一种用于检测阿维巴坦钠关键中间体手性异构体的方法

摘要

本发明为一种用于检测阿维巴坦钠关键中间体手性异构体的方法，具体为使用高效液相色谱法检测(2S,5R)‑5‑(苄氧氨基)‑哌啶‑2‑甲酸苄酯草酸盐中手性异构体的含量以及和主峰有效分离的方法，采用的色谱条件为：色谱柱为CHIRALPAK AD‑H色谱柱，柱温为25～40℃，检测波长为280nm，流动相为正己烷、异戊醇、乙醇和二乙胺的混合物，流速为0.8～1.2mL/min。在实际检测过程中，本方法的检测限达0.33μg/mL，即可以检出关键中间体中高于0.066％的手性异构体，实用性强，检测过程简单、快捷。

权利要求

1.一种用于检测阿维巴坦钠关键中间体手性异构体的方法，所述阿维巴坦钠关键中间体为(2S,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐，所述手性异构体为(2S,5S)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐、(2R,5S)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐、(2R,

5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

S1、制备(2S,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐供试品溶液：

称取(2S,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐样品适量，和甲醇混合配制成供试品溶液，待用；

S2、制备(2S,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐、(2S,5S)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐、(2R,5S)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐、(2R,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐混合对照溶液：称取(2S,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐、(2S,5S)-5-(苄氧氨基)-哌啶-

2-甲酸苄酯草酸盐、(2R,5S)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐、(2R,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐适量，加入容量瓶中，和甲醇混合配制成混合溶液，待用；

S3、分别吸取等量的供试品溶液和混合对照溶液，注入高效色谱仪中进行测定，高效液相色谱法的测定条件包括：色谱柱为CHIRALPAKAD-H色谱柱，柱温为25～40℃，检测波长为

280nm，流动相为正己烷、异戊醇、乙醇和二乙胺的混合物，按体积比计算，正己烷：异戊醇：

乙醇：二乙胺＝840～860：140～160:50:0.5，流速为0.8～1.2mL/min。

2.根据权利要求1所述用于检测阿维巴坦钠关键中间体手性异构体的方法，其特征在于，所述步骤S1供试品溶液中，按照质量体积比g/L计，(2S,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐：甲醇的比值为0.2～5:1。

3.根据权利要求2所述用于检测阿维巴坦钠关键中间体手性异构体的方法，其特征在于，所述步骤S1供试品溶液中，按照质量体积比g/L计，(2S,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐：甲醇的比值为2:1。

4.根据权利要求1所述用于检测阿维巴坦钠关键中间体手性异构体的方法，其特征在于，所述步骤S2混合对照溶液中，按照质量体积比mg/L计，(2S,5S)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐、(2R,5S)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐或(2R,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐：甲醇的比值分别为1～10:1；按照质量体积比g/L计，(2S,

5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐：甲醇的比值为0.2～5:1。

5.根据权利要求4所述用于检测阿维巴坦钠关键中间体手性异构体的方法，其特征在于，所述步骤S2混合对照溶液中，按照质量体积比mg/L计，(2S,5S)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐、(2R,5S)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐和(2R,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐：甲醇的比值分别为5:1。

6.根据权利要求4所述用于检测阿维巴坦钠关键中间体手性异构体的方法，其特征在于，所述步骤S2混合对照溶液中，按照质量体积比g/L计，(2S,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐：甲醇的比值为2:1。

7.根据权利要求1所述用于检测阿维巴坦钠关键中间体手性异构体的方法，其特征在于，所述步骤S3高效液相色谱法的测定条件中，CHIRALPAK AD-H色谱柱的型号为：长250mm，内径4.6mm，直链淀粉填充剂，填充料粒径为5μm。

8.根据权利要求1所述用于检测阿维巴坦钠关键中间体手性异构体的方法，其特征在于，所述步骤S3高效液相色谱法的测定条件中，柱温为30℃。

9.根据权利要求1所述用于检测阿维巴坦钠关键中间体手性异构体的方法，其特征在于，所述步骤S3高效液相色谱法的测定条件中，所述流动相中，按体积比计算，正己烷：异戊醇：乙醇：二乙胺＝850:150:50:0.5。

10.根据权利要求1所述用于检测阿维巴坦钠关键中间体手性异构体的方法，其特征在于，所述步骤S3高效液相色谱法的测定条件中，流速为1mL/min。

说明书

一种用于检测阿维巴坦钠关键中间体手性异构体的方法

技术领域

[0001] 本发明属于医药技术领域，涉及一种用于检测阿维巴坦钠关键中间体的手性异构体的方法，具体涉及(2S,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐的手性异构体的高效液相检测方法。

