本申请涉及脑缺血型近交系长爪沙鼠的遗传生化位点标记及其应用。脑缺血型近交系长爪沙鼠(Meriones)的遗传生化位点标记，所述遗传生化位点标记选自葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶‑1、酯酶‑3、碳酸酐酶‑2、碱性磷酸酶‑1、异柠檬酸脱氢酶‑1、苹果酸酶‑1、磷酸葡萄糖转位酶‑1、肾过氧化氢酶‑2、肽酶‑3、葡萄糖磷酸异构酶‑1、血红蛋白‑β链、转铁蛋白、酯酶‑1、酯酶‑10、甘油磷酸脱氢酶‑1、β‑葡萄糖苷酸酶‑1、酯酶‑2、乳酸脱氢酶调节体‑1、血清蛋白‑1、淀粉酶‑1、酯酶‑6、酯酶‑8、酯酶‑9、酯酶‑4、过氧化氢酶‑1、酯酶‑12中的至少一种。
脑缺血近交系长爪沙鼠的遗传生化位点标记及其应用
技术领域
[0001] 本申请涉及脑缺血型近交系长爪沙鼠的遗传生化位点标记，特别涉及其在判断脑缺血型近交系长爪沙鼠中的应用以及脑缺血型近交系长爪沙鼠的检测方法。
背景技术
[0002] 近交系动物的遗传具有基因纯和性、遗传稳定性、表现型的均一性、个体独特性和分布的广泛性等特性。动物实验结果可靠、有规律和重复性好等，广泛应用于生物医学研究领域。
[0003] 目前，实验动物遗传质量检测的方法主要有毛色基因测试法、生化标记检测法、免疫标记基因检测法、下颚骨形态测量分析法和分子标记检测法等。
[0004] 1.毛色基因测试法:该方法是传统的、直观的形态学检测法，可直接利用动物的毛色外部形态特征，即利用表现型来判断其基因型的遗传学分析方法。毛色基因测试法检测的位点少，只能测出大体状况，且需要较长时间的饲养和观察。
[0005] 2.生化标记检测法：该方法是通过电泳结果判断基因位点和等位基因的一种检测方法，生化标记检测所测得基因是支配动物体内酶和蛋白的基因，所识别性状大部分具有共显性，可根据基因的表现判别所测动物基因的杂合性和纯合性，是目前近交系动物纯合度常规有效的检测方法。
[0006] 3.免疫标记基因检测法：皮肤移植是检查组织相容性基因差异的方法。
[0007] 4.下颚骨形态测量分析法：制作测量用的标准直角坐标底板，随机选取动物制备下颌骨标本后，在显微镜下，放大10倍测量在直角坐标底板上下颌骨形态特征参考点的距离。将所测量值的平均数作统计分析，利用判别函数确定下颌骨形态。下颌骨形态分析是一种灵敏、经济、简便、可同时检验大量的遗传位点的遗传监测方法。如果测量值集中，则表明在被测动物间无显著的遗传差异。
[0008] 5.分子标记检测法：生物个体间的差异在本质上是DNA分子差异，随着分子标记研究的不断深入，实验动物遗传多样性的研究也由传统的检测法过渡到分子标记基因检测法。
[0009] 其中，生化标记是反映生物变异和生物多样性的生化特征的遗传标记。应用生化标记能够了解物种间的亲缘关系，对于种质资源鉴定提供了理论依据。生化标记主要包括同工酶和等位酶，蛋白质作为基因表达的产物，与形态、细胞学特征相比，数量上更丰富，受环境影响更小，能更好地反映遗传多态性，是一种较好的遗传标记。新品近交系动物审定前，需要确定该品种的特性、一致性和稳定性，生化位点标记是新品系遗传组成之一。利用生化标记技术能很好地解决，该方法具有敏感度高、准确、基因位点明确、方法简便快捷、比较经济等优点。
[0010] 长爪沙鼠(Mongolian gerbil，Meriones unguiculatus)具有独特的解剖学特征，群体中约有30％～40％的个体存在脑底动脉Willis环变异缺失的特性，是建立脑缺血模型的理想动物。根据长爪沙鼠Willis环前交通支变异或缺失为目的基因进行兄妹交配F20代的近交培育，应用F21～23代120余只动物解剖观察脑缺血沙鼠近交系存在Willis环变异缺失的特性达76％以上。
[0011] 然而，目前还没有确定沙鼠的遗传生化位点标记，也没有建立起近交系沙鼠的遗传生化位点标记检测方法。
[0012] 基于目前的各种检测方法，需要一种操作相对简易、结果可靠且成本低廉的检测实验脑缺血近交系沙鼠的遗传方法。并且为新的近交品系建立，确定生化标记的遗传组成，建立该品系生化位点标记的背景是十分必要的。
发明内容
[0013] 为了填补现有技术的空白，本申请之一提供了长爪沙鼠(Meriones Unguiculatus)的遗传生化位点标记，所述遗传生化位点标记选自葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-
1、酯酶-3、碳酸酐酶-2、碱性磷酸酶-1、异柠檬酸脱氢酶-1、苹果酸酶-1、磷酸葡萄糖转位酶-1、肾过氧化氢酶-2、肽酶-3、葡萄糖磷酸异构酶-1、血红蛋白-β链、转铁蛋白、酯酶-1、酯酶-10、甘油磷酸脱氢酶-1、β-葡萄糖苷酸酶-1、酯酶-2、乳酸脱氢酶调节体-1、血清蛋白-1、淀粉酶-1、酯酶-6、酯酶-8、酯酶-9、酯酶-4、过氧化氢酶-1、酯酶-12中的至少一种。
[0014] 在一个具体实施方式中，所述长爪沙鼠为脑缺血型近交系长爪沙鼠。
[0015] 本申请之二提供了如本申请之一所述的遗传生化位点标记在判定脑缺血型近交系长爪沙鼠中的应用。
[0016] 在一个具体实施方式中，所述遗传生化位点标记选自葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-1、酯酶-3、碳酸酐酶-2、碱性磷酸酶-1、异柠檬酸脱氢酶-1、苹果酸酶-1、磷酸葡萄糖转位酶-1、肾过氧化氢酶-2、肽酶-3、葡萄糖磷酸异构酶-1、血红蛋白-β链、转铁蛋白、酯酶-1、酯酶-10、甘油磷酸脱氢酶-1、β-葡萄糖苷酸酶-1、酯酶-2、乳酸脱氢酶调节体-1、血清蛋白-1、淀粉酶-1、酯酶-6、酯酶-8、酯酶-9、酯酶-4、过氧化氢酶-1、酯酶-12中的至少20种。
[0017] 本申请之三提供了一种脑缺血型近交系长爪沙鼠的检测方法，使用如本申请之一所述的遗传生化位点标记来检测待测长爪沙鼠是否为脑缺血型近交系长爪沙鼠，其中，所述遗传生化位点标记选自葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-1、酯酶-3、碳酸酐酶-2、碱性磷酸酶-1、异柠檬酸脱氢酶-1、苹果酸酶-1、磷酸葡萄糖转位酶-1、肾过氧化氢酶-2、肽酶-3、葡萄糖磷酸异构酶-1、血红蛋白-β链、转铁蛋白、酯酶-1、酯酶-10、甘油磷酸脱氢酶-1、β-葡萄糖苷酸酶-1、酯酶-2、乳酸脱氢酶调节体-1、血清蛋白-1、淀粉酶-1、酯酶-6、酯酶-8、酯酶-9、酯酶-4、过氧化氢酶-1、酯酶-12中的至少20种。
[0018] 在一个具体实施方式中，所述方法包括如下步骤：
[0019] 1)根据选用的所述遗传生化位点标记确定从成年的所述待测长爪沙鼠中采集样品的种类；所述种类包括血液和脏器官，其中，所述脏器官包括肾脏、肝脏、心脏、肺脏、睾丸和胰腺；
[0020] 2)将血液离心，分离血浆、血清和血球，从而得到血浆和血清；将血球与水(例如蒸馏水)以体积比为1：(0.5-0.8)的比例混合，充分振荡得到溶血素；
[0021] 3)将1％的肝素与血液按1:(5-10)的体积比混合得到抗凝血；
[0022] 4)将所述脏器官与水(例如蒸馏水)分别以w/v为1：(0.8-1.2)的比例混合，然后匀浆并离心，制备得到所述脏器官的上清液；
[0023] 5)使用肝脏和/或肾脏的上清液来检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-1，优选使用肾脏的上清液来检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-1；
[0024] 使用肾脏的上清液来检测酯酶-3；
[0025] 使用溶血素来检测碳酸酐酶-2；
[0026] 使用肾脏的上清液来检测碱性磷酸酶-1；
[0027] 使用肾脏的上清液来检测异柠檬酸脱氢酶-1；
[0028] 使用肾脏的上清液来检测苹果酸酶-1；
[0029] 使用肾脏的上清液来检测磷酸葡萄糖转位酶-1；
