检测猪圆环病毒2型IgM抗体ELISA的试剂盒及检测方法

摘要

一种检测猪圆环病毒2型IgM抗体的ELISA试剂盒，包括有：抗原包被微孔板，HRP标记的指示抗原，标准阳性和标准阴性对照血清，底物，洗涤液和终止液；其中抗原包被微孔板，是通过构建串联表位蛋白，用大肠杆菌(E.coli)重组表达，筛选到高亲和活性和特异性的串联表位蛋白CapEpiⅡ和CapEpiⅣ，将CapEpiⅡ作为IgM捕获抗原，以37.5ng/mL的浓度，4℃过夜包被96孔微孔板而得到；HRP标记的指示抗原，是利用HRP标记CapEpiⅣ，并通过已知IgM阳性血清滴定其最佳工作浓度，来作为IgM指示抗原。本发明具有较好的敏感性和特异性，无需对待检血清稀释，操作简单，适用于田间大量样品的快速检测；可有效检测PCV2感染后IgM的产生。

权利要求

1.一种检测猪圆环病毒2型IgM抗体ELISA的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括有：抗原包被微孔板，HRP标记的指示抗原，标准阳性和标准阴性对照血清，底物，洗涤液和终止液；

具体为：

a.所述的抗原包被微孔板，是通过构建串联表位蛋白，用大肠杆菌(E.coli)重组表达，筛选到高亲和活性和特异性的重组蛋白CapEpiⅡ，其具有SEQUENCE LISTING.1所示的氨基酸序列，将CapEpiⅡ作为IgM捕获抗原，以37.5ng/mL的浓度，4℃过夜包被96孔微孔板而得到；

b.所述的HRP标记的指示抗原，是利用HRP标记CapEpiⅣ，并通过已知IgM阳性血清滴定其最佳工作浓度，来作为IgM指示抗原；所述的CapEpiⅣ是通过构建串联表位蛋白，用大肠杆菌(E.coli)重组表达，筛选到高亲和活性和特异性的重组蛋白，其具有SEQUENCE LISTING.2所示的氨基酸序列；

c.所述的标准阳性和标准阴性对照血清，是通过PCV2细胞毒(HLJ1501)感染和未感染仔猪，采集血液，分离血清获得；

d.所述的底物，是3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)；

e.所述的洗涤液，是含0.1％吐温-20的磷酸盐缓冲液(PBST)；

f.所述的终止液，是1.5mol/L的H2SO4。

说明书

检测猪圆环病毒2型IgM抗体ELISA的试剂盒及检测方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测猪圆环病毒2型(PCV2)IgM抗体的双抗原夹心ELISA(酶联免疫吸附试验)试剂盒，本发明还涉及应用该试剂盒检测猪圆环病毒2型IgM抗体的双抗原夹心ELISA方法。

背景技术

[0002] PCV2是圆环病毒科、圆环病毒属成员，是引起5～18周龄断奶后仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的主要病原，同时该病毒还与多种猪病发生相关，统称这类病为圆环病毒相关疾病(PCVAD)。PCV2在世界多数国家都有流行的报道，在猪群中呈隐性感染和持续性带毒，引起机体免疫功能系统性抑制或紊乱，继而导致继发性感染且可严重干扰多种疫苗免疫效果，加剧规模化猪场疫病流行的复杂性和经济损失，是近年来我国集约化养猪业生产中危害最为严重的病原之一。如果对临床感染病例的准确快速诊断，就能为疾病的有效防控提供指导。因此，研制敏感、特异的PCV2诊断方法，进行准确诊断，对PCVAD的有效防控尤为重要。

[0003] PCV2为单股环状DNA病毒，大小约为1.7kb，编码衣壳蛋白(Cap)和复制酶(Rep)蛋白两个主要功能性蛋白。衣壳蛋白是构成病毒衣壳的唯一结构蛋白和最主要免疫原性蛋白。已有研究证实，衣壳蛋白N端核定位信号肽(NLS)序列26～36区段存在一个抗原中和表位，同时氨基酸残基第65～87、113～147、102～107、119～128、157～183、193～233六个区段能够诱导实验动物产生抗衣壳蛋白免疫反应。表明衣壳蛋白上的抗原表位可以作为评价疫苗免疫或PCV2感染的理想候选抗原，可以用于PCV2血清抗体诊断产品的研制。

