琥珀酸酐类化合物、与其相关的基因和蛋白及其制备方法转让专利
申请号 : CN201711175710.8
文献号 : CN107903227B
文献日 : 2021-03-30
发明人 : 牛雪梅 , 杨晓钰 , 陈月桂 , 张克勤
申请人 : 云南大学
摘要 :
权利要求 :
1.一种制备分子式如结构式I所示的琥珀酸酐类化合物的方法,所述方法包括发酵含有编码I型PKS/NRPS酶的基因,以及含有编码ER酶的基因的异源生物,得到发酵液;通过在异源生物中表达I型PKS/NRPS酶和ER酶来合成所述的琥珀酸酐类化合物;其中,所述I型PKS/NRPS酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示;
所述ER酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示;
2.根据权利要求1的方法,其特征在于,编码所述I型PKS/NRPS酶的基因连接在能够用于所述异源生物的第一表达载体上;编码所述ER酶的基因连接在能够用于所述异源生物的第二表达载体上;所述第一表达载体与所述第二表达载体不相同。
3.根据权利要求2的方法,其特征在于,所述第一表达载体在连接上所述I型PKS/NRPS酶的基因之前选自pGADT7或pGBKT7。
4.根据权利要求2的方法,其特征在于,所述第二表达载体在连接上所述ER酶的基因之前选自pGADT7或pGBKT7。
5.根据权利要求1的方法,其特征在于,编码所述I型PKS/NRPS酶的基因具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列;和/或编码所述ER酶的基因具有如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述异源生物为酵母菌(Saccharomyces)。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述异源生物为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:
1)将所述I型PKS/NRPS酶的基因连接到pGADT7载体上,得到第一表达载体;
2)将所述ER酶的基因连接到pGBKT7上,得到第二表达载:
3)将所述第一表达载体和第二表达载体共同转化至酿酒酵母中,获得工程菌株;
4)将所述工程菌株接种至酿酒酵母的液体培养基,在30±2℃ 200±50rpm培养10‑14小时;按照2%‑10%的接种率扩大培养,在30±2℃ 200±50rpm的条件下发酵4‑6天,得到发酵液。
9.根据权利要求1‑8中任意一项所述的方法,其特征在于,所述方法还包括从发酵液中分离提纯得到所述的琥珀酸酐类化合物的步骤。
10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于,分离提纯的步骤如下:a)将所述发酵液浓缩,得到浓缩物;
b)将所述浓缩物与丙酮水溶液混合并进行超声处理,减压浓缩后得到粗提物;
c)所述粗提物与丙酮混合并进行超声处理,减压浓缩后得到褐色的油状丙酮提取浸膏;
d)所述丙酮提取浸膏用凝胶柱色谱分离,过程中的流出液最多每7ml更换一次接样瓶,将接样瓶中组分相同的流出液样品混合,得到凝胶柱色谱分离液;然后对所述凝胶柱色谱分离液进行柱层析,过程中的流出液最多每7ml更换一次接样瓶,将接样瓶中组分相同的流出液样品混合,得到柱层析分离液;然后对所述柱层析分离液进行硅胶柱层析分离,得到橘色粉末状化合物,所述橘色粉末状化合物即为所述的琥珀酸酐类化合物。
11.根据权利要求9所述的方法,其特征在于,分离提纯的步骤如下:a)将所述发酵液旋转蒸发浓缩,得到浓缩物;
b)将所述浓缩物与65‑75%的丙酮水溶液混合并在80‑120KHz下超声处理2‑5次,每次
10‑30min,减压浓缩后得到粗提物;
c)所述粗提物与丙酮混合并在80‑120KHz下超声处理2‑5次,每次30‑80min超声处理,减压浓缩后得到褐色的油状丙酮提取浸膏;
d)所述丙酮提取浸膏在流动性为甲醇的条件下进行Sephadex LH‑20凝胶柱色谱分离,过程中的流出液最多每5ml更换一次接样瓶,将接样瓶中TLC检测RF值为0.35‑0.45的流出液样品混合,得到凝胶柱分离液;然后在流动性为5%‑15%甲醇水溶液的条件下对所述凝胶柱分离液进行中压RP18柱层析,过程中的流出液最多每5ml更换一次接样瓶,将接样瓶中TLC检测RF值为0.35‑0.45的流出液样品混合,得到柱层析分离液;接着对所述柱层析分离液在以体积比为11‑9:1的氯仿和丙酮的混合液作为流动性的条件下进行硅胶柱色谱分离,得到橘色粉末状化合物,所述橘色粉末状化合物即为所述的琥珀酸酐类化合物。
12.一种ER酶,所述ER酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
13.一种能够编码如权利要求12所述的ER酶的基因。
14.根据权利要求13所述的基因,其特征在于,所述基因具有如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。
15.根据权利要求12所述的ER酶,或权利要求13或14所述的基因在制备如权利要求1至