[0030] 使用肾脏的上清液来检测肾过氧化氢酶-2；
[0031] 使用肾脏的上清液来检测肽酶-3；
[0032] 使用溶血素来检测葡萄糖磷酸异构酶-1；
[0033] 使用溶血素来检测血红蛋白-β链；
[0034] 使用血浆来检测转铁蛋白；
[0035] 使用血浆来检测酯酶-1；
[0036] 使用肺脏样品来检测酯酶-10；
[0037] 使用肝脏和/或肾脏的上清液来检测甘油磷酸脱氢酶-1；
[0038] 使用肝脏和/或肾脏的上清液来检测β-葡萄糖苷酸酶-1；
[0039] 使用肾脏的上清液来检测酯酶-2；
[0040] 使用溶血素来检测乳酸脱氢酶调节体-1；
[0041] 使用血清来检测血清蛋白-1；
[0042] 使用肾脏和/或胰腺的上清液来检测淀粉酶-1；
[0043] 使用睾丸的上清液来检测酯酶-6；
[0044] 使用睾丸的上清液来检测酯酶-8；
[0045] 使用睾丸的上清液来检测酯酶-9；
[0046] 使用肾脏的上清液来检测酯酶-4；
[0047] 使用溶血素来检测过氧化氢酶-1；
[0048] 使用心脏的上清液来检测酯酶-12；
[0049] 6)电泳：电泳介质均为醋酸纤维素板和/或醋酸纤维素膜，电泳条件如下：
[0050]
[0051]
[0052] 7)染色和/或显色：
[0053] 对于葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-1(Gpd1)：
[0054] 在电泳结束前8-15分钟，按照2ml 0.2M pH8的Tris-HCl，150μl 0.25M醋酸镁Mg(C2H3O2)2，900μl 0.5M葡萄糖-6-磷酸，450μl 1wt％溴化甲基噻唑蓝(MTT)，450μl 0.25wt％甲硫吩嗪酸酯(PMS)，和450μl 1wt％辅酶II(TPN)的比例混合，得到第一染色液，电泳结束后，向所述第一染色液中加入0.9-1.5倍其体积的的溶化的2wt％琼脂，充分混合均匀后，均匀覆盖在电泳介质上，在20-40℃的温度下显色40分钟以上，直至呈现清晰的带型，然后去除混合有琼脂的第一染色液，放入体积含量为7％的冰醋酸固定液(冰醋酸7ml，蒸馏水93ml)中固定10分钟以上；
[0055] 对于酯酶-3(Es3)：
[0056] 在电泳结束前10-20分钟，按照0.25ml 2wt％β-醋酸萘酯，5ml 0.6wt％坚固蓝RR盐的比例混合，然后过滤，得到第二染色液，电泳结束后，向所述第二染色液中加入0.9-1.5倍其体积的溶化的2wt％琼脂，充分混合后，均匀覆盖在电泳介质上，直至呈现清晰的带型，然后去除混合有琼脂的第二染色液，放入体积含量为7％的冰醋酸固定液中固定10分钟以上；
[0057] 对于碳酸酐酶-2(Car2)：
[0058] 按照0.4g丽春红，6g三氯乙酸，6g磺基水杨酸，200ml水(例如蒸馏水)的比例混合，得到第三染色液，电泳结束后将电泳介质平放浸没在第三染色液中，染色10-30分钟，然后将所述电泳介质放入含有450ml无水乙醇、50ml冰醋酸和500ml水(例如蒸馏水)的漂洗液中脱色至少一次，直至将所述电泳介质的背景脱成白色，能够清晰分辨带型；
[0059] 对于碱性磷酸酶-1(Akp1)：
[0060] 在电泳结束前10-20分钟，按照4ml 0.2mol/L pH 8Tris-HCl，40mgβ-磷酸萘酯，40mg坚固蓝RR盐，0.4ml 0.2mol/L MnCl2的比例混合，然后过滤，得到第四染色液，电泳结束后，向所述第四染色液中加入0.9-1.5倍其体积的溶化的2wt％琼脂，充分混合后，均匀覆盖在电泳介质上，在20-40℃的温度下显色30分钟以上，直至呈现清晰的带型；，然后去除混合有琼脂的第四染色液，放入体积含量为7％的冰醋酸固定液中固定10分钟以上；
[0061] 对于异柠檬酸脱氢酶-1(Idh1)：
[0062] 在电泳结束前8-15分钟，按照2ml 0.2M pH 8Tris-HCl，225μl 1wt％溴化甲基噻唑蓝(MTT)，225μl 1wt％辅酶II(TPN)，80μl 0.1M氯化锰MnCl2，900μl 0.5M pH 8苹果酸，225μl 10wt％异柠檬酸，和225μl 0.25wt％甲硫吩嗪酸酯(PMS)的比例混合，得到第五染色液，电泳结束后，向所述第五染色液中加入0.9-1.5倍其体积的溶化的2wt％琼脂，充分混合后，均匀覆盖在电泳介质上，直至呈现清晰的带型，然后去除混合有琼脂的第五染色液，放入体积含量为7％的冰醋酸固定液中固定10分钟以上；
[0063] 对于苹果酸酶-1(Mod1)：
[0064] 使用的染色液和染色操作步骤同异柠檬酸脱氢酶-1；
[0065] 对于磷酸葡萄糖转位酶-1(Pgm1)：
[0066] 在电泳结束前8-15分钟，按照2ml 0.2M pH 8 Tris-HCl，200μl 0.25M醋酸镁Mg(C2H3O2)2，40μl 1wt％葡萄糖-1,6-二磷酸，400μl 1wt％葡萄糖-1-磷酸，200μl 1wt％溴化甲基噻唑蓝(MTT)，200μl 1wt％辅酶II(PMS)，10IU葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，200μl 0.25wt％甲硫吩嗪酸酯的比例混合，得到第六染色液，电泳结束后，向所述第六染色液中加入0.9-1.5倍其体积的溶化的2wt％琼脂，充分混合后，均匀覆盖在电泳介质上，在20-40℃的温度下显色30分钟以上，直至呈现清晰的带型，然后去除混合有琼脂的第六染色液，放入体积含量为7％的冰醋酸固定液中固定10分钟以上；
[0067] 对于肾过氧化氢酶-2(Ce2)：
[0068] 在电泳结束前8-15分钟，按照2ml 1wt％三氯化铁，2ml 1wt％铁氢化钾的比例混合，得到第七染色液，电泳结束后，将电泳介质浸入3‰的双氧水中30s，再用水(例如蒸馏水)漂洗2遍，向所述第七染色液中加入0.9-1.5倍其体积的溶化的2wt％琼脂，充分混合后，均匀覆盖在电泳介质上，直至呈现清晰的带型，然后去除混合有琼脂的第七染色液，放入体积含量为7％的冰醋酸固定液中固定10分钟以上；
[0069] 对于肽酶-3(Pep3)：
[0070] 在电泳结束前8-15分钟，按照0.51ml 0.2mol/L磷酸二氢钠，0.49ml 0.2mol/L磷酸氢二钠，1ml水(例如蒸馏水)，0.04ml 1wt％L-白氨酰替-L-丙氨酸，0.04ml 1wt％过氧化物酶，0.08ml 1wt％邻二甲氧基联苯胺盐酸盐，0.04ml 0.25wt％蛇毒的比例混合，得到第八染色液，电泳结束后，向所述第八染色液中加入0.9-1.5倍其体积的溶化的2wt％琼脂，充分混合后，均匀覆盖在电泳介质上，在20-40℃的温度下显色30分钟以上，直至呈现清晰的带型，然后去除混合有琼脂的第八染色液，放入体积含量为7％的冰醋酸固定液中固定10分钟以上；
[0071] 对于葡萄糖磷酸异构酶-1(Gpi1)：
[0072] 在电泳结束前8-15分钟，按照2ml 0.2M pH8Tris-HCl，150μl 0.25M醋酸镁，200μl 10wt％果糖-6-磷酸，200μl 1wt％溴化甲基噻唑蓝(MTT)，200μl 1wt％辅酶II(TPN)，10IU葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，200μl 0.25wt％甲硫吩嗪酸酯(PMS)的比例混合，得到第九染色液，电泳结束后，向所述第九染色液中加入0.9-1.5倍其体积的溶化的2wt％琼脂，充分混合后，均匀覆盖在电泳介质上，直至呈现清晰的带型，然后去除混合有琼脂的第九染色液，放入体积含量为7％的冰醋酸固定液中固定10分钟以上；
[0073] 对于血红蛋白-β链(Hbb)：
[0074] 电泳结束后，将电泳介质平放浸没在所述第三染色液中，染色15-30分钟，然后放入含有450ml无水乙醇、50ml冰醋酸和500ml水的漂洗液中脱色至少一次，直至将所述电泳介质的背景脱成白色，能够清晰分辨带型；
