早期胃癌切除标本的癌旁胶原组织评价方法

摘要

本发明提供了一种早期胃癌切除标本的癌旁胶原组织评价方法，涉及病理鉴别技术领域。本发明提供的早期胃癌切除标本的癌旁胶原组织评价方法通过染色切片结合多光子成像分析技术对早期胃癌癌旁胶原的多光子成像的形态学特征和纹理特征进行分析评价，及时发现早期胃癌肿瘤旁胶原变化情况，有助于临床工作者了解患者是否存在淋巴结转移的风险，从而为临床医生在术式选择及后续诊疗中提供参考，为患者提供更具个性化治疗方案，最终达到提高患者的生活质量，降低肿瘤复发的概率的目的。本发明设计合理，技术成熟，简便易行，具有广阔的临床应用前景和良好的科研推广价值。

权利要求

1.一种早期胃癌切除标本的癌旁胶原组织评价方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(a)样本准备：在早期胃癌标本的病变癌旁处连续切取3张厚度为3～8μm组织切片进行常规蜡块制备，取1张进行苏木精-伊红染色，另1张进行病理学Masson染色，剩余1张放置于-86℃冰箱进行冷藏保存，作为待测多光子成像切片；

(b)标注成像区域：在普通光学显微镜下对苏木精-伊红染色切片和Masson染色切片中符合早期胃癌癌旁胶原的区域进行观察，并与步骤(a)待测多光子成像切片进行对比，在待测多光子成像切片上标注对应区域，得到标注成像区域；

(c)多光子胶原成像：对步骤(b)待测多光子成像切片的标注成像区域的胶原信号进行自体荧光和二次谐波成像，得到多光子胶原成像图；

所述自体荧光和二次谐波成像为利用双通道探测器进行成像，双通道探测器的输出功率为2.0W～2.5W，成像激发波长为800～820nm，自体荧光信号通道的接收波长为430～

708nm，二次谐波信号通道的接收波长为387nm～409nm，所述成像倍数为20倍，成像面积为

400μm×400μm；

(d)成像分析：将步骤(c)得到的多光子成像图片导入图像分析系统，提取图像的形态学特征与纹理特征，进行胶原层面分析；

所述多光子成像图片的形态学特征包括：平均胶原纤维数量、胶原纤维数量标准差、平均胶原纤维交联指数、胶原纤维交联指数标准差、平均胶原纤维长度、胶原纤维长度标准差、平均胶原纤维宽度、胶原纤维宽度标准差、平均胶原垂直度、胶原垂直度标准差、平均胶原交联密度、胶原交联密度标准差、平均胶原弯曲度以及胶原弯曲度标准差；

所述多光子成像图片的纹理特征包括：由图像生成的灰度共生矩阵元素值的平方和、灰度共生矩阵在空间的相似程度、图像纹理的非均匀程度或复杂程度以及纹理的粗细。

说明书

早期胃癌切除标本的癌旁胶原组织评价方法

技术领域

[0001] 本发明涉及病理鉴别技术领域，尤其是涉及一种早期胃癌切除标本的癌旁胶原组织评价方法。

背景技术

[0002] 根据胃癌分类标准的定义，早期胃癌是指肿瘤细胞的侵犯局限在胃粘膜层或者粘膜下层，不论是否存在淋巴结转移。近年来，虽然在全世界范围内胃癌的整体发病率有所下降，但是早期胃癌的发病率却逐年升高。目前早期胃癌的治疗方式主要包括外科手术，即全胃或远端胃切除+淋巴结清扫，和内镜粘膜下切除术(ESD)。随着内镜技术的广泛应用，ESD已经逐渐替代外科手术，成为治疗早期胃癌的主流方式。

[0003] 但是，目前早期胃癌患者中仍有约15％的病人存在淋巴结转移，肿瘤细胞淋巴结转移是早期胃癌患者行ESD的主要禁忌症，使得临床医生在做临床决策时更倾向于让早期胃癌患者接受外科手术，这一方面使无淋巴结转移的早期胃癌患者面临更大的手术风险，另一方面也降低了患者的生活质量。

