次(4×107CFU/L，浸浴时间12h)，每天两次饱食投喂基础饲料。

[0152] 经过各组处理后，每组斑马鱼经尾静脉采血，取血清用于测定血清抗体效价。采用96孔血凝板法进行。将维氏气单胞菌A.veronii Hm091培养液12000rpm离心后用等量生理盐水重悬，得到菌悬液(浓度为4×107CFU/ml)。用微量移液器于第l孔中加入80μl生理盐水，其余各孔加50μl；向第1个孔中加入20μl的待测血清，吹吸混匀后取50μl加入第2孔(1:2稀释)，再混匀后从第2孔取50μl加入第3孔(1:4稀释)，依此类推至第9孔(1：256稀释)，弃去
50μl，第10孔作为对照；向每个孔中加入50μl维氏气单胞菌悬液，吹吸混匀，置于37℃培养箱中孵育1h，放置在4℃条件下过夜检测。

[0153] 实验重复两次(第一组和第二组)，结果如表2所示。维氏气单胞菌A.veronii Hm091△aer疫苗通过饲喂和浸浴两种方式对成年斑马鱼进行免疫，对照组、饲喂组及浸浴组的血清抗体凝集效价分别为23～24、24～25及24，饲喂组血清抗体水平略高于对照组血清抗体水平。

[0154] 表2抗体效价检测结果

[0155]

[0156] 三、浸浴和口服维氏气单胞菌A.veronii Hm091△aer疫苗对斑马鱼的相对免疫保护率

[0157] 组1(对照组，CK)：正常饲养斑马鱼2周，每天两次饱食投喂基础饲料；

[0158] 组2(饲喂免疫组，T1)：正常饲养斑马鱼2周，每天两次饱食投喂含维氏气单胞菌A.veronii Hm091△aer(2×107CFU/g)的基础饲料；

[0159] 组3(浸浴免疫组，T2)：正常饲养斑马鱼2周，每周浸浴含维氏气单胞菌A.veronii Hm091△aer的水一次(3×107CFU/ml，浸浴时间12h)，每天两次饱食投喂基础饲料。

[0160] 经过各组处理后，每组斑马鱼随机分为如下三组：

[0161] 组A(A.hydrophila NJ-1+氯化铵)：采用200mg/L氯化铵感染斑马鱼(浸浴)，12h后加入2×107CFU/ml的维氏气单胞菌A.veronii Hm091。

[0162] 组B(A.veronii Hm091)：维氏气单胞菌A.veronii Hm091以2×107CFU/ml的浓度感染斑马鱼(浸浴)。

[0163] 组C(A.veronii Hm091+A.hydrophila NJ-1)：维氏气单胞菌A.veronii Hm091和嗜水气单胞菌A.hydrophila NJ-1以每种菌2×107CFU/ml的浓度感染斑马鱼(浸浴)。

[0164] 统计96h内斑马鱼的死亡情况，并根据公式计算免疫保护率(RPS)，RPS＝(1-免疫组死亡数/对照死亡数)×100％

[0165] 结果如图5和表3所示。

[0166] 表3疫苗保护率统计结果

[0167]

[0168] 图5结果表明，浸浴免疫组斑马鱼死亡时间延长，但没有明显的保护效果。而饲喂免疫方式对NJ-1+氯化铵、Hm091、Hm091+NJ-1浸浴功毒都有明显的免疫保护作用，斑马鱼存活率有明显提升。

[0169] 表3结果表明，浸浴免疫组免疫保护率较低，没有起到明显的保护作用。而饲喂免疫组对NJ-1+HM091免疫保护率达到33％，有一定保护作用；对NJ-1+氯化铵组，HM091免疫保护率达到80％，有很强的免疫保护作用。