[0075] 对于转铁蛋白(Trf)：
[0076] 电泳结束后，将电泳介质平放浸没在所述第三染色液中，染色15-30分钟，然后将所述电泳介质放入含有450ml无水乙醇、50ml冰醋酸和500ml水的漂洗液中脱色至少一次，直至将所述电泳介质的背景脱成白色，能够清晰分辨带型；
[0077] 对于酯酶-1(Es-1)：
[0078] 电泳结束后，向所述第二染色液中加入0.9-1.5倍其体积的溶化的2wt％琼脂，充分混合后，均匀覆盖在电泳介质上，直至呈现清晰的带型，然后去除混合有琼脂的第二染色液，放入体积含量为7％的冰醋酸固定液中固定10分钟以上；
[0079] 对于酯酶-10(Es-10)：
[0080] 电泳结束后，向所述第二染色液中加入0.9-1.5倍其体积的溶化的2wt％琼脂，充分混合后，均匀覆盖在电泳介质上，直至呈现清晰的带型，然后去除混合有琼脂的第二染色液，放入体积含量为7％的冰醋酸固定液中固定10分钟以上；
[0081] 对于甘油磷酸脱氢酶-1(Gdc-1)：
[0082] 在电泳结束前8-15分钟，按照1.2ml 2wt％磷酸甘油，0.6ml 1wt％辅酶II(TPN)，0.3ml 0.25wt％甲硫吩嗪酸酯(PMS)，0.3ml 1wt％溴化甲基噻唑蓝(MTT)的比例混合，得到第十染色液，电泳结束后，向所述第十染色液中加入0.9-1.5倍其体积的溶化的2wt％琼脂，充分混合后，均匀覆盖在电泳介质上，直至呈现清晰的带型，然后去除混合有琼脂的第十染色液，放入体积含量为7％的冰醋酸固定液中固定10分钟以上；
[0083] 对于β-葡萄糖苷酸酶-1(Gus-1)：
[0084] 在电泳结束前8-15分钟，按照4mg萘酚AS-BLβ-D-葡萄糖苷，9mg固红，5ml 0.2M pH4.6无水乙酸钠的比例混合，得到第十一染色液，电泳结束后，向所述第十一染色液中加入0.9-1.5倍其体积的溶化的2wt％琼脂，充分混合后，均匀覆盖在电泳介质上，在20℃-40℃的温度下显色30分钟以上，直至呈现清晰的带型，然后去除混合有琼脂的第十一染色液，放入体积含量为7％的冰醋酸固定液中固定10分钟以上；
[0085] 对于酯酶-2(Es-2)：
[0086] 电泳结束后，向所述第二染色液中加入0.9-1.5倍其体积的溶化的2wt％琼脂，充分混合后，均匀覆盖在电泳介质上，直至呈现清晰的带型，然后去除混合有琼脂的第二染色液，放入体积含量为7％的冰醋酸固定液中固定10分钟以上；
[0087] 对于乳酸脱氢酶调节体-1(Ldr-1)：
[0088] 在电泳结束前8-15分钟，按照5mlTris-盐酸pH 8，2mg氮蓝四唑(NBT)，1mg甲硫吩嗪酸酯(PMS)，3mg辅酶I，500μl 1mol-乳酸钠，1mg溴化甲基噻唑蓝(MTT)的比例混合，得到第十二染色液，上述试剂在电泳结束前10分钟混合，电泳结束后，向所述第十二染色液中加入0.9-1.5倍其体积的溶化的2wt％琼脂l，充分混合后，均匀覆盖在电泳介质上，直至呈现清晰的带型，然后去除混合有琼脂的第十二染色液，放入体积含量为7％的冰醋酸固定液中固定10分钟以上；
[0089] 对于血清蛋白-1(Sep-1)：
[0090] 电泳结束后，将电泳介质平放浸没在第三染色液中，染色15-30分钟，然后将所述电泳介质放入含有450ml无水乙醇、50ml冰醋酸和500ml水的漂洗液中脱色至少一次，直至将所述电泳介质的背景脱成白色，能够清晰分辨带型；
[0091] 对于淀粉酶-1(Amy-1)：
[0092] 电泳结束后，将电泳介质平放浸没在第三染色液中，染色20-30分钟，然后将所述电泳介质放入含有450ml无水乙醇、50ml冰醋酸和500ml水的漂洗液中脱色至少一次，直至将所述电泳介质的背景脱成白色，能够清晰分辨带型；
[0093] 对于酯酶-6(Es6)：
[0094] 电泳结束后，向所述第二染色液中加入0.9-1.5倍其体积的溶化的2wt％琼脂，充分混合后，均匀覆盖在电泳介质上，直至呈现清晰的带型，然后去除混合有琼脂的第二染色液，放入体积含量为7％的冰醋酸固定液中固定10分钟以上；
[0095] 对于酯酶-8(Es8)：
[0096] 电泳结束后，向所述第二染色液中加入0.9-1.5倍其体积的溶化的2wt％琼脂，充分混合后，均匀覆盖在电泳介质上，直至呈现清晰的带型，然后去除混合有琼脂的第二染色液，放入体积含量为7％的冰醋酸固定液中固定10分钟以上；
[0097] 对于酯酶-9(Es9)：
[0098] 电泳结束后，向所述第二染色液中加入0.9-1.5倍其体积的溶化的2wt％琼脂，充分混合后，均匀覆盖在电泳介质上，直至呈现清晰的带型，然后去除混合有琼脂的第二染色液，放入体积含量为7％的冰醋酸固定液中固定10分钟以上；
[0099] 对于酯酶-4(Es4)：
[0100] 在电泳结束后，向所述第二染色液中加入0.9-1.5倍其体积的溶化的2wt％琼脂，充分混合后，均匀覆盖在电泳介质上，直至呈现清晰的带型，然后去除混合有琼脂的第二染色液，放入体积含量为7％的冰醋酸固定液中固定10分钟以上；
[0101] 对于过氧化氢酶-1(Cs1)：
[0102] 电泳结束后，将电泳介质浸没在3v‰的双氧水中30s，再用水(例如蒸馏水)漂洗1至3遍，向所述第七染色液中加入0.9-1.5倍其体积的溶化的2wt％琼脂，充分混合后，均匀覆盖在电泳介质上，直至呈现清晰的带型，然后去除混合有琼脂的第七染色液，放入体积含量为7％的冰醋酸固定液中固定10分钟以上；
[0103] 对于酯酶-12(Es12)：
[0104] 电泳结束后，向所述第二染色液中加入0.9-1.5倍其体积的溶化的2wt％琼脂，充分混合后，均匀覆盖在电泳介质上，直至呈现清晰的带型，然后去除混合有琼脂的第二染色液，放入体积含量为7％的冰醋酸固定液中固定10分钟以上。
[0105] 在一个具体实施方式中，电泳介质的规格可以为7×9cm规格，试剂量是1张电泳介质的，如果增加电泳介质的数量，则按比例增加试剂量。
[0106] 在一个具体实施方式中，所述脑缺血型近交系长爪沙鼠为脑缺血CMU/1近交系长爪沙鼠和/或脑缺血CMU/2近交系长爪沙鼠。
[0107] 在一个具体实施方式中，脑缺血CMU/1近交系长爪沙鼠和脑缺血CMU/2近交系长爪沙鼠的遗传生化位点标记如下表：
[0108]
[0109]
[0110] 在本申请中，坚固蓝RR盐新鲜配置：配置后1个月内使用。
[0111] 在本申请中，第三染色液可以提前配制，例如提取2～6个月配制，或者例如，实验准备时间配置，可以整体配置1000～2000ml备用。染色时将配置好的第三染色液倒入托盘中，液体高度要能完全覆盖电泳介质。
[0112] 本申请的有益效果：
[0113] 1)首次确定了CMU/1和CMU/2近交系长爪沙鼠的遗传生化位点标记，为沙鼠的近交系遗传生化位点的检测提供了平台。
[0114] 2)操作简单：通过电泳结果来识别生化位点标记和等位基因的一种方法。
[0115] 3)有效方法：生化标记是支配动物体内酶和蛋白的基因，所识别性状具有共显性，根据基因的表现型判断所测动物基因的杂合性、纯合型、隐形基因。
[0116] 4)检测速度快：相对于传统方式，目前是近交系大小鼠国家标准指定方法，该方法能够较快速直观的反应动物纯合性，简便、经济、快速和准确。
[0117] 5)实验结果简单、客观：该方法结果的判读是根据醋酸纤维素板(或膜)电泳图中条带目的条带的有无，使检测结果的判读更加简单、客观，不受人工和自然选择的淘汰，几乎所有的生物体内，蛋白质的分子结构是由遗传因素决定而免受环境修饰的。
附图说明
[0118] 图1是对近交F21～23代动物随机抽取10只CMU/1和6只CMU/2近交系长爪沙鼠的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-1检测电泳图谱，其中，左图：泳道1～5为CMU/1，标准为小鼠标准5和6，6～8为CMU/2；右图：泳道1～6为CMU/1(右图泳道1中的样品同左图泳道1中的样品)，7～9为CMU/2。