[0004] 研究显示，癌旁胶原的变化与胃癌淋巴结转移息息相关，及时发现癌旁胶原变化能对临床诊疗提供帮助，使存在淋巴结转移患者能接受手术治疗，降低后期复发风险，同时也使不存在淋巴结转移的病人通过内镜下治疗从而避免外科手术带来的风险，提高生活质量。

[0005] 因此，研究开发出一种可以对早期胃癌切除标本的癌旁胶原组织的微观结构进行观察评价的方法，进而能够快速、高效地反应癌旁胶原的变化情况，对临床医生判断患者是否存在淋巴结转移的评估提供参考，从而更好地选择治疗手段，在指导个性化诊疗方面具有重要意义。

[0006] 有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

[0007] 本发明的第一目的在于提供一种早期胃癌切除标本的癌旁胶原组织评价方法，上述方法通过染色切片结合多光子成像分析技术对早期胃癌切除标本的癌旁胶原进行组织评价，能够快速、高效地反应癌旁胶原的变化情况，有助于临床工作者了解患者是否存在淋巴结转移的风险。

[0008] 本发明提供的一种早期胃癌切除标本的癌旁胶原组织评价方法，所述方法包括以下步骤：

[0009] (a)样本准备：在早期胃癌标本的病变癌旁处连续切取3张组织切片进行常规蜡块制备，取1张进行苏木精-伊红染色，另1张进行病理学Masson染色，剩余1张进行冷藏保存，作为待测多光子成像切片；

[0010] (b)标注成像区域：在普通光学显微镜下对苏木精-伊红染色切片和Masson染色切片中符合早期胃癌癌旁胶原的区域进行观察，并与步骤(a)待测多光子成像切片进行对比，在待测多光子成像切片上标注对应区域，得到标注成像区域；

[0011] (c)多光子胶原成像：对步骤(b)待测多光子成像切片的标注成像区域的胶原信号进行自体荧光和二次谐波成像，得到多光子胶原成像图。

[0012] 进一步的，所述方法还任选的包括步骤(d)成像分析：将步骤(c)得到的多光子成像图片导入图像分析系统，提取图像的形态学特征与纹理特征，进行胶原层面分析。

[0013] 进一步的，所述步骤(a)中组织切片的厚度为3～8μm。

[0014] 进一步的，所述步骤(a)中冷藏保存为-86℃冰箱保存。

[0015] 进一步的，所述步骤(c)自体荧光和二次谐波成像为利用双通道探测器进行成像。

[0016] 更进一步的，所述步骤(c)双通道探测器的输出功率为2.0W～2.5W。

[0017] 更进一步的，所述步骤(c)自体荧光和二次谐波成像的成像激发波长为800～820nm，自体荧光信号通道的接收波长为430～708nm，二次谐波信号通道的接收波长为
387nm～409nm。

[0018] 进一步的，所述步骤(c)自体荧光和二次谐波成像的成像倍数为20倍，成像面积为400μm×400μm。

[0019] 进一步的，所述步骤(d)多光子成像图像的形态学特征包括：平均胶原纤维数量、胶原纤维数量标准差、平均胶原纤维交联指数、胶原纤维交联指数标准差、平均胶原纤维长度、胶原纤维长度标准差、平均胶原纤维宽度、胶原纤维宽度标准差、平均胶原垂直度、胶原垂直度标准差、平均胶原交联密度、胶原交联密度标准差、平均胶原弯曲度以及胶原弯曲度标准差。

[0020] 进一步的，所述步骤(d)多光子成像图像的纹理特征包括：由图像生成的灰度共生矩阵元素值的平方和、灰度共生矩阵在空间的相似程度、图像纹理的非均匀程度或复杂程度以及纹理的粗细。

[0021] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：

[0022] 本发明提供一种早期胃癌切除标本的癌旁胶原组织评价方法，上述方法通过染色切片结合多光子成像分析技术对早期胃癌癌旁胶原的多光子成像进行包括形态学特征和纹理特征进行分析评价，及时发现早期胃癌肿瘤旁胶原变化情况，有助于临床工作者了解患者是否存在淋巴结转移的风险，从而为临床医生在术式选择及后续诊疗中提供参考，为患者提供更具个性化治疗方案，最终达到提高患者的生活质量，降低肿瘤复发的概率的目的。本发明设计合理，技术成熟，简便易行，具有广阔的临床应用前景和良好的科研推广价值。

