喙尾琵琶甲的活性防御液及其获取方法和应用

摘要

本发明提供了一种喙尾琵琶甲的活性防御液的获取方法，首先提供成虫喙尾琵琶甲活体；采用物理刺激所述成虫喙尾琵琶甲活体释放防御液；将所得防御液静置2～5min，所述防御液分为防御液上层和防御液下层，将上下层分离，得到的防御液下层为活性防御液。采用本发明提供的方法能够成功获取抑制肿瘤细胞增殖的活性防御液，且取样后喙尾琵琶甲依然存活，可继续饲养，1周后可以再次取样。实施例的实验结果表明，所述活性防御液能够抑制肿瘤细胞增殖，具有显著的细胞毒活性，能够进一步开发成为抗肿瘤药物。

权利要求

1.一种喙尾琵琶甲的活性防御液的获取方法，包括以下步骤：(1)提供成虫喙尾琵琶甲活体；

(2)采用物理刺激所述步骤(1)中的成虫喙尾琵琶甲活体释放防御液；

(3)将所述步骤(2)中所得防御液静置2～5min，所述防御液分为防御液上层和防御液下层，将上下层分离，得到的防御液下层为活性防御液；

所述分离采用毛细滴管、注射器或分液漏斗进行；

所述活性防御液包括2-甲基对苯醌和2-乙基对苯醌，所述活性防御液中2-甲基对苯醌和2-乙基对苯醌的总质量的百分含量≥50wt％。

2.根据权利要求1所述的获取方法，其特征在于，在进行所述步骤(2)中物理刺激前，将所述成虫喙尾琵琶甲活体饲养1～2天，喂食蔬菜碎和/或水果碎，饲养环境温度为18～25℃，湿度为40％～80％。

3.根据权利要求1所述的获取方法，其特征在于，所述步骤(2)具体是将所述步骤(1)中的成虫喙尾琵琶甲活体的尾部与收集容器的内壁接触，物理刺激所述成虫喙尾琵琶甲活体，所述成虫喙尾琵琶甲活体受到物理刺激由尾部腺体释放防御液，所述防御液沿收集容器的内壁自行流下。

4.根据权利要求1～3任一项所述的获取方法，其特征在于，所述步骤(2)中物理刺激是从背部抓取成虫喙尾琵琶甲活体，拇指和食指固定所述成虫喙尾琵琶甲活体的腹背部，将所述成虫喙尾琵琶甲活体的尾部碰触收集容器的内壁。

5.根据权利要求1所述的获取方法，其特征在于，所述步骤(3)中静置的时间为3min。

6.权利要求1～5任一项所述获取方法得到的喙尾琵琶甲的活性防御液，包括2-甲基对苯醌和2-乙基对苯醌，所述活性防御液中2-甲基对苯醌和2-乙基对苯醌的总质量的百分含量≥50wt％。

7.根据权利要求6所述的活性防御液，其特征在于，所述活性防御液中2-甲基对苯醌和

2-乙基对苯醌的总质量的百分含量为52～85wt％。

8.权利要求6或7所述活性防御液在制备抗肿瘤药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物为抗消化道肿瘤药物。

说明书

喙尾琵琶甲的活性防御液及其获取方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及昆虫防御液获取技术领域，尤其涉及喙尾琵琶甲的活性防御液及其获取方法和应用。

背景技术

[0002] 喙尾琵琶甲(Blaps rynchopetera Fairmaire)属鞘翅目(Coleoptera)拟步甲科(Tenebrionidae)琵琶甲属(Blaps)，俗名臭壳子，也叫臭屁虫、打屁虫，是云南彝族长期广泛使用的昆虫药物，具有清热解毒、活血化瘀、祛风定痛、软坚散结之功效，用于热证发烧、饮食积滞、小儿疳积、夜惊、乳癖、乳痰、积聚、风湿痹痛、牙龈肿痛、疮痒肿毒、湿疹、皮肤瘙痒等。在云南民间还常将喙尾琵琶甲应用于治疗咳嗽、胃炎、疔疮、肿瘤等疑难杂症。云南省滇中和滇西地区有多例采用臭壳子治愈多种癌症的病例报告，并有疗效确切地用于治疗肝癌、胃癌、直肠癌、膀胱癌、子宫颈癌、乳腺癌、食道癌等肿瘤之验方临床记录。据调查，彝族民间医生在治疗肿瘤、心血管及类风湿等疑难病症的处方中，80％以上都含有该昆虫药。