[0119] 图2是对近交F21～23代动物随机抽取11只CMU/1和5只CMU/2近交系长爪沙鼠的酯酶-3检测电泳图谱，其中，左图：泳道1～4为CMU/1，标准为小鼠标准5和6，4～8为CMU/2；右图：泳道1～7，9为CMU/1(右图泳道1中的样品同左图泳道1中的样品)，8为CMU/2。
[0120] 图3是对近交F21～23代动物随机抽取6只CMU/1和4只CMU/2近交系长爪沙鼠的碳酸酐酶-2检测电泳图谱，其中，左图：泳道1～3为CMU/1，标准为小鼠标准3和4，4～6为CMU/2；右图：泳道1～4为CMU/1(右图泳道1中的样品同左图泳道1中的样品)，5～8为CMU/2(右图泳道5中的样品同左图泳道4中的样品)。
[0121] 图4是对近交F21～23代动物随机抽取9只CMU/1和6只CMU/2近交系长爪沙鼠的磷酸葡萄糖转位酶-1检测电泳图谱，其中，左图：泳道1～5为CMU/1，标准为小鼠标准5和6，6～8为CMU/2；右图：泳道1～5为CMU/1(右图泳道1中的样品同左图泳道1中的样品)，6～8为CMU/2。
[0122] 图5是对近交F21～23代动物随机抽取7只CMU/1和6只CMU/2近交系长爪沙鼠的酯酶-10检测电泳图谱，其中，左图：泳道1～3为CMU/1，标准为大鼠标准13和14，4～5为CMU/2；右图：泳道1～5为CMU/1(右图泳道1中的样品同左图泳道1中的样品)，6～8为CMU/2。
[0123] 图6是对近交F21～23代动物随机抽取9只CMU/1和5只CMU/2近交系长爪沙鼠的乳酸脱氢酶调节体-1检测电泳图谱，其中，左图：泳道1～4为CMU/1，标准为小鼠标准3和4，5～7为CMU/2；右图：泳道1～6为CMU/1(右图泳道1中的样品同左图泳道1中的样品)，7～8为CMU/2。
[0124] 图7是对近交F21～23代动物随机抽取11只CMU/1和5只CMU/2近交系长爪沙鼠的酯酶-4检测电泳图谱，其中，左图：泳道1～2为CMU/1，3为CMU/2，标准为大鼠标准8和9，4～7为CMU/1；右图：泳道1～2为CMU/2，3～5为CMU/1，6～7为CMU/2，8～9为CMU/1。
具体实施方式
[0125] 下面结合具体实施例对本申请进行详细说明，但以下实施例并不构成对本申请的限制。
[0126] 标准品：应用大、小鼠近交系遗传生化位点标记检测的标准品，大小鼠的标准品购于中国食品药品检定研究院。
[0127] 实验动物：CMU/1近交系长爪沙鼠77只，CMU/2近交系长爪沙鼠44只，F21～23代，3～4月龄。由首都医科大学实验动物中心提供[SYXK(京)-2013-0005]，实验动物自由采食和饮水，室温为20～24℃。本实验通过首都医科大学实验动物和动物实验伦理委员会批准(No.AEEI-2017-032)
[0128] 试剂和仪器：低温高速冷冻离心机(CF16RX)、DYY-III-6B稳压稳流电泳仪、DYY-III-38B电泳槽、DYY-I玻璃组织匀浆机、脱色摇床(GFL3018)、超级加样器(WD-9404)，醋酸纤维板购于北京六一仪器厂，染色试剂均来自于美国Sigma公司，常规生化试剂为分析纯。
[0129] 样品制备：眼眶静脉取血，应用1％的肝素(1％肝素，与血液按1:5-10)获取抗凝血和静脉血液(不少于150μL)。将静脉血液静止30min，5000r/min离心10min制备血清和血浆，去除血浆余下的血细胞加入蒸馏水(1:0.5)，震荡制备溶血素。动物颈椎脱臼处死，剖腹取心脏、肺脏、肾脏、胰腺、睾丸，放入5mL EP管中，分别按w/v为1:(0.8-1.2)的比例添加蒸馏水，并分别用组织匀浆机研磨，置于0℃低温高速离心机10 000r/min离心60min，分别吸取上清液保存-20℃冰箱保存备用。
[0130] 结果表示：遗传生化位点标记应用英文小写字母a-e。
[0131] 第一染色液：配置染色液试剂：0.2M Tris-HCl(pH＝8.0)2ml，0.25M Mg(C2H3O2)2150μl，0.5M葡萄糖-6-磷酸900μl，1wt％溴化甲基噻唑蓝(MTT)450μl，0.25wt％甲硫吩嗪酸酯(PMS)450μl，1wt％辅酶II(TPN)450μl，上述试剂混合备用。在电泳结束前8-15分钟配制。用于葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-1(Gpd1)的染色。
[0132] 第二染色液：0.25ml 2wt％β-醋酸萘酯，5ml 0.6wt％坚固蓝RR盐(新鲜配置：配置后1个月内使用)的比例混合，然后过滤备用。在电泳结束前10-20分钟配制。用于酯酶-3、酯酶-1、酯酶-10、酯酶-2、酯酶-6、酯酶-8、酯酶-9、酯酶-4和酯酶-12的染色。
[0133] 第三染色液：丽春红0.40g，三氯乙酸6.00g，磺基水杨酸6.00g，蒸馏水200ml。用于碳酸酐酶-2、血红蛋白-β链、转铁蛋白、血清蛋白-1和淀粉酶-1的染色。
[0134] 第四染色液：按照4ml 0.2mol/L pH 8Tris-HCl，40mgβ-磷酸萘酯，40mg坚固蓝RR盐，0.4ml 0.2mol/L MnCl2的比例混合，然后过滤备用。在电泳结束前10-20分钟配制。用于碱性磷酸酶-1的染色。
[0135] 第五染色液：按照2ml 0.2M pH 8Tris-HCl，225μl 1wt％溴化甲基噻唑蓝(MTT)，225μl 1wt％辅酶II(TPN)，80μl 0.1M MnCl2，900μl 0.5M pH 8苹果酸，225μl 10wt％异柠檬酸，和225μl 0.25wt％甲硫吩嗪酸酯(PMS)的比例混合。在电泳结束前8-15分钟配制。用于异柠檬酸脱氢酶-1、苹果酸酶-1的染色。
[0136] 第六染色液：按照2ml 0.2M pH 8Tris-HCl，200μl 0.25M醋酸镁，40μl 1wt％葡萄糖-1,6-二磷酸，400μl 1wt％葡萄糖-1-磷酸，200μl 1wt％溴化甲基噻唑蓝(MTT)，200μl 1wt％辅酶II(PMS)，10IU葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，200μl 0.25wt％甲硫吩嗪酸酯的比例混合。在电泳结束前8-15分钟配制。用于磷酸葡萄糖转位酶-1的染色。
[0137] 第七染色液：1wt％三氯化铁2ml，1wt％铁氰化钾2ml，混合备用。在电泳结束前8-15分钟配制。用于肾过氧化氢酶-2、过氧化氢酶-1的染色。
[0138] 第八染色液：按照0.51ml 0.2mol/L磷酸二氢钠，0.49ml 0.2mol/L磷酸氢二钠，1ml蒸馏水，0.04ml 1wt％L-白氨酰替-L-丙氨酸，0.04ml 1wt％过氧化物酶，0.08ml 1wt％邻二甲氧基联苯胺盐酸盐，0.04ml 0.25wt％蛇毒的比例混合。在电泳结束前8-15分钟配制。用于肽酶-3的染色。
[0139] 第九染色液：按照2ml 0.2M pH8Tris-HCl，150μl 0.25M醋酸镁，200μl 10wt％果糖-6-磷酸，200μl 1wt％溴化甲基噻唑蓝(MTT)，200μl 1wt％辅酶II(TPN)，10IU葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，200μl 0.25wt％甲硫吩嗪酸酯(PMS)的比例混合。在电泳结束前8-15分钟配制。用于葡萄糖磷酸异构酶-1的染色。
[0140] 第十染色液：按照1.2ml 2wt％磷酸甘油，0.6ml 1wt％辅酶II(TPN)，0.3ml 0.25wt％甲硫吩嗪酸酯(PMS)，0.3ml 1wt％溴化甲基噻唑蓝(MTT)的比例混合。在电泳结束前8-15分钟配制。用于甘油磷酸脱氢酶-1的染色。
