中乌宁碱的应用

摘要

本发明公开了一种中乌宁碱的应用。所述的应用为中乌宁碱或其药学上可接受的盐、酯或溶剂化物，在制备预防和/或治疗心肌纤维化的药物或保健品中的应用。中乌宁碱能够很好地预防和/或治疗心肌纤维化及由心肌纤维化引起慢性心衰或心脏重构。

权利要求

1.中乌宁碱或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗心肌纤维化的药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的心肌纤维化为药物性心肌纤维化。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的药物性心肌纤维化为阿霉素诱导的心肌纤维化。

4.中乌宁碱或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗由心肌纤维化所致慢性心衰的药物中的应用。

5.中乌宁碱或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗由心肌纤维化所致心脏重构的药物中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的心肌纤维化所致心脏重构为心室扩张。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的心室扩张为左心室扩张或双心室扩张。

说明书

中乌宁碱的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种中乌宁碱的应用。

背景技术

[0002] 随着老龄化社会的到来，心力衰竭发病率和病死率呈现不断上升趋势，2015年最新临床统计数据显示中国现有心衰患者的患病率已突破1000万，给社会带来沉重的经济负担。慢性心衰(chronic heart failure，CHF)是一种进行性的心脏病变，一旦起始，即使没有新的心肌损害，自身仍可不断恶化。尽管心衰的治疗有了一定的突破，但是其预后较差，五年病死率仍高达60-80％。这就需要我们对CHF的分子发病机制进行深入研究，以寻求更有效的治疗靶标，开发更为安全且有效的抗CHF药物。

[0003] 组织异常重构是导致器官功能衰竭的主要原因和病理基础，而纤维化作为组织重构的重要病理表现之一，是许多疾病致残、致死的重要原因。流行病学调查资料显示，心衰患者接近45％的死亡可以归结于组织纤维增生性疾病，临床上表现为心室内径增大和心室腔几何形状发生改变。损伤刺激包括缺血、压力过负荷及心脏毒性物质等均可引起心肌细胞发生凋亡及坏死，导致心肌细胞丢失；而残余的心肌发生肥厚以代偿不足的心功能，同时周围的结缔组织增生以填补心肌细胞丢失留下的空隙，从而导致心脏形态及结构的改变，此过程即为心肌重构。随着时间的推移，肥厚的心肌发生失代偿出现大量心肌细胞丢失，反应性细胞外基质增多，导致心肌明显纤维化。后者增加室壁的僵硬度，明显影响心脏的舒缩功能，最终导致慢性心衰的发生。

[0004] 传统的药物治疗主要是针对血液动力学改变，“强心、利尿、扩血管”一直是治疗CHF的常规经典用药，大量临床研究表明，这些药物短期内虽然能改善血液动力学、减轻症状，但长期用药并不能降低CHF的病死率，甚至可增加其病死率和病残率。且临床常用于治疗心梗引起的心力衰竭的强心药(如地高辛)和利尿药(氢氯噻嗪)一般不认为其具备抗心肌纤维化的作用。

[0005] 中药附子为毛茛科植物乌头(aconitum carmichaellii)的子根加工品，被称为中药里的“回阳救逆第一品”，作为著名强心药物广泛用于中医临床。现代医学研究发现附子抗心力衰竭的作用主要是通过增强心肌收缩力，加快心率，增加心输出量，以及扩张血管，增加血流，改善血液循环实现的。但由于附子中常含有乌头碱(aconitine)等毒性成分，炮制不当或剂量过大则极易引起较为严重的急性肾炎和肾脏衰竭等毒性反应，寻找附子中高效且低毒的强心成分，一直是许多研究人员多年来的研究课题，先后从附子中分离并鉴定出N-去乙基乌头宁碱(N-deethylaconine)、中乌宁碱(mesaconine)、次乌宁碱(hypaconine)、北乌亭宁(beiwutininine)、附子灵(fuzinine)等多种强心活性成分，并在离体牛蛙和大鼠心脏以及在体大鼠上证实中乌宁碱具有明显的改善心功能的作用，能够有效预防和治疗心肌缺血再灌注损伤引起的急性心力衰竭，相关工作已申请中国专利，并于2012年获得授权(王锋鹏等，授权公告号CN 102146057B)，该专利中未提及任何关于该药物能够治疗心肌纤维化，且心肌缺血再灌注损伤引起的急性心力衰竭中往往并不会发生心肌纤维化。