[0003] 现有技术中是通过剥离虫体分泌腺的方法收集喙尾琵琶甲防御液，但此法仅适用于获取少量防御液，且仅能取样一次。另一种方法则是用化学试剂(如乙醇或甲醇)刺激喙尾琵琶甲活体，使其分泌防御液于化学试剂中，去除所述化学试剂即得到防御性分泌物；然而，此法在去除化学试剂的过程中，会使防御液中部分挥发性大的组分流失，影响防御液的细胞毒活性。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一种喙尾琵琶甲的活性防御液及其获取方法和应用，采用本发明提供的方法能够成功获取抑制肿瘤细胞增殖的活性防御液，且取样后喙尾琵琶甲依然存活，可继续饲养，1周后可以再次取样。

[0005] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

[0006] 本发明提供了一种喙尾琵琶甲的活性防御液的获取方法，包括以下步骤：

[0007] (1)提供成虫喙尾琵琶甲活体；

[0008] (2)采用物理刺激所述步骤(1)中的成虫喙尾琵琶甲活体释放防御液；

[0009] (3)将所述步骤(2)中所得防御液静置2～5min，所述防御液分为防御液上层和防御液下层，将上下层分离，得到的防御液下层为活性防御液。

[0010] 优选的，在进行所述步骤(2)中物理刺激前，将所述成虫喙尾琵琶甲活体饲养1～2天，喂食切蔬菜碎和/或水果碎，饲养环境温度为18～25℃，湿度为40％～80％。

[0011] 优选的，所述步骤(2)中物理刺激是从背部抓取成虫喙尾琵琶甲活体，拇指和食指固定所述成虫喙尾琵琶甲活体的腹背部，将所述成虫喙尾琵琶甲活体的尾部碰触收集容器的内壁。

[0012] 优选的，所述步骤(3)中静置的时间为3min。

[0013] 优选的，所述步骤(3)中分离采用毛细滴管、注射器或分液漏斗进行。

[0014] 本发明提供了上述技术方案所述获取方法得到的喙尾琵琶甲的活性防御液，包括2-甲基对苯醌和2-乙基对苯醌，所述活性防御液中2-甲基对苯醌和2-乙基对苯醌的总质量的百分含量≥50wt％。

[0015] 优选的，所述活性防御液中2-甲基对苯醌和2-乙基对苯醌的总质量的百分含量为52～85wt％。

[0016] 本发明提供了上述技术方案所述活性防御液在制备抗肿瘤药物中的应用。

[0017] 优选的，所述抗肿瘤药物为抗消化道肿瘤药物。

[0018] 本发明提供了一种喙尾琵琶甲的活性防御液的获取方法，首先提供成虫喙尾琵琶甲活体；采用物理刺激所述成虫喙尾琵琶甲活体释放防御液；将所得防御液静置2～5min，所述防御液分为防御液上层和防御液下层，将上下层分离，得到的防御液下层为活性防御液。采用本发明提供的方法能够成功获取抑制肿瘤细胞增殖的活性防御液，且取样后喙尾琵琶甲依然存活，可继续饲养，1周后可以再次取样。实施例的实验结果表明，采用本发明提供的方法得到的活性防御液对AGS、Caco-2、HepG2、U251和Bel-7402的IC50分别为45.8±5.9、17.4±2.0、53.6±5.6、98.4±4.8和23.4±1.2，说明所述活性防御液能够抑制肿瘤细胞增殖，具有显著的细胞毒活性，能够进一步开发成为抗肿瘤药物。