发明内容

[0004] 本发明的第一目的是提供一种操作简单、准确诊断、适用于田间大量样品快速检测的检测猪圆环病毒2型IgM抗体ELISA的试剂盒；本发明的另一目的是提供一种检测猪圆环病毒2型IgM抗体的双抗原夹心ELISA方法。

[0005] 本发明实现第一目的所采用的技术方案如下：一种检测猪圆环病毒2型IgM抗体ELISA的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括有：抗原包被微孔板，HRP标记的指示抗原，标准阳性和标准阴性对照血清，底物，洗涤液和终止液；具体为：

[0006] a.本发明试剂盒涉及的抗原包被微孔板，是通过构建串联表位蛋白，用大肠杆菌(E.coli)重组表达，筛选到高亲和活性和特异性的串联表位蛋白CapEpiⅡ和CapEpiⅣ，将CapEpiⅡ作为IgM捕获抗原，以37.5ng/mL的浓度，4℃过夜包被96孔微孔板而得到。

[0007] b.本发明试剂盒涉及的HRP标记的指示抗原，是利用HRP标记CapEpiⅣ，并通过已知IgM阳性血清滴定其最佳工作浓度，来作为IgM指示抗原。

[0008] c.本发明试剂盒涉及的标准阳性和标准阴性对照血清，是通过PCV2细胞毒(HLJ1501)感染和未感染仔猪，采集血液，分离血清获得。

[0009] d.本发明试剂盒涉及的底物，是3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)。

[0010] e.本发明试剂盒涉及的洗涤液，是含0.1％吐温-20的磷酸盐缓冲液(PBST)。

[0011] f.本发明试剂盒涉及的终止液，是1.5mol/L的H2SO4。

[0012] 本发明实现第二目的所采用的技术方案如下：一种检测猪圆环病毒2型IgM抗体的双抗原夹心ELISA方法；其特征在于通过串联表位蛋白捕获和指示血清中PCV2特异性IgM抗体，从而鉴定PCV2感染；具体步骤为：

[0013] a.首先用37.5ng/mL的CapEpiⅡ包被微孔板，经固定和封闭处理后，分别加入待检血清样品和标准阴阳性血清，37℃孵育60min；

[0014] b.用洗涤液PBST洗涤5次，加入HRP标记的CapEpiⅣ，37℃孵育60min；

[0015] c.再次用洗涤液PBST洗涤5次，加入TMB底物，室温避光20min；

[0016] d.加入终止液，并读取OD450nm值；

[0017] e.结果判定，当标准阳性血清OD450nm/标准阴性血清OD450nm>2.1，且阴性血清OD450nm<0.3时表明实验成立；当样品血清OD450nm/标准阴性血清OD450nm≥2.1为IgM阳性，表明PCV2感染；当样品血清OD450nm/标准阴性血清OD450nm<2.1为IgM阴性，健康。

[0018] 本发明将PCV2衣壳蛋白上已知的抗原表位，依次串联，表位间利用柔性氨基酸作为接头，并在大肠杆菌(E.coli)中成功获得重组表达蛋白，重组蛋白命名为：CapEpiⅠ、CapEpiⅡ、CapEpiⅢ和CapEpiⅣ。血清学试验证实，这些重组蛋白均具有结合PCV2血清抗体功能，而CapEpiⅡ和CapEpiⅣ具有较高的结合活性和特异性，其氨基酸序列参见SEQUENCE LISTING.1和SEQUENCE LISTING.2。将重组CapEpiⅣ抗原通过碘酸钠法标记上辣根过氧化物酶(HRP)，以其作为IgM指示抗体，以CapEpiⅡ为IgM捕获抗体，研制双抗原夹心ELISA方法，可检测血清中PCV2的IgM抗体(参见图1)。