附图说明

[0023] 为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0024] 图1为本发明实施例1提供的早期胃癌切除标本的癌旁胶原组织评价方法流程图；

[0025] 图2为本发明效果例1提供的传统方法测得的胶原含量较多的癌旁胶原标本的多光子胶原成像图；

[0026] 图3为本发明效果例1提供的传统方法测得的胶原含量较少的癌旁胶原标本的多光子胶原成像图。

具体实施方式

[0027] 下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0028] 根据本发明的一个方面，一种早期胃癌切除标本的癌旁胶原组织评价方法，所述方法包括以下步骤：

[0029] (a)样本准备：在早期胃癌标本的病变癌旁处连续切取3张组织切片进行常规蜡块制备，取1张进行苏木精-伊红染色，另1张进行病理学Masson染色，剩余1张进行冷藏保存，作为待测多光子成像切片；

[0030] (b)标注成像区域：在普通光学显微镜下对苏木精-伊红染色切片和Masson染色切片中符合早期胃癌癌旁胶原的区域进行观察，并与步骤(a)待测多光子成像切片进行对比，在待测多光子成像切片上标注对应区域，得到标注成像区域；

[0031] (c)多光子胶原成像：对步骤(b)待测多光子成像切片的标注成像区域的胶原信号进行自体荧光和二次谐波成像，得到多光子胶原成像图，随后进行直观成像分析。

[0032] 本发明中，早期胃癌切除标本的癌旁胶原组织评价方法，通过染色切片结合多光子成像分析技术对早期胃癌癌旁胶原的多光子成像进行包括形态学特征和纹理特征进行分析评价。上述多光子成像是一种基于非线性光学和飞秒激光镭射之上的多光子显微成像技术，通过利用活体组织中细胞自身产生的自体荧光及非中心对称组织(如胶原)产生的二次谐波进行成像，该方法无需传统病理活检的组织切取、固定、包埋、切片、染色等步骤，便可实时快速地观察到标本的组织结构和细胞形态的目的，其具有穿透力强、光损伤小、分辨率高等优点能对石蜡切片、新鲜离体组织以及活体组织都可以清晰成像。因此，本发明将多光子成像技术应用于早期胃癌切除标本的癌旁胶原组织评价具有广阔的应用前景和科研推广价值。

[0033] 本发明早期胃癌切除标本的癌旁胶原组织评价方法，有助于临床工作者及时发现早期胃癌肿瘤旁胶原变化情况，了解患者是否存在淋巴结转移的风险，从而为临床医生在术式选择及后续诊疗中提供参考，为患者提供更具个性化治疗方案，最终达到提高患者的生活质量，降低肿瘤复发的概率的目的。

[0034] 在本发明的一种优选实施方式中，所述方法还任选的包括步骤(d)成像分析：将步骤(c)得到的多光子成像图片导入图像分析系统，提取图像的形态学特征与纹理特征，进行胶原层面分析。

[0035] 在本发明的一种优选实施方式中，所述步骤(a)中组织切片的厚度为3～8μm。

[0036] 作为一种优选的实施方式，上述步骤(a)中组织切片的厚度为3～8μm更利于光学电镜以及多光子成像的观察。

[0037] 在本发明的一种优选实施方式中，所述步骤(a)中冷藏保存为-86℃冰箱保存。

[0038] 作为一种优选的实施方式，上述步骤(a)中冷藏保存为在-86℃冰箱中保存，可以使组织切片保持更好的安全性、均匀性和稳定性，进而使多光子成像达到更好的技术效果。

[0039] 在本发明的一种优选实施方式中，所述步骤(c)自体荧光和二次谐波成像为利用双通道探测器进行成像。

[0040] 在上述优选实施方式中，所述步骤(c)双通道探测器的输出功率为2.0W～2.5W，成像激发波长为800～820nm，自体荧光信号通道的接收波长为430～708nm，二次谐波信号通道的接收波长为387nm～409nm。

[0041] 作为一种优选的实施方式，本发明根据早期胃癌切除标本的癌旁胶原制得的待测切片的特点，采用特定激发波长和接受波长对多光子成像切片进行成像，可以得到更为清晰准确的二次谐波图像。