[0141] 第十一染色液：按照4mg萘酚AS-BLβ-D-葡萄糖苷，9mg固红，5ml 0.2M pH4.6无水乙酸钠的比例混合。在电泳结束前8-15分钟配制。用于β-葡萄糖苷酸酶-1的染色。
[0142] 第十二染色液：按照5mlTris-盐酸pH 8，2mg氮蓝四唑(NBT)，1mg甲硫吩嗪酸酯(PMS)，3mg辅酶I，500μl 1mol-乳酸钠，1mg溴化甲基噻唑蓝(MTT)的比例混合。在电泳结束前8-15分钟配制。用于乳酸脱氢酶调节体-1的染色。
[0143] 实施例1葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-1(Glucose-6-phosphate dehydrogenasc-1,Gpd1)的检测
[0144] 分别对来自肾脏和肝脏的上清液样品进行检测。
[0145] 浸板：将醋酸纤维素板在Tris-甘氨酸pH 8.9的缓冲液中浸透，避免板上出现气泡。
[0146] 加样：用微量加样器将样品添加到加样板上，每孔不超过10μl。
[0147] 点样：取出浸透后的板，在两层滤纸中吸干余液，立即放在超级加样器的点样板上，用超级加样器在加样板上取样，添加浸透的醋酸纤维素板上。加样板和点样板是超级加样器的组合。
[0148] 电泳：将点样的醋酸纤维素板平贴在电泳槽支架的滤纸桥上(点样面向下)，点样端位于阴极，注意薄膜紧贴在绷直的滤纸上，盖上电泳槽盖，电压调到200V，接通电泳仪，50min完成。
[0149] 染色：电泳进行50分钟，应用琼脂覆盖法进行染色。电泳结束后，将加入0.9-1.5倍其体积的2wt％溶化的琼脂与混合试剂充分混合，立即覆盖到纤维板上，约30～40min能够看到显色带，然后将染色液去掉，放入7v％的冰醋酸固定液中固定10分钟以上。
[0150] 结果判定：待测动物的Gpd-1与标准品对比，CMU/1和CMU/2比标准的快带b快，确定为c带，并且检测所有待检动物的结果均为c带。结果见图1。
[0151] 另外，从清晰度方面来讲，脏器器官的匀浆浓度与小鼠近交系的要求高，来自肝脏的上清液样品不如来自肾脏的上清液样品，从整体位点检测来看集中脏器匀浆也首选肾脏。从电泳结果方面来讲，长爪沙鼠的带型与终点带比较近，短时间分不开，需要进行电泳约50分钟。
[0152] 在检测过程中，尝试使用国标GB/T 14927.1-2008小鼠的染色配方显色，几乎无法显示结果，个别结果显示的带型很浅，只能对照强光看到弱带，几乎无法保存。因此，该位点的检测染色试剂配方浓度加大。
[0153] 实施例2酯酶-3(esterase-3,Es3)的检测
[0154] 浸板：将醋酸纤维素板在Tris-甘氨酸pH 8.9的缓冲液中浸透，避免板上出现气泡。
[0155] 加样：用微量加样器将样品添加到加样板上，每孔不超过10μl。
[0156] 点样：取出浸透后的板，在两层滤纸中吸干余液，立即放在超级加样器的点样板上，用超级加样器在加样板上取样，添加浸透的醋酸纤维素板上。其中，加样板和点样板是超级加样器的组合。
[0157] 电泳：将点样的醋酸纤维素板平贴在电泳槽支架的滤纸桥上(点样面向下)，点样端位于阴极，注意薄膜紧贴在绷直的滤纸上，盖上电泳槽盖，电压调到200V，接通电泳仪，50min完成。
[0158] 染色：电泳进行50分钟，应用琼脂覆盖法进行染色。电泳结束后，将加入0.9-1.5倍其体积溶化的2wt％琼脂与备用染色液混合，充分混合后，均匀覆盖在醋酸纤维素板上，直至呈现清晰的带型；去除染色液，放入7％的冰醋酸固定液中固定10分钟以上。
[0159] 结果判定：待测动物的Es3与标准品对比，CMU/1在标准的快慢带区域形成三条平行带，确定为b带；CMU/2在标准的快慢带区域形成二条平行带，确定为d带，并且检测所有待检动物的结果均一致。结果见图2。
[0160] 另外，从清晰度方面来讲，脏器器官的匀浆浓度比小鼠近交系的要求高。
[0161] 实施例3碳酸酐酶-2(carbonic anhydrase-2,Car2)的检测
[0162] 浸板：将醋酸纤维板在NaC2H3O2-EDTA pH5.4的缓冲液(1：4稀释)中浸透，避免膜上出现气泡。
[0163] 加样：用微量加样器将样品添加到加样板上，每孔不超过10μl。点样：取出浸透后的膜，在两层滤纸中吸干余液，立即放在超级加样器的点样板上，用超级加样器在加样板上取样，添加代浸透的醋酸纤维板上。
[0164] 电泳：将点样的醋酸纤维板平贴在电泳槽支架的滤纸桥上(点样面向下)，点样端位于阳极，注意薄膜紧贴在绷直的滤纸上，盖上电泳槽盖，电压调到240V，接通电泳仪，40min完成。
[0165] 染色：电泳40min后，应用蛋白染色法进行染色。电泳结束，将纤维板浸透在染色液中，染色时间20-30min，应用漂洗液漂洗至背景清晰。
[0166] 结果判定：待测动物的Car-2与标准品对比，CMU/1和CMU/2比标准的快慢带略快，为2条平行带，确定为c带，并且检测所有待检动物的结果均为c带，结果见图3。
[0167] 另外，从清晰度方面来讲，溶血素的浓度比小鼠近交系的要求高，制备溶血素成品介于浑浊与透明之间，要求溶血素制备完1-2天内完成电泳。
[0168] 实施例4碱性磷酸酶-1(alkaline phosphatase-1,Akp1)的处理
[0169] 浸板：将醋酸纤维素板在Tris-柠檬酸pH 8.3的缓冲液中浸透，避免板上出现气泡。
[0170] 加样：用微量加样器将样品添加到加样板上，每孔不超过10μl。
[0171] 点样：取出浸透后的板，在两层滤纸中吸干余液，立即放在超级加样器的点样板上，用超级加样器在加样板上取样，添加浸透的醋酸纤维素板上。
[0172] 电泳：将点样的醋酸纤维素板平贴在电泳槽支架的滤纸桥上(点样面向下)，点样端位于阴极，注意薄膜紧贴在绷直的滤纸上，盖上电泳槽盖，电压调到200V，接通电泳仪，40min完成。
[0173] 染色：电泳进行40分钟，应用琼脂覆盖法进行染色。电泳结束后，将加入0.9-1.5倍其体积2wt％溶化的琼脂与混合试剂充分混合，立即覆盖到纤维板上，约30～40min能够看到显色带，然后将染色液去掉，放入7v％的冰醋酸固定液中固定10分钟以上。
[0174] 结果判定：待测动物的Akp-1与标准品对比，CMU/1和CMU/2与标准的快带a呈一条直线，确定为a带，并且检测所有待检动物的结果均为a带。
[0175] 另外，从清晰度方面来讲，脏器器官的匀浆浓度比小鼠近交系的要求高。
[0176] 在检测过程中，尝试使用国标GB/T 14927.1-2008小鼠的染色配方显色，结果显示的带型很浅，只能对照强光看到弱带，几乎无法保存。因此，针对该位点的检测染色试剂配方通过多方面的调整、测试获得。
[0177] 实施例5异柠檬酸脱氢酶-1(isocitrate dehydorgenase-1,Idh1)的检测[0178] 浸板：将醋酸纤维素板在Tris-柠檬酸pH 7.6的缓冲液中浸透，避免板上出现气泡。
[0179] 加样：用微量加样器将样品添加到加样板上，每孔不超过10μl。
[0180] 点样：取出浸透后的板，在两层滤纸中吸干余液，立即放在超级加样器的点样板上，用超级加样器在加样板上取样，添加浸透的醋酸纤维素板上。
[0181] 电泳：将点样的醋酸纤维素板平贴在电泳槽支架的滤纸桥上(点样面向下)，点样端位于阴极，注意薄膜紧贴在绷直的滤纸上，盖上电泳槽盖，电压调到200V，接通电泳仪，35min完成。
[0182] 染色：电泳进行35分钟，应用琼脂覆盖法进行染色。电泳结束后，将加入0.9-1.5倍其体积2wt％溶化的琼脂与混合试剂充分混合，立即覆盖到纤维板上，直至呈现清晰的带型；然后将染色液去掉，放入7v％的冰醋酸固定液中固定10分钟以上。
[0183] 结果判定：待测动物的Idh-1与标准品对比，CMU/1和CMU/2比标准的快带b快，确定为c带，并且检测所有待检动物的结果均为c带。
[0184] 另外，从清晰度方面来讲，脏器器官的匀浆浓度与小鼠近交系的要求高。