11中任意一项所述方法中的所述的琥珀酸酐类化合物中的应用。
说明书 :
琥珀酸酐类化合物、与其相关的基因和蛋白及其制备方法
技术领域
背景技术
等。琥珀酸酐类化合物的下游产品涵盖了N‑羟基丁二酰亚胺、丁二酸单乙酯酰氯、红霉素琥
珀酸乙酯、芬布芬、青蒿琥酯、恶丙嗪、曲匹布通等重要产品;同时,琥珀酸酐能与其他化合
物组装,提升药物的活性等,表明琥珀酸酐类化合物为重要产品的合成前体和原料。
发明内容
少一种中作为前体,用于制造玻璃纤维增强塑料,作为食品添加剂,以及提高药物活性中的
应用。
酵液;通过在异源生物中表达I型PKS/NRPS酶和ER酶来合成如本申请之一所述的琥珀酸酐
类化合物;其中,所述I型PKS/NRPS酶具有如下(I)或(II)的氨基酸序列:(I)来源于嗜热属
(Thermomyces)的I型PKS/NRPS酶的氨基酸序列,优选地,如SEQ ID No.1所示的氨基酸序
列;(II)与(I)中的氨基酸序列的一致性在95%以上,且与(I)中的氨基酸序列具有相同功
能的氨基酸序列;优选其氨基酸序列为与(I)中的氨基酸序列的一致性在99%以上,且与
(I)中的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列;所述ER酶具有如下(III)或(IV)的氨基酸
序列:(III)来源于嗜热属(Thermomyces)的ER酶的氨基酸序列,优选地,如SEQ ID No.2所
示的氨基酸序列;(IV)与(III)中的氨基酸序列的一致性在95%以上,且与(III)中的氨基
酸序列具有相同功能的氨基酸序列;优选其氨基酸序列为与(III)中的氨基酸序列的一致
性在99%以上,且与(III)中的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。其中所述的异源生
物的表述是相对于I型PKS/NRPS酶或ER酶的来源生物而言的。如SEQ ID No.1所示的氨基酸
序列和如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列来源于嗜热踝节菌Thermomyces dupontii
(Talaromyces thermophilus NRRL 2155,该菌株保存时该菌株名为Talaromyces
thermophilus,2014年后国际真菌分类学将此菌株改为Thermomyces dupontii,见文献
Thermophilic fungi in the new age of fungal taxonomy,Extremophiles,DOI:
10.1007/s00792‑014‑0707‑0,https://www.researchgate.net/publication/
268392182),而表达这两个基因的生物可以是异源生物酵母。
载体上;所述第一表达载体与所述第二表达载体不相同。
NRPS基因由如下方法得到:通过柱式法提取T.dupontii NRRL 2155基因组,操作方法按照
天根植物提取试剂盒使用说明。将PKS/NRPS基因分为三段(每段约4000bp),设计引物进行
PCR,通过酵母同源重组的方法连在捕获质粒pRS426上,得到含有目的基因的载体pRS426‑
Talth1_004980‑t1,通过测序确证目的基因正确无突变;或者也可以分段人工合成得到。ER
基因如下方法得到:通过柱式法提取T.dupontii NRRL 2155基因组,操作方法按照天根植
物提取试剂盒使用说明。设计引物进行PCR并纯化片段进行测序,通过测序确证目的基因正
确无突变;或者也可以人工合成得到。
(例如12小时);按照2%‑10%的接种率扩大培养,在30±2℃ 200±50rpm的条件下发酵4‑6
天,得到发酵液。
色谱分离液进行柱层析,过程中的流出液最多每7ml更换一次接样瓶,将接样瓶中组分相同
的流出液样品混合,得到柱层析分离液;然后对所述柱层析分离液进行硅胶柱层析分离,得
到橘色粉末状化合物,所述橘色粉末状化合物即为如本申请之一所述的琥珀酸酐类化合
物;
流出液样品混合,得到凝胶柱分离液;然后在流动性为5%‑15%甲醇水溶液的条件下对所
述凝胶柱分离液进行中压RP18柱层析,过程中的流出液最多每5ml更换一次接样瓶,将接样
瓶中TLC检测RF值为0.35‑0.45的流出液样品混合,得到柱层析分离液,接着对所述柱层析
分离液在以体积比为11‑9:1的氯仿和丙酮的混合液作为流动性的条件下进行硅胶柱层析
分离,得到橘色粉末状化合物,所述橘色粉末状化合物即为如本申请之一所述的琥珀酸酐
类化合物。
的流出液样品混合,得到凝胶柱分离液,然后在流动性为5%‑15%甲醇水溶液的条件下对
所述凝胶柱分离液进行中压RP18柱层析,过程中的流出液每4ml至5ml更换一次接样瓶,将
接样瓶中TLC检测RF值为0.35‑0.45的流出液样品混合,得到柱层析分离液,接着对所述柱
层析分离液在以体积比为11‑9:1的氯仿和丙酮的混合液作为流动性的条件下进行硅胶柱
层析分离,得到橘色粉末状化合物,所述橘色粉末状化合物即为如本申请之一所述的琥珀
酸酐类化合物。
99.5%以上,且与(III)中的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。