[0042] 在本发明的一种优选实施方式中，所述步骤(c)自体荧光和二次谐波成像的成像倍数为20倍，成像面积为400μm×400μm。

[0043] 优选的，本发明早期胃癌切除标本的癌旁胶原组织评价方法，所述方法包括以下步骤：

[0044] (a)样本准备：在早期胃癌标本的病变癌旁处连续切取3张厚度为3～8μm组织切片进行常规蜡块制备，取1张进行苏木精-伊红染色，另1张进行病理学Masson染色，剩余1张放置于-86℃冰箱进行冷藏保存，作为待测多光子成像切片；

[0045] (b)标注成像区域：在普通光学显微镜下对苏木精-伊红染色切片和Masson染色切片中符合早期胃癌癌旁胶原的区域进行观察，并与步骤(a)待测多光子成像切片进行对比，在待测多光子成像切片上标注对应区域，得到标注成像区域；

[0046] (c)多光子胶原成像：对步骤(b)待测多光子成像切片的标注成像区域的胶原信号进行自体荧光和二次谐波成像，得到多光子胶原成像图，所述双通道探测器的输出功率为2.0W～2.5W，成像激发波长为800～820nm，自体荧光信号通道的接收波长为430～708nm，二次谐波信号通道的接收波长为387nm～409nm，所述成像倍数为20倍，成像面积为400μm×
400μm；

[0047] 任选的(d)成像分析：将步骤(c)得到的多光子成像图片导入图像分析系统，提取图像的形态学特征与纹理特征，进行胶原层面分析。

[0048] 在本发明的一种优选实施方式中，所述步骤(d)多光子成像图像的形态学特征包括：平均胶原纤维数量、胶原纤维数量标准差、平均胶原纤维交联指数、胶原纤维交联指数标准差、平均胶原纤维长度、胶原纤维长度标准差、平均胶原纤维宽度、胶原纤维宽度标准差、平均胶原垂直度、胶原垂直度标准差、平均胶原交联密度、胶原交联密度标准差、平均胶原弯曲度以及胶原弯曲度标准差。

[0049] 在本发明的一种优选实施方式中，所述步骤(d)多光子成像图像的纹理特征包括：由图像生成的灰度共生矩阵元素值的平方和、灰度共生矩阵在空间的相似程度、图像纹理的非均匀程度或复杂程度以及纹理的粗细。

[0050] 实施例1

[0051] 如图1所示，一种早期胃癌切除标本的癌旁胶原组织评价方法，所述方法包括以下步骤：

[0052] (a)样本准备：在早期胃癌标本的病变癌旁处连续切取3张厚度为3μm组织切片进行常规蜡块制备，取1张进行苏木精-伊红染色，另1张进行病理学Masson染色，剩余1张放置于-86℃冰箱进行冷藏保存，作为待测多光子成像切片；

[0053] (b)标注成像区域：在普通光学显微镜下对苏木精-伊红染色切片和Masson染色切片中符合早期胃癌癌旁胶原的区域进行观察，并与步骤(a)待测多光子成像切片进行对比，在待测多光子成像切片上标注对应区域，得到标注成像区域；

[0054] (c)多光子胶原成像：对步骤(b)待测多光子成像切片的标注成像区域的胶原信号进行自体荧光和二次谐波成像，得到多光子胶原成像图，所述双通道探测器的输出功率为2.0W，成像激发波长为800nm，自体荧光信号通道的接收波长为430nm，二次谐波信号通道的接收波长为387nm，所述成像倍数为20倍，成像面积为400μm×400μm；

[0055] (d)成像分析：将步骤(c)得到的多光子成像图片导入图像分析系统，提取图像的形态学特征与纹理特征，进行胶原层面分析。

[0056] 实施例2

[0057] 一种早期胃癌切除标本的癌旁胶原组织评价方法，所述方法包括以下步骤：

[0058] (a)样本准备：在早期胃癌标本的病变癌旁处连续切取3张厚度为8μm组织切片进行常规蜡块制备，取1张进行苏木精-伊红染色，另1张进行病理学Masson染色，剩余1张放置于-86℃冰箱进行冷藏保存，作为待测多光子成像切片；

[0059] (b)标注成像区域：在普通光学显微镜下对苏木精-伊红染色切片和Masson染色切片中符合早期胃癌癌旁胶原的区域进行观察，并与步骤(a)待测多光子成像切片进行对比，在待测多光子成像切片上标注对应区域，得到标注成像区域；