[0019] 本发明对PCV2细胞毒接种动物血清以及田间样品检测，同时与同类商品化产品比较，结果证实，本发明提供的方法与同类商品化产品具有较高的符合率，能用于田间PCV2感染样品检测，并且本发明提供的方法能检测出更多的IgM阳性样品，表明其具有更好的敏感性。

[0020] 通过对本发明提供的方法的特异性进行验证，结果显示该方法对PRRSV和CSFV弱毒活苗免疫猪血清，以及已知PCV2 IgG阳性猪血清，进行检测，结果均为阴性，表明其具有较好特异性。

[0021] 本发明涉及的方法具有较好的敏感性和特异性，同时本发明提供的方法无需对待检血清稀释，操作简单，适用于田间大量样品的快速检测。本发明可有效检测PCV2感染后IgM的产生，为鉴定PCV2感染提供了可靠的检测方法，也为PCV2疫情防控提供科学指导。

附图说明

[0022] 图1是本发明的检测原理图。

[0023] 图2是衣壳蛋白上不同表位的串联方式图；将PCV2衣壳蛋白上已知表位，用编码柔性氨基酸的衔接Linker序列串联。

[0024] 图3是CapEpiⅠ、CapEpiⅡ、CapEpiⅢ和CapEpiⅣ的表达、纯化和western blot验证；泳道1、3、5和7：分别为18℃条件下，CapEpiⅠ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ未诱导对照组菌体裂解后的上清；泳道2、4、6和8：分别为18℃条件下，CapEpiⅠ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ诱导组菌体裂解后的上清；泳道9、11、13和15：分别为37℃条件下，CapEpiⅠ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ未诱导对照组菌体裂解后的上清；泳道10、12、14和16：分别为37℃条件下，CapEpiⅠ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ诱导组菌体裂解后的上清；泳道
17-20：分别为CapEpiⅠ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的纯化结果；泳道21-24；分别为CapEpiⅠ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的western blot验证。

[0025] 图4是标准血清制备检测图；A:ELISA检测，PCV2感染1周和未感染猪血清进行倍比稀释后，用衣壳蛋白作为包被蛋白，以HRP标记的抗猪IgM抗体为第二抗体，进行ELISA检测；B:Western blot检测，泳道1，PCV2感染1周猪血清为第一抗体，HRP标记的抗猪IgM为第二抗体；泳道2，未感染血清猪血清为第一抗体，HRP标记的抗猪IgM为第二抗体。

具体实施方式

[0026] 1.重组CapEpiⅠ、CapEpiⅡ、CapEpiⅢ与CapEpiⅣ抗原的制备

[0027] 1.1基因合成

[0028] 采用人工基因合成方式获得融合PCV2衣壳蛋白抗原表位基因序列。以当前田间主要流行毒株(HLJ1501,GenBank NO.:KY940534)基因序列为参考，将7个抗原结构域区域:“26aa～36aa，47aa～62aa，65aa～87aa，117aa～134aa，157aa～183aa，193aa～210aa，
228aa～233aa”,4个一组进行串联，2个抗原结构域区段之间用柔性接头(Linker)序列(ggtggcggaggatccggtggcggaggatccggtggcgg aggatcc，编码氨基酸GGGGSGGGGSGGGGS)连接，确保两个结构域独自发挥功能。序列两端加EcoRI和XhoI限制性酶切位点，序列送上海捷瑞生物工程有限公司进行基因合成，获得4组基因序列CapEpiⅠ、CapEpiⅡ、CapEpiⅢ和CapEpiⅣ，如图2所示。

[0029] 1.2重组表达载体的构建

[0030] 用限制性内切酶EcoRI和XhoI，分别将CapEpiⅠ、CapEpiⅡ、CapEpiⅢ与CapEpiⅣ片段和pGEX-6p-1载体酶切，再经过切胶、回收，浓度测定后，按照载体和目的片段摩尔比≈1∶3混合，用T4DNA连接酶16℃连接过夜。转化DH5a感受态细胞，在LB平板(LB固体培养基，抗性/浓度，Amp+/1μg/mL)37℃，培养12～18h。挑取单克隆，LB液体培养基(含Amp+，1μg/mL)增菌后，提取质粒进行EcoRI和XhoI双酶切鉴定和PCR鉴定，鉴定得到的阳性重组质粒分别命名为CapEpiⅠ、CapEpiⅡ、CapEpiⅢ与CapEpiⅣ。