背景技术

[0002] 阿维巴坦钠(Avibactam Sodium，NXL-104)属于二氮杂双环辛酮化合物，由Forest Lab和阿斯利康联合开发，2014年2月阿特维斯收购Forest Lab，取得开发权，2015年2月25日头孢他啶与阿维巴坦钠复方制剂以商品名AVYCAZ批准在美国上市。阿维巴坦钠是目前最被看好的新型β-内酰胺酶抑制剂。与三种已上市的β-内酰胺酶抑制剂相比，具有长效和与酶可逆性共价结合，且不会诱导β-内酰胺酶产生。

[0003] 头孢他啶是一种头孢菌素抗微生物药对某些革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌有体外活性。头孢他啶的杀细菌作用是通过与基本青霉素结合蛋白(PBPs)结合介导的。阿维巴坦钠是一种非β内酰胺类β-内酰胺酶抑制剂，灭活有些β-内酰胺酶和保护头孢他啶免受某些β-内酰胺酶降解。Avibactam不减低头孢他啶对头孢他啶易感微生物的活性。

[0004] 头孢他啶/阿维巴坦钠复方制剂对大肠杆菌中存在的某些β-内酰胺酶、肺炎克雷伯菌碳青霉烯、某些苯唑西林酶(Oxacillinases，OXA)、铜绿假单胞菌显示出很强的体外活性。

[0005] 该联合用药已经批准用于腹腔感染、复杂性尿路感染，多项适应症已开展临床研究，如医院获得性肺炎已经进行三期临床试验。

[0006] 文献所报道的阿维巴坦钠合成主要是以N-叔丁氧羰基-L-焦谷氨酸苄酯为起始物料，经开环、氯代、环合、还原、拆分成盐得关键中间体(2S,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐，草酸盐经酰胺化、环合、脱保护、成磺酸四丁基乙酸铵、最后经钠盐交换反应得到阿维巴坦钠。经文献检索，(2S,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐为阿维巴坦合成的关键中间体。(2S,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐结构中有两个手性碳原子，存在四个手性异构体：分别为(2S,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐、(2S,5S)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐、(2R,5S)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐、(2R,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐。5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐的化学结构式为：

[0007]

[0008] 在阿维巴坦钠成品质量标准中，对其手性异构体进行了质量控制，而其两个手性中心的形成来源于(2S,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐，其质量的好坏对阿维巴坦钠成品质量有重要影响。为确保临床用药的安全有效，根据手性药物指导原则，有必要对阿维巴坦钠关键中间体(2S,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐的手性异构体进行有效的控制。

[0009] 目前，并无文献报道(2S,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐的手性异构体进行有效控制的方法。在药物开发过程中，中间体的质量控制是一个重要的环节，因此，为不断提高阿维巴坦钠的安全性和有效性，迫切需要建立一种操作简便、灵敏度高、重现性好的阿维巴坦钠中关键中间体(2S,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐手性异构体的HPLC检测方法，为终产品的质量控制提供可靠的依据。

发明内容

[0010] 鉴于此，本发明的目的在于提供一种能有效分离(2S,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐中三个手性异构体的新方法，本检测方法采用高效液相色谱法，对(2S,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐中三个手性异构体进行有效分离并进行定量，其分离度、专属性、定量限与检测限、线性、精密度、准确度、溶液稳定性，耐用性等方面均经详细验证，且各项验证结果均符合相关法规和指导原则的要求，实际检测效果良好。

[0011] 为了达到上述的目的，本发明的技术方案是这样实现的：

[0012] 一种用于检测阿维巴坦钠关键中间体手性异构体的方法，所述阿维巴坦钠关键中间体为(2S,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐，所述手性异构体为(2S,5S)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐、(2R,5S)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐、(2R,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐，所述方法包括以下步骤：

[0013] S1、制备(2S,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐供试品溶液：

[0014] 称取(2S,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐样品适量，和甲醇混合配制成供试品溶液，待用；

[0015] S2、制备(2S,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐、(2S,5S)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐、(2R,5S)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐、(2R,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐混合对照溶液：

[0016] 称取(2S,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐、(2S,5S)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐、(2R,5S)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐、(2R,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐适量，加入容量瓶中，和甲醇混合配制成混合溶液，待用；