[0060] (c)多光子胶原成像：对步骤(b)待测多光子成像切片的标注成像区域的胶原信号进行自体荧光和二次谐波成像，得到多光子胶原成像图，所述双通道探测器的输出功率为2.5W，成像激发波长为820nm，自体荧光信号通道的接收波长为708nm，二次谐波信号通道的接收波长为409nm，所述成像倍数为20倍，成像面积为400μm×400μm；

[0061] (d)成像分析：将步骤(c)得到的多光子成像图片导入图像分析系统，提取图像的形态学特征与纹理特征，进行胶原层面分析。

[0062] 实施例3

[0063] 一种早期胃癌切除标本的癌旁胶原组织评价方法，所述方法包括以下步骤：

[0064] (a)样本准备：在早期胃癌标本的病变癌旁处连续切取3张厚度为5μm组织切片进行常规蜡块制备，取1张进行苏木精-伊红染色，另1张进行病理学Masson染色，剩余1张放置于-86℃冰箱进行冷藏保存，作为待测多光子成像切片；

[0065] (b)标注成像区域：在普通光学显微镜下对苏木精-伊红染色切片和Masson染色切片中符合早期胃癌癌旁胶原的区域进行观察，并与步骤(a)待测多光子成像切片进行对比，在待测多光子成像切片上标注对应区域，得到标注成像区域；

[0066] (c)多光子胶原成像：对步骤(b)待测多光子成像切片的标注成像区域的胶原信号进行自体荧光和二次谐波成像，得到多光子胶原成像图，所述双通道探测器的输出功率为2.0W，成像激发波长为820nm，自体荧光信号通道的接收波长为708nm，二次谐波信号通道的接收波长为387nm，所述成像倍数为20倍，成像面积为400μm×400μm；

[0067] (d)成像分析：将步骤(c)得到的多光子成像图片导入图像分析系统，提取图像的形态学特征与纹理特征，进行胶原层面分析。

[0068] 效果例1

[0069] 为表明本发明早期胃癌切除标本的癌旁胶原组织评价方法，可以直观准确的对早期胃癌切除标本的癌旁胶原进行组织评价，同时具有简便易行的特点。现特别使用现有的胶原蛋白(羟脯氨酸)含量分析法对早期胃癌标本的病变癌旁处标本的胶原含量进行测定，其中：标本1为测得胶原含量较多的标本，标本2为测得胶原含量较少的标本。

[0070] 现有的胶原蛋白(羟脯氨酸)含量分析法，主要操作过程为：组织切片在100℃环境下干燥至恒重后在110℃6mol/L的HCl溶液中水解18小时；酸解液蒸发完毕后残渣用无离子水洗涤三次，每次洗涤步骤之间需完全蒸发，以除去残酸；样品经乙酸乙酯枸橼酸盐缓冲液(pH 6)溶解和处理后，通过比色分析羟脯氨酸值，分析结果乘固定系数7.46即为胶原含量，单位为ug/mg。该方法操作流程较为繁琐且耗时，也无法对胶原微观结构进行分析。

[0071] 将上述标本1和标本2分别使用本发明实施例3提供的早期胃癌切除标本的癌旁胶原组织评价方法进行评价，其中：

[0072] 如图2所示，标本1的多光子胶原成像图可见胶原结构致密、排列规整，提示患者出现淋巴结转移可能性小，建议在内镜下行ESD治疗，避免外科手术带来的风险，提高术后生活质量。

[0073] 如图3所示，标本2的多光子胶原成像图可见胶原破坏增多、排列构象紊乱，评估患者出现淋巴结转移可能性大，建议行外科手术治疗，降低远期复发风险。

[0074] 由此可知，本发明早期胃癌切除标本的癌旁胶原组织评价方法与现有的胶原蛋白(羟脯氨酸)含量分析法得到的结果相同，且相较于现有的胶原蛋白(羟脯氨酸)含量分析法不但更为直观准确、简便易行，并且还可以对胶原微观结构进行分析，同时，也避免了现有胶原蛋白(羟脯氨酸)含量分析法的复杂实验操作流程对实验结果的影响。

[0075] 最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。