[0031] 1.3CapEpiⅠ、CapEpiⅡ、CapEpiⅢ与CapEpiⅣ重组蛋白表达、纯化和鉴定[0032] 1.3.1.重组蛋白原核表达：将重组质粒CapEpiⅠ、CapEpiⅡ、CapEpiⅢ与CapEpiⅣ分别转化表达菌株BL21(Star)感受态细胞，37℃过夜培养，长出单克隆菌落后，每个样品挑取1个单克隆菌株，接种到5mL LB液体培养中，220r/min，37℃，8-12h振荡培养；然后分别从该管中取菌液，以1:100的比例，相应转接到4个50ml新的LB液体培养基中，220r/min，37℃，培养约3h至OD600nm≈0.5～0.6，在其中的2个管中加入IPTG的终浓度为0.5mmol/L，剩余2管作为未诱导对照，诱导和对照俩个一组，分别置18℃和37℃摇床，200r/min振荡诱导培养12h，然后，12000rpm，离心2min，收获菌体。

[0033] 1.3.2.SDS-PAGE鉴定：将步骤1.3.1.所得菌体加入1mL pH8.0的Tris-HcL缓冲液重悬，分别进行超声，10000r/min离心15min，留取上清液；取60μL上清液与20μL 4×蛋白上样缓冲液混合，100℃水浴煮10min。配制质量百分比为12％的SDS-PAGE蛋白质电泳凝胶，加入煮过的样品，每个样品10μL，加入标准蛋白分子量Marker 6μL，进行蛋白电泳。然后用考马斯亮蓝染色液染色30min，脱色液脱色后观察到，与对照以及37℃条件诱导组比较，18℃条件下诱导的菌样品上清中出现明显大小与预期大小相符的，约为37kDa的蛋白，表明重组CapEpiⅠ、CapEpiⅡ、CapEpiⅢ与CapEpiⅣ蛋白均得到表达，并且在18℃条件下诱导为可溶性表达，如图3所示。

[0034] 1.3.3.Western Blot鉴定：将重组蛋白表达菌超声后上清，进行SDS-PAGE电泳，然后转到PVDF膜，利用PCV2抗体阳性血清作为第一抗体，以HRP标记的抗猪单克隆抗体为第二抗体，用ECL发光底物作为显色剂，进行western blot检测。结果均出现与目的蛋白大小相符的目的条带，表明重组CapEpiⅠ、CapEpiⅡ、CapEpiⅢ与CapEpiⅣ蛋白可以被PCV2阳性血清识别，具有抗体结合活性如图3所示。

[0035] 1.3.4.重组蛋白纯化：扩繁重组蛋白表达菌，18℃，IPTG诱导后，收集菌体，超声裂解，离心收集上清，用GST标签蛋白纯化树脂按操作说明进行目的蛋白纯化，得到大小与预期相符的单一蛋白条带，表明目的蛋白得到纯化，如图3所示。

[0036] 1.3.5.间接ELISA实验鉴定：结合活性和特异性，将浓度为5μg/mL纯化的CapEpiⅠ、CapEpiⅡ、CapEpiⅢ与CapEpiⅣ重组蛋白分别包被96孔板；同时用重组全长衣壳蛋白包被ELISA板作为阳性对照。检测3份(S1～S3)已知PCV2抗体阳性血清(P)，已知无PCV2特异性抗体的1份阴性血清(N1)作为第一抗体，以1份猪瘟病毒(CSFV)抗体阳性血清(CSF1)，1份猪圆环病毒1型(PCV1)抗体阳性血清(PCV1S1)，1份猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)阳性牛血清(PRRS1)和1份猪细小病毒(PPV)阳性血清(PP1)作为抗原特异性分析样品，上述样品均做1∶20稀释与上述四种抗原相互作用,血清作2孔重复，重复测3次，取平均值。以辣根过氧化物酶(HRP)标记兔抗猪IgG为第二抗体，TMB为底物，酶标仪吸光度OD450nm波长读结果，计算结果见表1。