[0185] 在检测过程中，尝试使用国标GB/T 14927.1-2008小鼠的染色配方显色，结果显示的带型浅，无法保存。因此，针对该位点的检测染色试剂配方通过多方面的调整、测试获得。
[0186] 实施例6苹果酸酶-1(malic enzyme-1,Mod1)的检测
[0187] 方法同实施例5。
[0188] 结果判定：待测动物的Mod-1与标准品对比，CMU/1和CMU/2与标准的快带a呈一条直线，确定为a带，并且检测所有待检动物的结果均为a带。
[0189] 实施例7磷酸葡萄糖转位酶-1(Phosphoglcomulase-1,Pgm1)的检测
[0190] 浸板：将醋酸纤维素板在Tris-甘氨酸pH 8.5的缓冲液中浸透，避免板上出现气泡。
[0191] 加样：用微量加样器将样品添加到加样板上，每孔不超过10μl。
[0192] 点样：取出浸透后的板，在两层滤纸中吸干余液，立即放在超级加样器的点样板上，用超级加样器在加样板上取样，添加浸透的醋酸纤维素板上。
[0193] 电泳：将点样的醋酸纤维素板平贴在电泳槽支架的滤纸桥上(点样面向下)，点样端位于阴极，注意薄膜紧贴在绷直的滤纸上，盖上电泳槽盖，电压调到200V，接通电泳仪，40min完成。
[0194] 染色：电泳进行40分钟，应用琼脂覆盖法进行染色。电泳结束后，将加入0.9-1.5倍其体积2wt％溶化的琼脂与混合试剂充分混合，立即覆盖到纤维板上，直至呈现清晰的带型；然后将染色液去掉，放入7v％的冰醋酸固定液中固定10分钟以上。
[0195] 结果判定：待测动物的Pgm-1与标准品对比，CMU/1和CMU/2比标准的慢带b慢，确定为c带，并且检测所有待检动物的结果均为c带，见图4。
[0196] 另外，从清晰度方面来讲，脏器器官的匀浆浓度与小鼠近交系的要求高。
[0197] 在检测过程中，尝试使用国标GB/T 14927.1-2008小鼠的染色配方显色，结果显示的带型很浅，几乎无法保存。因此，针对该位点的检测染色试剂配方通过多方面的调整、测试获得。实施例8肾过氧化氢酶-2(kidney catelase,Ce2)的检测
[0198] 浸膜：将醋酸纤维板在Tris-柠檬酸Ph7.6的缓冲液中浸透，避免膜上出现气泡。
[0199] 加样：样品需要1:3稀释，用微量加样器将样品添加到加样板上，每孔不超过10μl。
[0200] 点样：取出浸透后的膜，在两层滤纸中吸干余液，立即放在超级加样器的点样板上，用超级加样器在加样板上取样，添加代浸透的醋酸纤维板上。
[0201] 电泳：将点样的醋酸纤维板平贴在电泳槽支架的滤纸桥上(点样面向下)，点样端位于阴极，注意薄膜紧贴在绷直的滤纸上，盖上电泳槽盖，电压调到200V，接通电泳仪，25min完成。
[0202] 染色：电泳进行25分钟，应用琼脂覆盖法进行染色。电泳结束后，板侵入3v‰的双氧水中30s，再用蒸馏水漂洗2遍，将加入0.9-1.5倍其体积2wt％琼脂(热)与混合试剂充分混合，立即覆盖到纤维板上，约10min能够看到显色带，然后将染色液去掉，放入7v％的冰醋酸固定液中固定10分钟以上。
[0203] 结果判定：待测动物的Ce-2与标准品对比，CMU/1和CMU/2与标准的块带a平行，确定为a带，并且检测所有待检动物的结果均为a带。
[0204] 实施例9肽酶-3(peptidase-3,Pep3)的检测
[0205] 浸板：将醋酸纤维素板在Tris-甘氨酸pH 8.5的缓冲液中浸透，避免板上出现气泡。
[0206] 加样：用微量加样器将样品添加到加样板上，每孔不超过10μl。
[0207] 点样：取出浸透后的板，在两层滤纸中吸干余液，立即放在超级加样器的点样板上，用超级加样器在加样板上取样，添加浸透的醋酸纤维素板上。
[0208] 电泳：将点样的醋酸纤维素板平贴在电泳槽支架的滤纸桥上(点样面向下)，点样端位于阴极，注意薄膜紧贴在绷直的滤纸上，盖上电泳槽盖，电压调到200V，接通电泳仪，30min完成。
[0209] 染色：电泳进行30分钟，应用琼脂覆盖法进行染色。电泳结束后，将加入0.9-1.5倍其体积2wt％溶化的琼脂与混合试剂充分混合，立即覆盖到纤维板上，在20-40℃的温度下显色30分钟以上，直至呈现清晰的带型；去除染色液，放入7％的冰醋酸固定液中固定10分钟以上。
[0210] 结果判定：待测动物的Pep-3与标准品对比，CMU/1和CMU/2比标准的慢带a慢，确定为d带，并且检测所有待检动物的结果均为d带。
[0211] 另外，从清晰度方面来讲，脏器器官的匀浆浓度与小鼠近交系的要求高。
[0212] 在检测过程中，尝试使用国标GB/T 14927.1-2008小鼠的染色配方显色，结果显示的带型很浅，几乎无法保存。因此，针对该位点的检测染色试剂配方通过多方面的调整、测试获得。实施例10葡萄糖磷酸异构酶-1(glucosephosphate isomerase-1,Gpi1)的检测[0213] 浸板：将醋酸纤维素板在Tris-甘氨酸pH 8.5的缓冲液中浸透，避免板上出现气泡。
[0214] 加样：用微量加样器将样品添加到加样板上，每孔不超过10μl。
[0215] 点样：取出浸透后的板，在两层滤纸中吸干余液，立即放在超级加样器的点样板上，用超级加样器在加样板上取样，添加浸透的醋酸纤维素板上。
[0216] 电泳：将点样的醋酸纤维素板平贴在电泳槽支架的滤纸桥上(点样面向下)，点样端位于阳极，注意薄膜紧贴在绷直的滤纸上，盖上电泳槽盖，电压调到200V，接通电泳仪，30min完成。
[0217] 染色：电泳进行30分钟，应用琼脂覆盖法进行染色。电泳结束后，将加入0.9-1.5倍其体积2wt％溶化的琼脂与混合试剂充分混合，立即覆盖到纤维板上，直至呈现清晰的带型；去除染色液，放入7％的冰醋酸固定液中固定10分钟以上。
[0218] 结果判定：待测动物的Gpi-1与标准品对比，CMU/1和CMU/2与标准的慢带a呈一条直线，确定为a带，并且检测所有待检动物的结果均为a带。
[0219] 另外，从清晰度方面来讲，脏器器官的匀浆浓度与小鼠近交系的要求高。
[0220] 在检测过程中，尝试使用国标GB/T 14927.1-2008小鼠的染色配方显色，结果显示的带型很浅，几乎无法保存。因此，针对该位点的检测染色试剂配方通过多方面的调整、测试获得。实施例11血红蛋白-β链(hemoglobinβ-chain,Hbb)的检测
[0221] 浸膜：将醋酸纤维板在Tris-甘氨酸pH 8.5的缓冲液中浸透，避免膜上出现气泡。
[0222] 加样：用微量加样器将样品与烷化剂(4/1)添加到加样板上，每孔不超过10μl。
[0223] 点样：取出浸透后的膜，在两层滤纸中吸干余液，立即放在超级加样器的点样板上，用超级加样器在加样板上取样，添加代浸透的醋酸纤维板上。
[0224] 电泳：将点样的醋酸纤维板平贴在电泳槽支架的滤纸桥上(点样面向下)，点样端位于阴极，注意薄膜紧贴在绷直的滤纸上，盖上电泳槽盖，电压调到200V，接通电泳仪，30min完成。
[0225] 染色：应用蛋白染色法进行染色。电泳结束，将纤维板浸透在染色液中，染色时间20-30min，应用漂洗液漂洗至背景清晰。
[0226] 结果判定：待测动物的Hbb与标准品对比，CMU/1和CMU/2介于标准的快慢带之间，确定为e带，并且检测所有待检动物的结果均为e带。
[0227] 实施例12转铁蛋白(transferring,Trf)的检测
[0228] 浸板：将醋酸纤维素板在Tris-甘氨酸pH 8.5的缓冲液中浸透，避免板上出现气泡。
[0229] 加样：用微量加样器将样品添加到加样板上，每孔不超过10μl。
[0230] 点样：取出浸透后的板，在两层滤纸中吸干余液，立即放在超级加样器的点样板上，用超级加样器在加样板上取样，添加浸透的醋酸纤维素板上。
[0231] 电泳：将点样的醋酸纤维素板平贴在电泳槽支架的滤纸桥上(点样面向下)，点样端位于阴极，注意薄膜紧贴在绷直的滤纸上，盖上电泳槽盖，电压调到200V，接通电泳仪，30min完成。