[0017] S3、分别吸取等量的供试品溶液和混合对照溶液，注入高效色谱仪中进行测定，所述高效液相色谱法的测定条件包括：色谱柱为CHIRALPAK AD-H色谱柱，柱温为25～40℃，检测波长为280nm，流动相为正己烷、异戊醇、乙醇和二乙胺的混合物，按体积比计算，正己烷：异戊醇：乙醇：二乙胺＝840～860:140～160:50:0.5，流速为0.8～1.2mL/min。

[0018] 进一步的，所述步骤S1供试品溶液中，按照质量体积比(g/L)计，(2S,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐：甲醇的比值为0.2～5:1。

[0019] 进一步的，所述步骤S1供试品溶液中，按照质量体积比(g/L)计，(2S,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐：甲醇的比值为2:1。

[0020] 进一步的，所述步骤S2混合对照溶液中，按照质量体积比(mg/L)计，(2S,5S)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐、(2R,5S)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐或(2R,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐：甲醇的比值分别为1～10:1；按照质量体积比(g/L)计，(2S,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐：甲醇的比值为0.2～5:1。

[0021] 进一步的，所述步骤S2混合对照溶液中，按照质量体积比(mg/L)计，(2S,5S)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐、(2R,5S)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐或(2R,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐：甲醇的比值分别为5:1。

[0022] 进一步的，按照质量体积比(g/L)计，(2S,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐：甲醇的比值为2:1。

[0023] 进一步的，所述步骤S3高效液相色谱法的测定条件中，CHIRALPAK AD-H色谱柱的型号为：长250mm，内径4.6mm，直链淀粉填充剂，填充料粒径为5μm。

[0024] 进一步的，所述步骤S3高效液相色谱法的测定条件中，柱温为30℃。

[0025] 进一步的，所述步骤S3高效液相色谱法的测定条件中，所述流动相中，按体积比计算，正己烷：异戊醇：乙醇：二乙胺＝850:150:50:0.5。

[0026] 进一步的，所述步骤S3高效液相色谱法的测定条件中，流速为1mL/min。

[0027] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：

[0028] 本发明提供了(2S,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐及其三个手性异构体进行分离检测的方法，本发明采用新的色谱条件，能有效地对阿维巴坦钠关键中间体中手性异构体进行分离，峰型对称，无拖尾现象。采用标准品对照的方法，其分离度、专属性、定量限与检测限、线性、精密度、准确度、溶液稳定性、耐用性等方面均经详细验证，且各项验证结果均符合相关法规和指导原则的要求，实际检测效果良好。

[0029] 本发明实用性强，在实际检测过程中，其检测限达0.33μg/mL，即可以检出(2S,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐中高于0.066％的手性异构体，实用性强。检测过程简单、快捷。

[0030] 本发明所述的高效液相色谱法，其测定条件中所包含的范围内均为有效值，即：在各参数范围内取任意值后，也能准确的检测出关键中间体中的手性异构体，且能对手性异构体进行有效分离。在实际检测过程中，便于检测人员对参数的调整和避免人为误差对检测结果产生的影响，适宜推广使用。

附图说明

[0031] 为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

[0032] 图1为本发明实施例1的供试品溶液的HPLC图谱；

[0033] 图2为本发明实施例1的混合对照溶液的HPLC图谱。

具体实施方式

[0034] 为了对阿维巴坦钠关键中间体进行质量控制，以及不断提高阿维巴坦钠药品的安全性和有效性，本发明提出了一种用于检测阿维巴坦钠中关键中间体手性异构体的方法，主要是对(2S,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐及其三个手性异构体进行分离检测。

[0035] 本发明使用的高效液相色谱法是采用(2S,5S)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐、(2R,5S)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐、(2R,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐作为对照品进行定位，对阿维巴坦钠关键中间体(2S,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐样品进行检测，具体步骤可概括如下：

[0036] 一种用于检测阿维巴坦钠关键中间体手性异构体的方法，包括以下步骤：

[0037] S1、制备(2S,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐供试品溶液：

[0038] 称取(2S,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐样品适量，和甲醇混合配制成供试品溶液，待用。按照质量体积比(g/L)计，(2S,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐：甲醇的比值为0.2～5:1，优化的比值为2:1。

[0039] S2、制备(2S,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐、(2S,5S)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐、(2R,5S)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐、(2R,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐混合对照溶液：

[0040] 称取(2S,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐、(2S,5S)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐、(2R,5S)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐、(2R,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐适量，加入容量瓶中，和甲醇混合配制成混合溶液，待用。按照质量体积比(mg/L)计，(2S,5S)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐、(2R,5S)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐或(2R,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐：甲醇的比值分别为1～10:1，优化的比值为5:1；按照质量体积比(g/L)计，(2S,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐：甲醇的比值为0.2～5:1，优化的比值为2:1。