附图说明

[0019] 图1为实施例1中样品C的GC-MS总粒子流图；

[0020] 图2为实施例1中样品A的GC-MS总粒子流图；

[0021] 图3为实施例1中样品B的GC-MS总粒子流图。

具体实施方式

[0022] 本发明提供了一种喙尾琵琶甲的活性防御液的获取方法，包括以下步骤：

[0023] (1)提供成虫喙尾琵琶甲活体；

[0024] (2)采用物理刺激所述步骤(1)中的成虫喙尾琵琶甲活体释放防御液；

[0025] (3)将所述步骤(2)中所得防御液静置2～5min，所述防御液分为防御液上层和防御液下层，将上下层分离，得到的防御液下层为活性防御液。

[0026] 本发明首先提供成虫喙尾琵琶甲活体。本发明对于所述成虫喙尾琵琶甲活体的来源没有特殊的限定，野外采集或直接从市场购买均可。

[0027] 得到成虫喙尾琵琶甲活体后，本发明采用物理刺激所述成虫喙尾琵琶甲活体释放防御液。本发明优选在进行所述物理刺激前，将所述成虫喙尾琵琶甲活体饲养1～2天，喂食切蔬菜碎和/或水果碎，饲养环境温度为18～25℃，湿度为40％～80％。本发明优选将所述成虫喙尾琵琶甲活体的尾部与收集容器的内壁接触，物理刺激所述成虫喙尾琵琶甲活体，所述成虫喙尾琵琶甲活体受到物理刺激由尾部腺体释放防御液，所述防御液沿收集容器的内壁自行流下。在本发明中，所述物理刺激优选是从背部抓取成虫喙尾琵琶甲活体，拇指和食指固定所述成虫喙尾琵琶甲活体的腹背部，将所述成虫喙尾琵琶甲活体的尾部碰触收集容器的内壁。本发明对于所述收集容器没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的容器即可，具体如离心试管；所述离心试管的直径优选为15mm，所收集的防御液的液面高度优选为所述离心试管高度的1/5。需要注意的是，所述防御液的挥发性强，若暴露于空气中，颜色逐渐加深，几个小时后，部分挥发，残留少量的固体状物质，所以，收集防御液的过程需要在避光条件下进行，且收集到的防御液需要避光低温保存，具体可以将收集到的防御液于棕色收集容器中在-10～4℃温度下保存。

[0028] 得到防御液后，本发明将所述防御液静置2～5min，所述防御液分为防御液上层和防御液下层，将上下层分离，得到的防御液下层为活性防御液。在本发明中，所述静置的时间优选为3min。在本发明中，所述分离优选采用毛细滴管、注射器或分液漏斗进行。

[0029] 成虫喙尾琵琶甲每只重约0.3～0.5g，每只成虫喙尾琵琶甲每次分泌的防御液约占其体重的0.5％，每公斤成虫喙尾琵琶甲，采用本发明提供的方法每次能收集防御液约5g，且取样后喙尾琵琶甲依然存活，通过再饲养可重复采样，防御液的得率可大大增加。

[0030] 本发明提供了上述技术方案所述获取方法得到的活性防御液，包括2-甲基对苯醌和2-乙基对苯醌，所述2-甲基对苯醌和2-乙基对苯醌的总质量占所述活性防御液的50wt％以上，优选为52～85wt％，更优选为54～80wt％，最优选为56～76wt％。

[0031] 在本发明中，所述活性防御液优选还包括1-十三烯、对苯醌和未知组分。在本发明中，所述活性防御液优选包括2-乙基对苯醌36～46wt％，2-甲基对苯醌20～30wt％，1-十三烯24～34wt％，余量的对苯醌和未知组分。在本发明中，所述活性防御液优选包括2-乙基对苯醌36～46wt％，更优选为38～44wt％，进一步优选为40～42wt％，最优选为41wt％。在本发明中，所述活性防御液优选包括2-甲基对苯醌20～30wt％，更优选为22～28wt％，进一步优选为24～26wt％，最优选为25wt％。在本发明中，所述活性防御液优选包括1-十三烯24～34wt％，更优选为26～32wt％，进一步优选为28～30wt％，最优选为29wt％。

[0032] 本发明提供了上述技术方案所述活性防御液在制备抗肿瘤药物中的应用。在本发明中，所述活性防御液优选占所述抗肿瘤药物的10.0～99.9wt％，更优选为25～85wt％，进一步优选为35～75wt％，最优选为45～65wt％。在本发明中，所述抗肿瘤药优选为抗消化道肿瘤药物；消化道肿瘤优选包括人胃腺癌细胞(AGS)、人结直肠腺癌细胞(caco-2)、人肝癌细胞(HepG2)、人胶质瘤细胞(U251)或人肝癌细胞(Bel-7402)。

[0033] 下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0034] 实施例1

[0035] (1)从市场购买成虫喙尾琵琶甲活体，置于具有光滑边缘的塑料盆内，底部铺垫一层干燥沙土，喂食切蔬菜碎和水果碎，饲养环境温度为20℃，湿度为50％，饲养两天；

[0036] (2)从背部抓取步骤(1)中的成虫喙尾琵琶甲活体，拇指和食指固定所述成虫喙尾琵琶甲活体的腹背部，将其尾部与直径15mm离心试管的内壁接触，其尾部受到收集容器的碰触刺激后，其尾部腺体释放防御液，所述防御液沿离心试管的内壁自行流下；

[0037] (3)当收集防御液的液面高度至离心试管高度的1/5处，静止3min，所述防御液分为防御液上层和防御液下层，采用毛细滴管分离所述防御液上层和防御液下层，得到的防御液下层为活性防御液。

[0038] 采用GC-MS对防御液的组成进行分析，其中，

[0039] 所述防御液上层为浅黄色透明状液体，记为样品A；

[0040] 所述防御液下层，即活性防御液，为棕色、略浑浊的液体，记为样品B；

[0041] 所述防御液，即不进行分离处理的防御液，记为样品C。

[0042] 分析条件：柱温在80℃解吸时保持1min，以5℃/min升至240℃，在240℃保持5min；使用氦气作为载气，流速为0.9mL/min；以电子碰撞(EI)模式操作，扫描范围为40-400amu，电离能为70eV，扫描速度为0.2秒/扫描；传输线温度为280℃，电离源温度为230℃。

