一种基于光控酶级联反应的酸性磷酸酶活性检测方法

摘要

一种基于光控酶级联反应的酸性磷酸酶活性检测方法。本发明通过利用天然酶催化反应原位产生的光活性纳米材料，建立了一种新型的酶级联催化反应体系。即酸性磷酸酶的催化产物能原位结合到二氧化钛纳米粒子的表面，形成光活性纳米材料；该光活性纳米材料能够在可见光的照射下活化辣根过氧化物酶催化氧化其特征底物的反应，从而形成了可以通过光照的控制实现精准调控的酶级联催化体系。该新型的光控制酶级联催化体系能够实现高效的三重信号放大作用，实现了酸性磷酸酶的简便、高灵敏、高选择性测定。该体系检测ALP活性的检测限可达1.0mU/L。

权利要求

1.一种基于光控酶级联反应的酸性磷酸酶活性检测方法，其特征在于：

a、二氧化钛纳米材料的制备：0℃下将1.0-1.5mL的四氯化钛缓慢加入到10mL的去离子水中，搅拌之后得到白色的溶液，然后加热得到乳白色的二氧化钛悬浮液；所得到的悬浮液过滤洗涤，得到的产品烘干得到二氧化钛纳米材料的固体粉末；

b、酸性磷酸酶活性的测定：在微孔板中加入10μL不同浓度的酸性磷酸酶与10μL酸性磷酸酶的底物溶液在pH＝6.0的醋酸缓冲溶液中混合摇匀后，37℃下振荡孵育1h；随后加入10μL0.15mg/mL的TiO2纳米粒子溶液、40μL0.4g/L的辣根过氧化物酶、100μLpH为4.0的

40mmol/L的醋酸缓冲溶液以及20μL辣根过氧化物酶的特征底物溶液，混合均匀后将微孔板放置于发射波长λ≥400nm的氙灯下照射15min，在酶标仪上测定体系的吸光度。

2.根据权利要求1所述的一种基于光控酶级联反应的酸性磷酸酶活性检测方法，其特征在于所述的酸性磷酸酶的底物选自邻苯二酚磷酸酯、水杨酸磷酸酯。

3.根据权利要求1所述的一种基于光控酶级联反应的酸性磷酸酶活性检测方法，其特征在于所述的辣根过氧化物酶的底物选自3,3’,5,5’-四甲基联苯胺，2,2'-联氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐。

说明书

一种基于光控酶级联反应的酸性磷酸酶活性检测方法

技术领域：

[0001] 本发明涉及纳米生物分析检测领域，尤其涉及一种新型的纳米材料介导的酶级联催化反应体系及其在酸性磷酸酶活性检测中的应用。背景技术：

[0002] 酶催化级联反应具有反应效率高、反应条件温和、选择性高等诸多优势。因此，其在生物催化[You C.；Myung S.；Zhang Y.-H.P.Angew.Chem.,Int.Ed.2012,51,8787-8790；Simon R C.；Nina Richter N.；Busto E.；Wolfgang Kroutil W.ACS Catal.2014,4,129-
143]、生物传感[Freeman  R.；Sharon E.；Tel-Vered R.；Itamar  Willner I.J.Am.Chem.Soc.2009,131,5028–5029；Eguílaz M.；Villalonga R.； P.；
J.M.Anal.Chem.2011,83,7807-7814；Hu Y.W.；Wang F.；Lu C.H.；Girsh J.；
Golub E.；Willner I.Chem.-Eur.J.2014,20,16203-16209]和合成生物学[Dueber J.E.；
Wu G.C.；Malmirchegini G.R.；Moon T.S.；Petzold C.J.；Ullal A.V.；Prather K.L.J.；
Keasling J.D.Nat.Biotechnol.2009,27,753-759]等领域已引起较大的关注。尤其是在生物传感领域，酶催化级联反应能明显地放大信号，实现高灵敏的测定。但是，现有的酶级联催化体系建立的基础基本上都是将一种酶的产物作为另一种酶的反应物而实现反应的串联。这种反应物/产物的严格对应性大大限制了新型的酶级联催化反应体系的构建。

[0003] 纳米材料不仅具有制备方便、价廉易得、性质可调控等优点，而且其还具有独特的光化学、电化学和催化等性质。但是，通过将纳米材料和天然酶实现有效的偶联，以开发新型的酶级联催化体系的研究并不多见。本发明利用天然酶的催化反应原位形成了含有烯二醇结构的化合物修饰的二氧化钛纳米材料，该含有烯二醇结构的化合物修饰的二氧化钛纳米材料在可见光光照条件下可以激活辣根过氧化物酶的催化活性，即：酸性磷酸酶(ACP)的催化反应产生的含有烯二醇结构的化合物能够与二氧化钛纳米材料表面发生络合反应形成表面电荷转移络合物，其能够在可见光的照射下产生羟基自由基、超氧阴离子、光生空穴等活性物种从而激活辣根过氧化物酶的催化氧化活性。据我们所知，利用酶催化反应原位形成的光活性纳米材料来构建酶级联催化体系的研究尚无文献报道。该酶催化级联反应的优势在于其可以通过光照的有无方便的调控反应的开始/终止(无需额外加入化学试剂来启动/终止反应)，且具有高效地三重信号放大作用。该方法对酸性磷酸酶的活性检测具有良好的响应，测定ACP活性的检测限可达1.0mU/L。ACP的检测对于多种疾病，如骨病、肝功能障碍、乳腺癌、前列腺癌和糖尿病有重要意义[Zhao L.；Xie S Z.；Song X J.；Wei J J.；Zhang Z.；Li X H.Biosen.Bioelectron.,2017,91,217-224]。该检测体系不仅提供了一种具有高效信号放大作用的新型酶级联催化体系，将酸性磷酸酶与辣根过氧化物酶的催化反应有机耦合，同时具有测定简便、超灵敏、快速的优点。
发明内容：