[0041] S3、分别吸取等量的供试品溶液和混合对照溶液，注入高效色谱仪中进行测定，所述高效液相色谱法的测定条件包括：

[0042] 检查方法：中国药典2015版二部附录高效液相色谱法；

[0043] 色谱柱：CHIRALPAK AD-H(型号：长250mm，内径4.6mm，直链淀粉填充剂，填充料粒径5μm)；

[0044] 检测器：UV检测器；

[0045] 检测波长：280nm；

[0046] 柱温：25～40℃，优选为30℃；

[0047] 流速：0.8～1.2mL/min，优选为1mL/min；

[0048] 流动相：按体积比计算，正己烷：异戊醇：乙醇：二乙胺＝840～860:140～160:50:0.5，优选为850:150:50:0.5。

[0049] 在实际检测过程中，对于本发明采用的高效液相色谱法而言，其测定条件中在各参数范围内进行适当调整后，也能准确的检测出(2S,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐中的手性异构体，且能对(2S,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐和其三个手性异构体进行有效的分离。

[0050] 以下以7个典型实施例来列举说明本发明的具体实施方式，选取相同批号(150804批)的(2S,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐样品进行检测。

[0051] 实施例1

[0052] 选取批号为150804的(2S,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐样品，对其手性异构体的含量进行检测，包括如下步骤：

[0053] S1、制备供试品溶液：

[0054] 称取20mg(2S,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐样品，加入10mL甲醇，混合均匀后，配制成每1mL含(2S,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐2.0mg的溶液，作为供试品溶液，待用。

[0055] S2、制备混合对照溶液：

[0056] 称取2g(2S,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐、5mg(2S,5S)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐、5mg(2R,5S)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐和5mg(2R,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐，加入1000mL甲醇，混合均匀后，配制成每1mL含(2S,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐2mg、(2S,5S)-5-(苄氧氨基)-哌啶-
2-甲酸苄酯草酸盐5μg、(2R,5S)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐5μg、(2R,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐5μg的溶液，作为混合对照溶液，待用。

[0057] S3、取混合对照溶液20μL注入高效液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高为满量程的20％～25％，再精密量取供试品溶液与混合对照溶液各20μL，分别注入相色谱仪，记录色谱图。图1和图2分别为本实施例中的(2S,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐供试品和手性异构体混合溶液高效液相色谱图。其中高效液相色谱法的测定条件包括：

[0058] 色谱柱：CHIRALPAK AD-H(型号：长250mm，内径4.6mm，直链淀粉填充剂，填充料粒径5μm)；

[0059] 检测器：UV检测器；

[0060] 检测波长：280nm；

[0061] 柱温：30℃；

[0062] 流速：1mL/min；

[0063] 流动相：按体积比计算，正己烷：异戊醇：乙醇：二乙胺＝850:150:50:0.5。

[0064] 按外标法计算，批号为150804的(2S,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐样品中(2S,5S)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐含量为0.93％，(2R,5S)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐、(2R,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐未检出，且四个异构体能达到完全基线分离。

[0065] 实施例2

[0066] 选取批号和实施例1相同批的(2S,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐样品，对其手性异构体的含量进行检测，本实施例与实施例1的区别仅在于：色谱条件中流速的参数不同，其它检测条件和实施例1一致。在本实施例中，高效液相色谱法的测定条件包括：

[0067] 色谱柱：CHIRALPAK AD-H(型号：长250mm，内径4.6mm，直链淀粉填充剂，填充料粒径5μm)；

[0068] 检测器：UV检测器；

[0069] 检测波长：280nm；

[0070] 柱温：30℃；

[0071] 流速：0.8mL/min；

[0072] 流动相：按体积比计算，正己烷：异戊醇：乙醇：二乙胺＝850:150:50:0.5。

[0073] 按外标法计算，(2S,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐样品中(2S,5S)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐含量为0.94％，(2R,5S)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐、(2R,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐未检出，且四个异构体能达到完全基线分离。

[0074] 实施例3

[0075] 选取批号和实施例1相同批的(2S,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐样品，对其手性异构体的含量进行检测，本实施例与实施例1的区别仅在于：色谱条件中流速的参数不同，其它检测条件和实施例1一致。在本实施例中，高效液相色谱法的测定条件包括：