[0037] 表1间接ELISA实验鉴定重组CapEpiⅠ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ结合活性和特异性

[0038]

[0039] 注：N1血清样品中PCV2、CSFV、PRRSV和PPV特异抗体均为阴性，计算P/N值均依据此血清检测OD450nm值。OD450nm值为3次均值。

[0040] 依据间接ELISA血清抗体检测方法判断公式：阳性血清判定标准：阳性血清OD450值/阴性血清OD450nm值>2.1(即P/N>2.1)，该血清样品即为阳性。计算这些血清P/N值结果说明，重组表位抗原CapEpiⅠ、CapEpiⅡ、CapEpiⅢ和CapEpiⅣ与完整重组衣壳蛋白具有相近的与阳性血清反应的能力，并且这些重组表位抗原重也同样具有PCV2特异性，适合用于研制CSFV血清抗体的检测方法。同时，比较CapEpiⅠ、CapEpiⅡ、CapEpiⅢ和CapEpiⅣ与这些PCV2抗体阳性和阴性样品反应发现，CapEpiⅡ和CapEpiⅣ与N1，PCV1S1，PRRS1，CSF1和PP1有更低的OD450nm值，具有较高的P/N值，因此拟选择用为检测抗原。CapEpiⅡ和CapEpiⅣ的氨基酸序列参见说明书序列表SEQUENCE LISTING.1和SEQUENCE LISTING.2。

[0041] 2.HRP-CapEpiIV以及PCV2 IgM标准阴阳性血清的制备

[0042] 2.1制备HRP标记的CapEpiIV抗原

[0043] 2.1.1.取2ml纯化获得的浓度为1mg/ml的CapEpiIV，加入透析袋中，在pH9.6的0.2M碳酸盐缓冲液中透析，换液两次以上。

[0044] 2.1.2.取10mg HRP溶解于2ml蒸馏水中，加入0.1M的新配制的NaIO4溶液0.4ml，避光室温搅拌20min。然后将该溶液装入透析袋，放入1mM，pH4.4的醋酸钠缓冲液中，4℃透析过夜。

[0045] 2.1.3.加0.2M，pH9.6的碳酸盐缓冲液，调HRP溶液pH值到9.0～9.5。立即与透析好的CapEpiIV混合，室温避光轻轻搅拌2h。

[0046] 2.1.4.加0.2ml新配的4mg/ml NaBH4溶液，混匀，置4℃，2h；将该溶液装入透析袋中，用0.15M，pH7.4的PBS透析，4℃过夜。

[0047] 2.1.5.在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，4℃沉淀1h；而后在3000rpm/min，离心30min，弃上清。沉淀物用半饱和(NH4)2SO4洗二次，沉淀物溶于0.15M，pH7.4的PBS中。将所得溶液装入透析袋中，用0.15M，pH7.4的PBS缓冲液透析，用萘氏试剂检测去除铵离子后，10000rpm/min，离心30min去除沉淀，上清液即为酶结合物，用分光光度计测定含量，然后加入体积百分比为40％的甘油，置于-20℃保存。

[0048] 2.2PCV2 IgM标准阴阳性血清的制备

[0049] 饲养2头30日龄仔猪，经PCR和血清抗体检测，确定未有PCV2感染。其中1头取血分离血清；另一头用PCV2田间分离毒株(HLJ1501，Genebank NO.KY940534)感染，感染后7天取血收集血清。用重组衣壳蛋白包被酶标板，用HRP标记的抗猪IgM抗体作为第二抗体，检测血清中的PCV2衣壳蛋白特异性IgM抗体。同时用western blot方法进行验证，将重组衣壳蛋白转至PVDF膜，与待测血清孵育，用HRP标记抗猪IgM抗体作为指示抗体，ECL为底物进行显色。结果证实PCV2感染后7天，仔猪体内能够产生IgM抗体，可以作为标准阳性对照血清，而未感染猪则无PCV2特异性IgM抗体，可以作为标准阴性对照血清，如图4所示。