[0004] 本发明的目的是提供一种纳米材料介导的酶级联催化反应，该反应具有三重信号放大效应，在ACP活性测定中具有很好的效果。ACP的酶催化反应可以产生带有烯二醇结构的化合物，这些带有烯二醇结构的化合物很容易结合到二氧化钛纳米粒子表面，形成表面电荷转移络合物；结合了含有烯二醇结构化合物的二氧化钛纳米粒子在光照下产生了大量的活性物种从而激活了辣根过氧化物酶对色原底物的催化氧化反应。基于此建立的比色检测方法，可以方便、高灵敏、快速地检测ACP的活性。

[0005] 本发明的目的可通过如下技术措施来实现：

[0006] a、二氧化钛纳米材料的制备：0℃下将一定体积的四氯化钛缓慢加入到10mL的去离子水中，搅拌之后得到白色的溶液，然后加热得到乳白色的二氧化钛悬浮液；所得到的悬浮液过滤洗涤，得到的产品烘干得到二氧化钛纳米材料的固体粉末；

[0007] b、酸性磷酸酶活性的测定：在微孔板中加入10μL不同浓度的酸性磷酸酶与10μL酸性磷酸酶的底物溶液在pH＝6.0的醋酸缓冲溶液中混合摇匀后，37℃下振荡孵育1h；随后加入10μL0.15mg/mL的TiO2纳米粒子溶液、40μL 0.4g/L辣根过氧化物酶、100μL pH为4.0的40mmol/L的醋酸缓冲溶液以及20μL辣根过氧化物酶的特征底物溶液，混合均匀后将微孔板放置于氙灯(λ≥400nm)下照射15min，在酶标仪上测定体系的吸光度。

[0008] 本发明的目的可通过如下技术措施来实现：

[0009] 所述的一定体积的四氯化钛选自1.0-1.5mL；酸性磷酸酶的底物选自邻苯二酚磷酸酯、水杨酸磷酸酯；所述的辣根过氧化物酶的特征底物为3,3’,5,5’-四甲基联苯胺，2,2'-联氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐。
附图说明：

[0010] 图1是不同物质的混合物在光照(λ≥400nm)条件下的吸收光谱图：(a)3,3’,5,5’-四甲基联苯胺与TiO2纳米材料；(b)邻苯二酚磷酸酯，酸性磷酸酶，3,3’,5,5’-四甲基联苯胺与TiO2纳米材料；(c)邻苯二酚磷酸酯，酸性磷酸酶，3,3’,5,5’-四甲基联苯胺，TiO2纳米材料与辣根过氧化物酶的混合物。

[0011] 图2所建立的酶级联催化反应体系可以通过光照的开与关进行调控。

[0012] 图3是研究不同的活性中间体清除剂对酸性磷酸酶以邻苯二酚磷酸酯为底物时活化辣根过氧化物酶催化氧化底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺的影响以解释活化机理。

[0013] 图4是以邻苯二酚磷酸酯为酸性磷酸酶底物，以3,3’,5,5’-四甲基联苯胺作为辣根过氧化物酶底物时对不同浓度(从低到高的浓度依次为：0,0.001,0.005,0.01,0.1,2,20,100,200U/L)的酸性磷酸酶的响应(A)以及选择性(B)。

[0014] 实施实例1：

[0015] a、二氧化钛纳米材料的制备：0℃下将1.0mL的四氯化钛缓慢加入到10mL的去离子水中，搅拌之后得到白色的溶液，然后加热得到乳白色的二氧化钛悬浮液；所得到的悬浮液过滤洗涤，得到的产品烘干得到二氧化钛纳米材料的固体粉末；

[0016] b、酸性磷酸酶活性的测定：在微孔板中加入10μL不同浓度的酸性磷酸酶与10μL5mmol/L的邻苯二酚磷酸酯溶液在pH＝6.0的醋酸缓冲溶液中混合摇匀后，37℃下振荡孵育1h；随后加入10μL 0.15mg/mL的TiO2纳米粒子溶液、40μL 0.4g/L辣根过氧化物酶、100μL pH为4.0的40mmol/L的醋酸缓冲溶液以及20μL 5mmol/L的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺溶液，混合均匀后将微孔板放置于氙灯(λ≥400nm)下照射15min，在酶标仪上测定体系在652nm处的吸光度。

[0017] 实施实例2:

[0018] a、二氧化钛纳米材料的制备：0℃下将1.5mL的四氯化钛缓慢加入到10mL的去离子水中，搅拌之后得到白色的溶液，然后加热得到乳白色的二氧化钛悬浮液；所得到的悬浮液过滤洗涤，得到的产品烘干得到二氧化钛纳米材料的固体粉末；

[0019] b、酸性磷酸酶活性的测定：在微孔板中加入10μL不同浓度的酸性磷酸酶与10μL 5mmol/L水杨酸磷酸酯的溶液在pH＝6.0的醋酸缓冲溶液中混合摇匀后，37℃下振荡孵育
1h；随后加入10μL 0.15mg/mL的TiO2纳米粒子溶液、40μL 0.4g/L辣根过氧化物酶、100μL pH为4.0的40mmol/L的醋酸缓冲溶液以及20μL 0.01mol/L的2,2'-联氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐溶液，混合均匀后将微孔板放置于氙灯(λ≥400nm)下照射15min，在酶标仪上测定体系在417nm处的吸光度。