发明内容

[0006] 本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中缺乏有效预防或治疗心肌纤维化药物，而提供了一种中乌宁碱的应用。中乌宁碱能够很好地预防和/或治疗心肌纤维化及由心肌纤维化引起慢性心衰或心脏重构。

[0007] 本发明提供了一种中乌宁碱或其药学上可接受的盐、酯或溶剂化物，在制备预防和/或治疗心肌纤维化的药物或保健品中的应用。

[0008] 本发明提供了一种中乌宁碱或其药学上可接受的盐、酯或溶剂化物，在制备预防和/或治疗由心肌纤维化所致慢性心衰的药物或保健品中的应用。

[0009] 本发明提供了一种中乌宁碱或其药学上可接受的盐、酯或溶剂化物，在制备预防和/或治疗由心肌纤维化所致心脏重构的药物或保健品中的应用。

[0010] 所述的心肌纤维化一般指心肌组织中成纤维细胞过度活化，分泌大量胶原纤维并过量沉积，胶原浓度和胶原容积分数显著增加，各型胶原比例失调并排列紊乱的一种心脏病理改变，一般由心肌组织慢性炎症和细胞凋亡引起。可以理解为本领域常识中，各种因素(如药物性心肌纤维化，缺血、压力过负荷等因素)能够引起心肌组织慢性炎症和细胞凋亡而导致的心肌纤维化均属于本申请所述的范畴。所述的药物性心肌纤维化，例如阿霉素诱导的心肌纤维化。

[0011] 所述的心肌纤维化所致心脏重构主要发生在心室部位，故也可称为心室重构，指心肌损伤后发生的心肌细胞肥大或丢失、非心肌细胞增生和间质纤维化，以及在此基础上形成的心腔扩张与心脏重量增加，例如心室扩张(如左心室扩张或双心室扩张)。

[0012] 所述的心肌纤维化所致慢性心衰是指多种心脏疾病如高血压性心脏病、缺血性心肌病、肥厚型心肌病、扩张性心肌病、病毒性心肌炎及糖尿病心肌病等引起的心肌纤维化后，使得心室壁僵硬度增加，从而持续影响心脏的舒缩功能，最终导致的心功能障碍。

[0013] 本领域中，中乌宁碱的结构如下所示：

[0014]

[0015] 所述的“预防”是指在可能的心肌纤维化因素的存在下，使用后防止或降低心肌纤维化的产生。所述的“治疗”是指减轻心肌纤维化的程度，或者治愈心肌纤维化使之正常化，或者减缓心肌纤维化的进程。

[0016] 本发明所中，术语“药学上可接受的”是指对接受治疗的受试者的一般健康情况没有长期的有害影响。

[0017] 本发明中，术语“药学上可接受的盐”是指保留了中乌宁碱中游离碱的生物效力，并且在生物学或其它方面上没有不良作用的盐。药学上可接受的盐是指把母体化合物中的碱基基团转换成盐的形式，如碱基基团(如胺基)的无机或有机酸盐类，一般将母体化合物与常规种类的酸在一个溶剂系统中反应进行制备，无机酸一般包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸或磷酸等；由有机酸一般包括乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸或水杨酸等。

[0018] 本发明中，术语“药学上可接受的溶剂化物”是指通过溶剂化作用形成的中乌宁碱与溶剂分子的组合，可包括化学计量或非化学计量的溶剂，并且溶剂中的溶剂分子可能以有序或非有序排列的形式存在。

[0019] 本发明中，术语“药学上可接受的酯”是指中乌宁碱在药学上可接受的酯，一般在生物条件下(体外或体内)，酯键可从化合物上裂解或以其他方式发生反应以提供中乌宁碱。所述的酯可无活性，或者比中乌宁碱本身活性低，使得直到将中乌宁碱从所述的上酯裂解后才能发挥其活性。成酯的中乌宁碱后一般可改善母体化合物(即中乌宁碱)在溶解度、组织相容性或药物代谢动力学等方面的性质。

[0020] 本发明中，所述的“预防和/或治疗心肌纤维化的药物”、“预防和/或治疗由心肌纤维化所致心脏异常重构的药物”或“预防和/或治疗由心肌纤维化所致慢性心衰的药物”中可包括中乌宁碱或其药学上可接受的盐、酯或溶剂化物，以及药学上可接受的辅料，其可根据本领域常规方法制备，一般通过将中乌宁碱或其药学上可接受的盐、酯或溶剂化物，与一种或多种药学上常规的赋形剂(可为固体赋形剂或液体赋形剂)和/或辅剂混合，制成适用于人或动物使用的剂型，例如普通制剂(如片剂、胶囊剂、颗粒剂或注射剂等)、缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。中乌宁碱在所述的“心肌纤维化的药物”中的重量含量可为0.1-95％。