[0050] 3.一种检测PCV2 IgM抗体的夹心ELISA方法的建立

[0051] 3.1CapEpiⅡ抗原包被

[0052] 3.1.1.抗原包被浓度选择

[0053] 用50mM，pH9.6的碳酸盐缓冲液，将纯化的CapEpiⅡ抗原倍比稀释成10μg/ml-9ng/mL,每个浓度包被4孔，100μl/孔，加入酶标板中，封口膜密封，置4℃过夜包被；洗板后，加入100微升已知IgM阳性和阴性血清，室温孵育1h，再次洗板，加入HRP标记抗猪IgM二抗，室温
1h，用TMB底物显色，读取OD450nm值。当包被抗原浓度为37.5ng/mL时，阳性血清样品与阴性血清样品的比值差异最显著，是最适抗原包被量，在此条件下既节约了抗原，也最大程度的降低非特异性反应发生。因此抗原包被浓度选择为37.5ng/mL，对照结果见表2。

[0054] 表2CapEpiⅡ包被浓度选择

[0055]

[0056] 3.1.2.抗原固定

[0057] 包被过夜的酶标板，用300μl/孔1×PBST(pH 7.2)洗涤液洗涤3次，最后一次拍干。加入50μl/孔的抗原稳定缓冲液：质量浓度为0.01％多聚甲醛，0.01M的PBS，pH7.2，室温作用5min，用1×PBST洗涤5次，拍干。

[0058] 3.1.3.封闭抗原预包被板

[0059] 加入200μl/孔的封闭液：0.8％蔗糖(w/v)、1％明胶(w/v)、0.8％酪蛋白(w/v)，1×PBST，pH 7.2，室温作用30min，然后1×PBST洗涤3次，拍干，彻底干燥酶标板后，加入干燥剂和抽真空密封，即为抗原包被板。

[0060] 3.2待检样品稀释度确定

[0061] 选择5份PCV2 IgM阳性(S1-S5)和1份PCV2 IgM阴性血清，按照原倍，1:50,1:100,1:200稀释，分别加入到CapEpiⅡ抗原包被微孔板，以HRP标记的抗猪IgM抗体为第二抗体，进行ELISA检测。以满足“检测出的IgM阳性情况与实际完全相符，P/N值>2.1”条件的稀释倍数，作为待检血清的稀释度。结果原倍血清稀释的检测与实际完全相符，P/N值符合要求，因此待检血清样品直接按照原倍检测，省去稀释的步骤，提高了低IgM含量样本的检出效率，对照结果见表3。

[0062] 表3血清稀释度选择

[0063]

[0064] 注：★表示P/N<2.1判定结果为阴性。

[0065] 3.3HRP-CapEpiIV工作浓度滴定

[0066] 将PCV2 IgM阳性、阴性血清加入CapEpiⅡ抗原包被微孔板，利用不同倍数稀释的HRP-CapEpiIV作为指示抗体，进行ELISA检测。选择满足“阳性OD450nm值在1.0-2.0之间，阴性OD450nm值小于0.2，同时P/N值最大”条件的稀释度，作为HRP-CapEpiIV最佳工作浓度。试验确定HRP-CapEpiIV工作浓度为1∶10000(HRP-CapEpiIV质量含量为25.5ng/mL)，对照结果见表4。

[0067] 表4HRP-CapEpiIV工作浓度选择

[0068]

[0069] 3.4样品检测流程

[0070] 3.4.1加样：在CapEpiⅡ抗原包被微孔板中分别加入100μl的标准阴阳性血清(各2孔)和待测血清标本。加样完成后，用封口贴密封微孔板，使用微量振荡器震动30s或者手工在实验操作台上向左右轻轻平行摇晃60s混匀。将已密封微孔板放置于37℃孵育60min。

[0071] 3.4.2洗涤：孵育完毕后，弃尽微孔内液体，1×PBST洗板5次。洗涤结束后用吸水纸拍干微孔壁内残余液体，并将微孔板外部液体与指纹擦拭干净。

[0072] 3.4.3加酶结合物：在所有孔中加入100μl/孔酶结合物HRP-CapEpiIV，密封微孔板放置于37℃孵育60min。而后再次洗涤，洗涤方法按照步骤3.4.2进行。