[0076] 色谱柱：CHIRALPAK AD-H(型号：长250mm，内径4.6mm，直链淀粉填充剂，填充料粒径5μm)；

[0077] 检测器：UV检测器；

[0078] 检测波长：280nm；

[0079] 柱温：30℃；

[0080] 流速：1.2mL/min；

[0081] 流动相：按体积比计算，正己烷：异戊醇：乙醇：二乙胺＝850:150:50:0.5。

[0082] 按外标法计算，(2S,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐样品中(2S,5S)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐含量为0.92％，(2R,5S)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐、(2R,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐未检出，且四个异构体能达到完全基线分离。

[0083] 实施例4

[0084] 选取批号和实施例1相同批的(2S,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐样品，对其手性异构体的含量进行检测，本实施例与实施例1的区别仅在于：色谱条件中柱温的参数不同，其它检测条件和实施例1一致。在本实施例中，高效液相色谱法的测定条件包括：

[0085] 色谱柱：CHIRALPAK AD-H(型号：长250mm，内径4.6mm，直链淀粉填充剂，填充料粒径5μm)；

[0086] 检测器：UV检测器；

[0087] 检测波长：280nm；

[0088] 柱温：25℃；

[0089] 流速：1mL/min；

[0090] 流动相：按体积比计算，正己烷：异戊醇：乙醇：二乙胺＝850:150:50:0.5。

[0091] 按外标法计算，(2S,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐样品中(2S,5S)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐含量为0.92％，(2R,5S)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐、(2R,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐未检出，且四个异构体能达到完全基线分离。

[0092] 实施例5

[0093] 选取批号和实施例1相同批的(2S,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐样品，对其手性异构体的含量进行检测，本实施例与实施例1的区别仅在于：色谱条件中柱温的参数不同，其它检测条件和实施例1一致。在本实施例中，高效液相色谱法的测定条件包括：

[0094] 色谱柱：CHIRALPAK AD-H(型号：长250mm，内径4.6mm，直链淀粉填充剂，填充料粒径5μm)；

[0095] 检测器：UV检测器；

[0096] 检测波长：280nm；

[0097] 柱温：40℃；

[0098] 流速：1mL/min；

[0099] 流动相：按体积比计算，正己烷：异戊醇：乙醇：二乙胺＝850:150:50:0.5。

[0100] 按外标法计算，(2S,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐样品中(2S,5S)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐含量为0.92％，(2R,5S)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐、(2R,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐未检出，且四个异构体能达到完全基线分离。

[0101] 实施例6

[0102] 选取批号和实施例1相同批的(2S,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐样品，对其手性异构体的含量进行检测，本实施例与实施例1的区别仅在于：色谱条件中流动相比例的参数不同，其它检测条件和实施例1一致。在本实施例中，高效液相色谱法的测定条件包括：

[0103] 色谱柱：CHIRALPAK AD-H(型号：长250mm，内径4.6mm，直链淀粉填充剂，填充料粒径5μm)；

[0104] 检测器：UV检测器；

[0105] 检测波长：280nm；

[0106] 柱温：30℃；

[0107] 流速：1mL/min；

[0108] 流动相：按体积比计算，正己烷：异戊醇：乙醇：二乙胺＝860:140:50:0.5。

[0109] 按外标法计算，(2S,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐样品中(2S,5S)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐含量为0.92％，(2R,5S)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐、(2R,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐未检出，且四个异构体能达到完全基线分离。

[0110] 实施例7

[0111] 选取批号和实施例1相同批的(2S,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐样品，对其手性异构体的含量进行检测，本实施例与实施例1的区别仅在于：色谱条件中流动相比例的参数不同，其它检测条件和实施例1一致。在本实施例中，高效液相色谱法的测定条件包括：

[0112] 色谱柱：CHIRALPAK AD-H(型号：长250mm，内径4.6mm，直链淀粉填充剂，填充料粒径5μm)；

[0113] 检测器：UV检测器；

[0114] 检测波长：280nm；

[0115] 柱温：30℃；

[0116] 流速：1mL/min；

[0117] 流动相：按体积比计算，正己烷：异戊醇：乙醇：二乙胺＝840:160:50:0.5。

[0118] 按外标法计算，(2S,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐样品中(2S,5S)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐含量为0.93％，(2R,5S)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐、(2R,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐未检出，且四个异构体能达到完全基线分离。

[0119] 由实施例1至实施例7的检测结果可知，在阿维巴坦钠关键中间体(2S,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐的检测过程中，适当对色谱条件的各参数，如流动相比例、流速、柱温等进行调整后，均能对关键中间体(2S,5R)-5-(苄氧氨基)-哌啶-2-甲酸苄酯草酸盐中手性异构体进行有效分离，且其检测结果均有效、准确。

[0120] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。