[0043] 样品C经GC-MS分析后得到11个主要色谱峰，通过与数据库NIST标准图谱匹配，鉴定了其中4个主峰，共占总峰面积的82.9％。其中，含量最高的3个化合物为2-乙基对苯醌(31.0％)，1-十三烯(28.0％)和2-甲基对苯醌(22.9％)，结果见图1和表1。

[0044] 表1通过GC-MS从样品C中鉴定的主要化合物

[0045]

[0046] 对样品A和样品B分别进行了GC-MS分析，发现其组分含量有很大不同。样品A中主峰只有一个，数据库比对鉴定结果为1-十三烯，占其总峰面积90％以上，结果见图2和表2；样品B中，两个取代苯醌化合物(2-甲基对苯醌和2-乙基对苯醌)的含量较高，超过60％，1-十三烯的含量明显减少，结果见图3和表3。

[0047] 表2通过GC-MS从样品A中鉴定的主要化合物

[0048]

[0049] 表3通过GC-MS从样品B中鉴定的主要化合物

[0050]

[0051] 实施例2

[0052] 将本发明实施例1得到的样品A、样品B和样品C进行抗肿瘤活性测试。

[0053] 1、实验试剂

[0054] (1)噻唑蓝(MTT)溶液的配制

[0055] 精确称取250mg噻唑蓝粉末与50mL磷酸盐缓冲液(PBS)混合，得到5mg/mL的噻唑蓝溶液，避光保存。

[0056] (2)三联液的配制

[0057] 称取十二烷基硫酸钠(SDS)粉末50g，质量浓度为37％的盐酸0.5mL及异丁醇25mL，用三蒸水稀释后磁力搅拌混匀，混匀后将所得液体转移至500mL容量瓶中，定容至500mL，再次混匀，将配制好的三联液转移至蓝盖玻璃瓶内，常温保存。

[0058] (3)阳性药物溶液和受试药物溶液的配制

[0059] 用PBS将顺铂(阳性药物)粉剂、实施例1得到的样品A、样品B和样品C(样品A、样品B和样品C为受试药物)分别配制为50mg/mL的母液于-20℃闭光保存；实验时用PBS将母液倍比稀释为0.01mg/mL、0.03mg/mL、0.1mg/mL、0.3mg/mL、1mg/mL五个浓度，分别得到对应浓度的阳性药物溶液和受试药物溶液。

[0060] 2、MTT测试

[0061] (1)种板：将肿瘤细胞消化后离心，弃去上清液，向剩余部分中加入新鲜培养基得到细胞悬液，吸取10μL细胞悬液，将其与等体积的台盼蓝混合，使用细胞计数板计数后，调5
整细胞浓度为(1～3)×10个/mL；设置五个浓度梯度，每个浓度设置三个复孔。

[0062] (2)给药：种板后将96孔板置于CO2培养箱中培养24h后，每孔加入对应浓度的阳性药物溶液和受试药物溶液10μL(浓度分别为0.01mg/mL、0.03mg/mL、0.1mg/mL、0.3mg/mL、1mg/mL)。

[0063] (3)测板：给药后培养48h，加入MTT溶液15μL/孔；4h后加入三联液150μL/孔，16h后用酶标仪在490nm下测定各孔的OD值。

[0064] 3、数据处理与测试结果

[0065] 用下述公式计算细胞增殖抑制率，根据细胞增殖抑制率与相应的浓度梯度，用SPSS17.0计算阳性药物和各受试药物的IC50值，结果如表4所示

[0066] 细胞增殖抑制率(％)＝(阴性对照组OD值-受试组OD值)/(阴性对照组OD值-空白对照组OD值)×100％，其中，阴性对照组是指加入MTT和三联液但未加任何阳性药物和受试药物的PBS溶液，空白对照组是指未加MTT、三联液、阳性药物和受试药物的PBS溶液。

[0067] 表4阳性药物及受试药物抑制肿瘤细胞生长的IC50值

[0068]

[0069] 注：AGS：人胃腺癌细胞；caco-2：人结直肠腺癌细胞；HepG2：人肝癌细胞；U251：人胶质瘤细胞；Bel-7402：人肝癌细胞。

[0070] 根据表4结果可知，样品B(活性防御液，即喙尾琵琶甲防御液下层)具有细胞毒活性，能够进一步开发成为抗肿瘤药物。

[0071] 由以上实施例可知，采用本发明提供的方法能够成功获取抑制肿瘤细胞增殖的活性防御液，且获取方法简单，可操作性强。

[0072] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。