[0073] 3.4.4TMB底物显色：底物A和底物B按体积比为1∶1比例混匀，底物溶液A：TMB浓度为5mg/mL DMSO溶液；底物B：500ml双蒸水溶解13.608g CH3COONa·3H2O，用1mol/L柠檬酸调pH至6.0，加入1mL体积百分比为30％双氧水，定容至1000ml；100μl/孔，自动或手动混合30s至混匀，室温避光静置20min显色。

[0074] 3.4.5终止反应：取出微孔板，此时可以明显看到各微孔内呈现不均一的蓝色，每孔加入50μl的1.5mol H2SO4终止液，轻微混匀；此时各微孔内的蓝色渐变为黄色。

[0075] 3.4.6读值：将已终止反应的微孔板置于酶标仪读数槽内，使用检测波长450nm与参考波长630nm的双波长测量读取各孔的吸光度值；在30min内完成数据读取。

[0076] 3.4.7结果判定：

[0077] 3.4.7.1实验成立条件：当阳性标准品OD450nm＞1.0，阴性标准品OD450nm<0.3时，判定实验成立。

[0078] 3.4.7.2结果判定：血清样品OD450nm值/阴性标准血清OD450nm比值≥2.1血清样品为IgM阳性，判定为PCV2感染；血清样品OD450nm值/阴性标准血清OD450nm比值＜2.1血清样品为阴性，判定为健康。

[0079] 4.本发明方法的特异性分析

[0080] 利用商品化的CSFV和PRRSV弱毒活疫苗免疫无PCV2感染仔猪，免疫后7天采血，分离血清，用ELISA方法确定CSFV和PRRSV特异性IgM抗体为阳性(CSFVIgM，PRRSVIgM)。同时用商品化的PCV2特异性IgG抗体检测试剂盒，筛选2份PCV2 IgG阳性血清样品(IgG阳性1和IgG阳性2)。用本发明方法对这些样品进行检测。结果均为阴性，表明本发明方法具有较好的特异性，具体分析结果见表5。

[0081] 表5特异性分析

[0082]

[0083] 注：+表示检测结果为IgM阳性，-表示检测IgM结果为阴性。

[0084] 5.田间猪血清样品检测实例

[0085] 用本发明所涉及ELISA检测试剂抽检猪PCV2疫苗未免疫猪场的30日龄仔猪血清样品40份，检测PCV2特异性IgM抗体。依据本试剂盒检测结果发现，PCV2特异性IgM为阳性样品有5份(1705,1706，1707,1712,1725)，占样品总数的12.5％，其余样品均为阴性。用商品化试剂盒检测并比较发现，商品化试剂盒检测出PCV2特异性IgM阳性样品为4份(1705,1707,1712,1725)占样品总数的10％，其余全为阴性，样品检测结果见表6。本发明试剂盒检测5份阳性样品中有1份样品用商品化试剂盒检测为阴性，因此本发明涉及的PCV2 IgM检测ELISA方法具有更高的敏感性，并且与商品化试剂盒的符合率为(38/40)95％，表明该方法适用于临床样品的检测。

[0086] 表6田间样品检测

[0087]

[0088] 注：+表示检测结果为IgM阳性，-表示检测IgM结果为阴性。

[0089] 我国从2000年开始确定存在猪圆环病毒感染以来，全国各地不断有PCV2发病报道，其感染率居高不下，并且不同阶段猪均可感染，PCV2感染已然成为威胁我国养猪业的背景性疾病。随着对该病的重视，多种疫苗已经投入使用，对PCV2感染得到了一定控制，然而，临床仍常见到野毒株感染。本研究对田间样品IgM检测也证实，30日龄仔猪就开始出现了PCV2感染。本发明涉及的PCV2 IgM检测ELISA方法将为PCV2感染调查和疫苗免疫预防提供指导。

[0090]

[0091]

[0092]