[0021] 所述的“预防和/或治疗心肌纤维化的药物”、“预防和/或治疗由心肌纤维化所致心脏异常重构的药物”或“预防和/或治疗由心肌纤维化所致慢性心衰的药物”可用任何公知的给药方法给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺和呼吸道、皮肤、阴道、直肠等。给药剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型可以是溶液剂(包括真溶液和胶体溶液)、乳剂(包括o/w型、w/o型和复乳)、混悬剂、注射剂(包括水针剂、粉针剂和输液)、滴眼剂、滴鼻剂、洗剂和搽剂等；固体剂型可以是片剂(包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片)、胶囊剂(包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊)、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、气(粉)雾剂、喷雾剂等；半固体剂型可以是软膏剂、凝胶剂、糊剂等。

[0022] 所述的“预防和/或治疗心肌纤维化的药物”、“预防和/或治疗由心肌纤维化所致心脏异常重构的药物”或“预防和/或治疗由心肌纤维化所致慢性心衰的药物”为片剂时，可以使用本领域常规的各种赋形剂，包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂。稀释剂可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；湿润剂可以是水、乙醇、异丙醇等；粘合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解剂可以是干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与枸橼酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助流剂可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇等。上述片剂还可进一步制成包衣片，如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。

[0023] 所述的“预防和/或治疗心肌纤维化的药物”、“预防和/或治疗由心肌纤维化所致心脏异常重构的药物”或“预防和/或治疗由心肌纤维化所致慢性心衰的药物”为胶囊剂时，为了将给药单元制成胶囊剂，可以将有效成分(中乌宁碱)与稀释剂、助流剂混合，将混合物直接置于硬胶囊或软胶囊中。也可将有效成分先与稀释剂、黏合剂、崩解剂制成颗粒或微丸，再置于硬胶囊或软胶囊中。上述片剂的各稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂和助流剂品种也可用于制备所述的胶囊剂中。

[0024] 所述的“预防和/或治疗心肌纤维化的药物”、“预防和/或治疗由心肌纤维化所致心脏异常重构的药物”或“预防和/或治疗由心肌纤维化所致慢性心衰的药物”为注射剂时，为将本发明化合物制成注射剂，可以用水、乙醇、异丙醇、丙二醇或它们的混合物作溶剂并加入适量本领域常用的增溶剂、助溶剂、pH调节剂或渗透压调节剂。增溶剂或助溶剂可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羟丙基-β-环糊精等；pH调节剂可以是磷酸盐、醋酸盐、盐酸、氢氧化钠等；渗透压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、葡萄糖、磷酸盐、醋酸盐等。如制备冻干粉针剂，还可加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。

[0025] 所述的“心肌纤维化的药物”、“由心肌纤维化所致心脏异常重构的药物”或“由心肌纤维化所致慢性心衰的药物”的给药剂量依照所要预防和/或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的个体情况，给药途径和剂型等可以有大范围的变化。一般来讲，中乌宁碱的每天的剂量范围可为0.001-150mg/Kg体重，优选为0.1-100mg/Kg体重，更优选为1-60mg/Kg体重，最优选为2-30mg/Kg体重。上述剂量可以一个剂量单位或分成几个剂量单位给药，这取决于医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。

[0026] 所述的“预防和/或治疗心肌纤维化的药物或保健品”可单独服用或与其他治疗药物或对症药物合并使用。当本发明的化合物与其它治疗药物存在协同作用时，应根据实际情况调整使用剂量。

[0027] 所述的“预防和/或治疗由心肌纤维化所致心脏异常重构的药物或保健品”可单独服用或与其他治疗药物或对症药物合并使用。当本发明的化合物与其它治疗药物存在协同作用时，应根据实际情况调整使用剂量。

[0028] 所述的“预防和/或治疗由心肌纤维化所致慢性心衰的药物或保健品”可单独服用或与其他治疗药物或对症药物合并使用。当本发明的化合物与其它治疗药物存在协同作用时，应根据实际情况调整使用剂量。