因参与产生含有伯氨的琥珀酸酐类化合物的新功能,以及琥珀酸酐类化合物可以通过在酵
母异源表达高温真菌中的I型PKS/NRPS酶和ER酶来合成制备的新方法。该生物合成制备方
法具有污染小、安全可靠以及发酵周期短等方面的优点。
附图说明
具体实施方式
菌丝,加入液氮充分研磨至菌体呈粉末状;基因组的提取方法参照天根植物基因组提取试
剂盒说明书。将编码总长为11844bp的PKS/NRPS基因Talth1_004980‑t1(如SEQ ID No.3所
示,其编码如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列)分为3段(每段约4000bp)设计引物进行PCR,
其中第一对引物为PKS/NRPS‑F1(如SEQ ID No.5所示)和PKS/NRPS‑R1(如SEQ ID No.6所
示),第二对引物为PKS/NRPS‑F2(如SEQ ID No.7所示)和PKS/NRPS‑R2(如SEQ ID No.8所
示),第三对引物为PKS/NRPS‑F3(如SEQ ID No.9所示)和PKS/NRPS‑R3(如SEQ ID No.10所
示)。PCR体系为50μL:5×PrimeSTAR GXL Buffer10μL,dNTP Mixture(各2.5mM)4μL,
PrimerF 1μL,PrimerR 1μL,模板1μL,PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 1μL,ddH2O 32μL。
PCR仪为eppendorf生产,PCR反应温度为:98℃ 2min,98℃ 10sec,55℃ 15sec,68℃ 4min
共计35个循环,68℃ 5min。PCR产物分别%的琼脂糖凝胶电泳,可见3个约4000bp的PCR产物
(见图1)。最后通过酵母的同源重组将3个片段依次连接到质粒pRS426上,得到含有完整目
的片段的pRS426‑Talth1_004980‑t1质粒。
L,PrimerR 0.5μL,模板0.5μL,PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 2μL,ddH2O32.5μL;
2.Talth1_004946_t1:5×PrimeSTAR GXL Buffer 10μL,dNTP Mixture(各2.5mM)4μL,
PrimerF 1μL,PrimerR 1μL,模板1μL,PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 1μL,ddH2O 32μL。
PCR反应温度为:1.Talth1_004980‑t1:98℃ 2min,98℃ 10sec,55℃ 15sec,68℃ 3min共
计35个循环,68℃ 10min;2.Talth1_004946_t1:98℃ 2min,98℃ 10sec,55℃ 15sec,68℃
1min共计35个循环,68℃ 5min。
的infusion酶分别与经过EcoRI和BamHI双酶切的酵母表达载体pGADT7、pGBKT7相连,构建
表达载体pGADT7‑Talth1_004980‑t1与pGBKT7‑Talth1_004946_t1。并测序检测基因序列的
正确性。
上,30℃倒置培养2‑4天。随机挑去转化子于5mL液体SD/‑Leu/‑Trp培养基中扩大培养并提
取质粒进行PCR验证,并选取PCR验证为阳性的转化子进行测序验证。结果表明,表达载体
pGADT7‑Talth1_004980‑t1与pGBKT7‑Talth1_004946_t1成功转化至酿酒酵母FY834中。
率扩大培养,30℃ 200rpm发酵5天。
产物用70%丙酮/水室温100KHz超声提取2次,每次20min,减压浓缩得70%丙酮/水粗提物;
粗提物用纯丙酮100KHz超声提取两次,每次60min,减压浓缩得到褐色油状丙酮提取物浸
膏;将样品组与对照组用TLC检测,10%的浓硫酸乙醇溶液进行显色,在样品组中得到一个
与对照组存在差异的粉色点。丙酮提取物浸膏经凝胶柱色谱(Sephadex LH‑20,甲醇为流动
相冲洗),每5ml流出液更换一次接样瓶,并用TLC检测流出液成分,将组分相同的样品进行
合并;随后通过中压RP18柱层析(5%‑15%甲醇/水为流动相梯度洗脱),TLC检测流出液成
分,合并相同组分;之后合并组份利用硅胶柱层析(氯仿‑丙酮10:1)为流动相,得到粉末状
化合物。经过对一位核磁共振谱、二维核磁共振谱以及质谱的分析,鉴定化合物为一个新型
的琥珀酸酐含氨基衍生物,结构如下:
子ESI‑MS质谱:实测值为158.0817[M+H] ,计算值为158.0821(for C7H12NO3)。氢谱和碳谱数
据(其溶解溶剂为CD3COCD3,400MHz,δ:ppm):碳谱为:175.4(s,C‑1),76.9(s,C‑2),40.6(t,
C‑3),172.0(s,C‑4),35.2(d,C‑5),16.5(q,C‑6),15.7(q,C‑7);氢谱为2.90和2.73(3‑H2,
d,19.2Hz),1.96(H‑5,m),0.99(7‑H3,d,7.1Hz),0.91(6‑H3,d,7.1Hz)。