[0232] 染色：应用蛋白染色法进行染色。电泳结束，将纤维板浸透在染色液中，染色时间20-30min，应用漂洗液漂洗至背景清晰。
[0233] 结果判定：待测动物的Trf与标准品对比，CMU/1和CMU/2在标准的慢带b区域呈二条线，确定为c带，并且检测所有待检动物的结果均为c带。
[0234] 实施例13酯酶-1(esterase-1,Es1)的检测
[0235] 浸板：将醋酸纤维素板在磷酸盐pH 7.0的缓冲液中浸透，避免板上出现气泡。
[0236] 加样：用微量加样器将样品添加到加样板上，每孔不超过10μl。
[0237] 点样：取出浸透后的板，在两层滤纸中吸干余液，立即放在超级加样器的点样板上，用超级加样器在加样板上取样，添加浸透的醋酸纤维素板上。
[0238] 电泳：将点样的醋酸纤维素板平贴在电泳槽支架的滤纸桥上(点样面向下)，点样端位于阴极，注意薄膜紧贴在绷直的滤纸上，盖上电泳槽盖，电压调到140V，接通电泳仪，30min完成。
[0239] 染色：电泳进行30分钟，应用琼脂覆盖法进行染色。电泳结束后，将加入0.9-1.5倍其体积溶化的2wt％琼脂与备用染色液混合，充分混合后，均匀覆盖在醋酸纤维素板上，直至呈现清晰的带型；去除染色液，放入7％的冰醋酸固定液中固定10分钟以上。
[0240] 结果判定：待测动物的Es1与标准品对比，CMU/1和CMU/2比标准的慢带b带慢，确定为c带，并且检测所有待检动物的结果均一致。
[0241] 实施例14酯酶-10(esterase-10,Es10)的检测
[0242] 浸板：将醋酸纤维素板在Tris-EDTA-硼酸Ph 8.4的缓冲液中浸透，避免板上出现气泡。
[0243] 加样：用微量加样器将样品添加到加样板上，每孔不超过10μl。
[0244] 点样：取出浸透后的板，在两层滤纸中吸干余液，立即放在超级加样器的点样板上，用超级加样器在加样板上取样，添加浸透的醋酸纤维素板上。
[0245] 电泳：将点样的醋酸纤维素板平贴在电泳槽支架的滤纸桥上(点样面向下)，点样端位于阴极，注意薄膜紧贴在绷直的滤纸上，盖上电泳槽盖，电压调到200V，接通电泳仪，35min完成。
[0246] 染色：电泳进行35分钟，应用琼脂覆盖法进行染色。电泳结束后，将加入0.9-1.5倍其体积溶化的2wt％琼脂与备用染色液混合，充分混合后，均匀覆盖在醋酸纤维素板上，直至呈现清晰的带型；去除染色液，放入7％的冰醋酸固定液中固定10分钟以上。
[0247] 结果判定：待测动物的Es1与标准品对比，CMU/1和CMU/2比标准的慢带a带慢，确定为c带，并且检测所有待检动物的结果均一致，见图5。
[0248] 实施例15甘油磷酸脱氢酶-1(Glycerol phosphate dehydrogenase-1,Gdc-1)的检测
[0249] 浸板：将醋酸纤维素板在Tris-H3BO3-Na2HPO4-EDTA pH 8.0的缓冲液中浸透，避免板上出现气泡。
[0250] 加样：用微量加样器将样品添加到加样板上，每孔不超过10μl。
[0251] 点样：取出浸透后的板，在两层滤纸中吸干余液，立即放在超级加样器的点样板上，用超级加样器在加样板上取样，添加浸透的醋酸纤维素板上。
[0252] 电泳：将点样的醋酸纤维素板平贴在电泳槽支架的滤纸桥上(点样面向下)，点样端位于阴极，注意薄膜紧贴在绷直的滤纸上，盖上电泳槽盖，电压调到200V，接通电泳仪，30min完成。
[0253] 染色：电泳进行30分钟，应用琼脂覆盖法进行染色。电泳结束后，将加入0.9-1.5倍其体积2wt％溶化的琼脂与混合试剂充分混合，均匀覆盖在醋酸纤维素板上，直至呈现清晰的带型；去除染色液，放入7％的冰醋酸固定液中固定10分钟以上。
[0254] 结果判定：待测动物的Gdc-1与标准品对比，CMU/1和CMU/2与标准的快带c带呈一条直线，确定为c带，并且检测所有待检动物的结果均为c带。
[0255] 另外，从清晰度方面来讲，脏器器官的匀浆浓度与小鼠近交系的要求高，从电泳结果方面来讲，该位点的结果要在保存染色液的情况下进行扫描效果较好。
[0256] 实施例16β-葡萄糖苷酸酶-1(β-Glucosidase-1,Gus-1)的检测
[0257] 浸板：将醋酸纤维素板在NaC2H3O2-EDTA pH5.4的缓冲液中浸透，避免板上出现气泡。
[0258] 加样：用微量加样器将样品添加到加样板上，每孔不超过10μl。
[0259] 点样：取出浸透后的板，在两层滤纸中吸干余液，立即放在超级加样器的点样板上，用超级加样器在加样板上取样，添加浸透的醋酸纤维素板上。
[0260] 电泳：将点样的醋酸纤维素板平贴在电泳槽支架的滤纸桥上(点样面向下)，点样端位于阴极，注意薄膜紧贴在绷直的滤纸上，盖上电泳槽盖，电压调到200V，接通电泳仪，60min完成。
[0261] 染色：电泳进行60分钟，应用琼脂覆盖法进行染色。电泳结束后，将加入0.9-1.5倍其体积2wt％溶化的琼脂与混合试剂充分混合，均匀覆盖在醋酸纤维素板上，在20℃-40℃的温度下显色30分钟以上，直至呈现清晰的带型。去除染色液，放入7％的冰醋酸固定液中固定10分钟以上。
[0262] 结果判定：待测动物的Gus-1与标准品对比，CMU/1和CMU/2与标准的快带b带块，确定为c带，并且检测所有待检动物的结果均为c带。
[0263] 另外，从清晰度方面来讲，脏器器官的匀浆浓度比小鼠近交系的要求高。从电泳结果方面来讲，该位点最好脏器匀浆制备完1-2天内做检测较好。
[0264] 实施例17酯酶-2(esterase-2,Es2)的检测
[0265] 浸板：将醋酸纤维素板在磷酸盐pH 7.0的缓冲液中浸透，避免板上出现气泡。
[0266] 加样：用微量加样器将样品添加到加样板上，每孔不超过10μl。
[0267] 点样：取出浸透后的板，在两层滤纸中吸干余液，立即放在超级加样器的点样板上，用超级加样器在加样板上取样，添加浸透的醋酸纤维素板上。
[0268] 电泳：将点样的醋酸纤维素板平贴在电泳槽支架的滤纸桥上(点样面向下)，点样端位于阴极，注意薄膜紧贴在绷直的滤纸上，盖上电泳槽盖，电压调到140V，接通电泳仪，30min完成。
[0269] 染色：电泳进行30分钟，应用琼脂覆盖法进行染色。电泳结束后，将加入0.9-1.5倍其体积的溶化的2wt％琼脂与备用染色液混合，充分混合后，均匀覆盖在醋酸纤维素板上，直至呈现清晰的带型；去除染色液，放入7％的冰醋酸固定液中固定10分钟以上。
[0270] 结果判定：待测动物的Es2与标准品对比，CMU/1和CMU/2比标准的慢带c带慢，确定为d带，并且检测所有待检动物的结果均一致。
[0271] 实施例18乳酸脱氢酶调节体-1(Lactate dehydrogenase regulatory body-1,Ldr-1)的检测
[0272] 浸板：将醋酸纤维素板在Tris-柠檬酸Ph 8.3的缓冲液中浸透，避免板上出现气泡。
[0273] 加样：用微量加样器将样品添加到加样板上，每孔不超过10μl。
[0274] 点样：取出浸透后的板，在两层滤纸中吸干余液，立即放在超级加样器的点样板上，用超级加样器在加样板上取样，添加浸透的醋酸纤维素板上。
[0275] 电泳：将点样的醋酸纤维素板平贴在电泳槽支架的滤纸桥上(点样面向下)，点样端位于阴极，注意薄膜紧贴在绷直的滤纸上，盖上电泳槽盖，电压调到200V，接通电泳仪，40min完成。
[0276] 染色：电泳进行40分钟，应用琼脂覆盖法进行染色。电泳结束后，加入加入0.9-1.5倍其体积溶化的2wt％琼脂l，充分混合后，均匀覆盖在醋酸纤维素板上，直至呈现清晰的带型；去除染色液，放入7％的冰醋酸固定液中固定10分钟以上。
[0277] 结果判定：待测动物的Ldr-1与标准品对比，CMU/1和CMU/2比标准的a带块，确定为b带，并且检测所有待检动物的结果均为b带，见图6。
[0278] 另外，从清晰度方面来讲，脏器器官的匀浆浓度比小鼠近交系的要求高。
[0279] 实施例19血清蛋白-1(Serum albumin-1,Sep-1)的检测
[0280] 浸板：将醋酸纤维素板在Tris-甘氨酸pH 8.5的缓冲液中浸透，避免板上出现气泡。
[0281] 加样：用微量加样器将样品添加到加样板上，每孔不超过10μl。
[0282] 点样：取出浸透后的板，在两层滤纸中吸干余液，立即放在超级加样器的点样板上，用超级加样器在加样板上取样，添加浸透的醋酸纤维素板上。
[0283] 电泳：将点样的醋酸纤维素板平贴在电泳槽支架的滤纸桥上(点样面向下)，点样端位于阴极，注意薄膜紧贴在绷直的滤纸上，盖上电泳槽盖，电压调到250V，接通电泳仪，30min完成。
[0284] 染色：应用蛋白染色法进行染色。电泳结束，将纤维板浸透在染色液中，染色时间20-30min，应用漂洗液漂洗至背景清晰。
[0285] 结果判定：待测动物的Sep-1与标准品对比，CMU/1和CMU/2在标准的慢带a慢，呈三条线，确定为c带，并且检测所有待检动物的结果均为c带。
[0286] 实施例20淀粉酶-1(Amylase-1,Amy-1)的检测
[0287] 浸板：将醋酸纤维素板在Tris-ETAD-硼酸pH 8.4的缓冲液中浸透，避免板上出现气泡。
[0288] 加样：用微量加样器将样品添加到加样板上，每孔不超过10μl。
[0289] 点样：取出浸透后的板，在两层滤纸中吸干余液，立即放在超级加样器的点样板上，用超级加样器在加样板上取样，添加浸透的醋酸纤维素板上。
[0290] 电泳：将点样的醋酸纤维素板平贴在电泳槽支架的滤纸桥上(点样面向下)，点样端位于阴极，注意薄膜紧贴在绷直的滤纸上，盖上电泳槽盖，电压调到300V，接通电泳仪，30min完成。
[0291] 染色：应用蛋白染色法进行染色。电泳结束，将纤维板浸透在染色液中，染色时间20-30min，应用漂洗液漂洗至背景清晰。
[0292] 结果判定：待测动物的Amy-1与标准品对比，CMU/1和CMU/2与标准的慢带b慢呈一条直线，确定为b带，并且检测所有待检动物的结果均为b带。
[0293] 实施例21酯酶-6(esterase-6,Es6)的检测
[0294] 浸板：将醋酸纤维素板在Tris-ETAD-硼酸pH 8.4的缓冲液中浸透，避免板上出现气泡。
[0295] 加样：用微量加样器将样品添加到加样板上，每孔不超过10μl。
[0296] 点样：取出浸透后的板，在两层滤纸中吸干余液，立即放在超级加样器的点样板上，用超级加样器在加样板上取样，添加浸透的醋酸纤维素板上。
[0297] 电泳：将点样的醋酸纤维素板平贴在电泳槽支架的滤纸桥上(点样面向下)，点样端位于阴极，注意薄膜紧贴在绷直的滤纸上，盖上电泳槽盖，电压调到200V，接通电泳仪，35min完成。
[0298] 染色：电泳进行35分钟，应用琼脂覆盖法进行染色。电泳结束后，将加入0.9-1.5倍其体积溶化的2wt％琼脂与备用染色液混合，充分混合后，均匀覆盖在醋酸纤维素板上，直至呈现清晰的带型；去除染色液，放入7％的冰醋酸固定液中固定10分钟以上。
[0299] 结果判定：待测动物的Es6与标准品对比，CMU/1和CMU/2与标准的快带a带呈一条直线，确定为a带，并且检测所有待检动物的结果均一致。
[0300] 另外，从清晰度方面来讲，脏器器官的匀浆浓度与小鼠近交系的要求高，脏器匀浆制备1-2天做完。
[0301] 实施例22酯酶-8(esterase-8,Es8)的检测
[0302] 方法同实施例21。
[0303] 结果判定：待测动物的Es6与标准品对比，CMU/1和CMU/2比标准的慢带b带慢，确定为c带，并且检测所有待检动物的结果均一致。
[0304] 另外，从清晰度方面来讲，脏器器官的匀浆浓度与小鼠近交系的要求高，脏器匀浆制备1-2天做完。
[0305] 实施例23酯酶-9(esterase-9,Es9)的检测
[0306] 方法同实施例21
[0307] 结果判定：待测动物的Es6与标准品对比，CMU/1和CMU/2与标准的快带c带呈一条直线，确定为c带，并且检测所有待检动物的结果均一致。
[0308] 另外，从清晰度方面来讲，脏器器官的匀浆浓度与小鼠近交系的要求高，脏器匀浆制备1-2天做完。
[0309] 实施例24酯酶-4(esterase-4,Es4)的检测
[0310] 浸板：将醋酸纤维素板在Tris-ETAD-硼酸pH 8.4的缓冲液中浸透，避免板上出现气泡。
[0311] 加样：用微量加样器将样品添加到加样板上，每孔不超过10μl。
[0312] 点样：取出浸透后的板，在两层滤纸中吸干余液，立即放在超级加样器的点样板上，用超级加样器在加样板上取样，添加浸透的醋酸纤维素板上。加样板和点样板是超级加样器的组合。
[0313] 电泳：将点样的醋酸纤维素板平贴在电泳槽支架的滤纸桥上(点样面向下)，点样端位于阴极，注意薄膜紧贴在绷直的滤纸上，盖上电泳槽盖，电压调到200V，接通电泳仪，35min完成。
[0314] 染色：电泳进行35分钟，应用琼脂覆盖法进行染色。电泳结束后，将加入0.9-1.5倍其体积溶化的2wt％琼脂与备用染色液混合，充分混合后，均匀覆盖在醋酸纤维素板上，直至呈现清晰的带型；去除染色液，放入7％的冰醋酸固定液中固定10分钟以上。
[0315] 结果判定：待测动物的Es4与标准品对比，CMU/1比标准的快带快的区域形成三条平行带，确定为c带；CMU/2在标准的快带快区域形成二条平行带，确定为d带，并且检测所有待检动物的结果均一致。结果见图7。
[0316] 另外，从清晰度方面来讲，脏器器官的匀浆浓度与小鼠近交系的要求高。
[0317] 实施例25过氧化氢酶-1(Catalase-1,Cs1)的检测
[0318] 浸膜：将醋酸纤维板在Tris-EDTA-Borate Ph 8.4的缓冲液中浸透，避免膜上出现气泡。
[0319] 加样：样品需要1:1稀释，用微量加样器将样品添加到加样板上，每孔不超过10μl。
[0320] 点样：取出浸透后的膜，在两层滤纸中吸干余液，立即放在超级加样器的点样板上，用超级加样器在加样板上取样，添加代浸透的醋酸纤维板上。
[0321] 电泳：将点样的醋酸纤维板平贴在电泳槽支架的滤纸桥上(点样面向下)，点样端位于阴极，注意薄膜紧贴在绷直的滤纸上，盖上电泳槽盖，电压调到250V，接通电泳仪，35min完成。
[0322] 染色：电泳进行25分钟，应用琼脂覆盖法进行染色。电泳结束后，板侵入3v‰的双氧水中30s，再用蒸馏水漂洗2遍，将入0.9-1.5倍其体积的2wt％琼脂(热)与混合试剂充分混合，立即覆盖到纤维板上，约10min能够看到显色带，然后将染色液去掉，放入7v％的冰醋酸固定液中固定10min以上。
[0323] 结果判定：待测动物的CS-1与标准品对比，CMU/1和CMU/2与标准的慢带b平行，确定为b带，并且检测所有待检动物的结果均为b带。
[0324] 实施例26酯酶-12(esterase-12,Es12)的检测
[0325] 浸板：将醋酸纤维素板在硼酸pH 8.6的缓冲液中浸透，避免板上出现气泡。
[0326] 加样：用微量加样器将样品添加到加样板上，每孔不超过10μl。
[0327] 点样：取出浸透后的板，在两层滤纸中吸干余液，立即放在超级加样器的点样板上，用超级加样器在加样板上取样，添加浸透的醋酸纤维素板上。加样板和点样板是超级加样器的组合。
[0328] 电泳：将点样的醋酸纤维素板平贴在电泳槽支架的滤纸桥上(点样面向下)，点样端位于阴极，注意薄膜紧贴在绷直的滤纸上，盖上电泳槽盖，电压调到150V，接通电泳仪，60min完成。
[0329] 染色：电泳进行60分钟，应用琼脂覆盖法进行染色。电泳结束后，将加入0.9-1.5倍其体积的溶化的2wt％琼脂与备用染色液混合，充分混合后，均匀覆盖在醋酸纤维素板上，直至呈现清晰的带型；去除染色液，放入7％的冰醋酸固定液中固定10分钟以上。
[0330] 结果判定：待测动物的Es12与标准品对比，CMU/1和CMU/2与标准的a带呈平行带，确定为a带。