[0029] 本发明所述的应用中，所述的产品包括但不限定于药品和保健品。

[0030] 在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

[0031] 本发明所用试剂和原料均市售可得。

[0032] 本发明的积极进步效果在于：

[0033] 1，本发明在阿霉素诱导慢性心衰小鼠的模型上，发现中乌宁碱在药理上具有以下几方面显著活性：1)抑制或逆转心肌组织纤维化；2)改善心脏异常重构；3)改善心功能障碍；4)提高心肌纤维化所致慢性心衰小鼠的生存率；5)对抗心肌组织炎症；6)抑制心肌细胞凋亡；7)将死小鼠心肌酶活性，其作用机理与抑制阿霉素引起的心肌组织炎症和纤维化，对抗心肌细胞凋亡有关。且本申请首次提出中乌宁碱在制备预防和/或治疗心肌纤维化及由心肌纤维化引起慢性心衰的药物中的新用途。

[0034] 2、中乌宁碱的原料来源丰富，化学结构清楚，克服了中药复方物质复杂难以阐明的问题，有望通过符合现代医药学规律的研发使之成为一种创新性药物。

附图说明

[0035] 图1为实施例1中治疗性给予中乌宁碱抗阿霉素诱导心肌纤维化实验给药时间安排。

[0036] 图2为中乌宁碱对阿霉素诱导的心肌纤维化小鼠心脏胶原的影响。从左到右，从上到下依次为正常组、模型组、西地兰组、中乌宁碱低剂量给药组、中乌宁碱中剂量给药组、中乌宁碱高剂量给药组小鼠心脏组织切片胶原经Masson染色后的代表性图片。

[0037] 图3为中乌宁碱对阿霉素诱导的心肌纤维化小鼠心脏组织胶原面积影响的统计结果。

[0038] 图4为中乌宁碱对阿霉素诱导的心肌纤维化小鼠心肌炎症的影响。从左到右，从上到下依次为正常组、模型组、西地兰组、中乌宁碱低剂量给药组、中乌宁碱中剂量给药组、中乌宁碱高剂量给药组小鼠心脏切片经HE染色后的代表性图片。

[0039] 图5为中乌宁碱对阿霉素诱导的心肌纤维化小鼠心脏组织炎症评分结果。

[0040] 图6为中乌宁碱对阿霉素诱导心肌纤维化小鼠生存率的影响。

[0041] 图7为中乌宁碱对阿霉素诱导的心肌纤维化小鼠舒张期左心室前壁(LVAWd)的影响

[0042] 图8为中乌宁碱对阿霉素诱导的心肌纤维化小鼠舒张期左心室后壁(LVPWd)的影响

[0043] 图9为中乌宁碱对阿霉素诱导的心肌纤维化小鼠舒张期左心室内径(LVIDd)的影响。

[0044] 图10为中乌宁碱对阿霉素诱导的心肌纤维化小鼠左心室整体形态的影响。从左到右，从上到下依次为正常组、模型组、西地兰组、中乌宁碱低剂量给药组、中乌宁碱中剂量给药组、中乌宁碱高剂量给药组小鼠整体心脏切片经HE染色后的代表性图片。

[0045] 图11为中乌宁碱对阿霉素诱导的心肌纤维化小鼠左心室M型超声心动图。

[0046] 图12为中乌宁碱对阿霉素诱导的心肌纤维化小鼠心脏射血分数(EF)的影响。

[0047] 图13为中乌宁碱对阿霉素诱导的心肌纤维化小鼠心脏短轴缩短率(FS)的影响。

[0048] 图14为中乌宁碱对阿霉素诱导的心肌纤维化小鼠血清肌酸激酶(CK)的影响。

[0049] 图15为中乌宁碱对阿霉素诱导的心肌纤维化小鼠血清乳酸脱氢酶(LDH)的影响。

[0050] 图16为中乌宁碱对阿霉素诱导的心肌纤维化小鼠心肌细胞凋亡的影响。从左到右，从上到下依次为正常组、模型组、西地兰组、中乌宁碱低剂量给药组、中乌宁碱中剂量给药组、中乌宁碱高剂量给药组小鼠。

[0051] 图17为中乌宁碱对阿霉素诱导的心肌纤维化小鼠心肌细胞凋亡影响的统计结果。

具体实施方式

[0052] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

[0053] 下述实施例中涉及的实验材料包括：

[0054] 1.实验动物：SPF级10周龄的C57BL/6小鼠，雄性，20～25g，北京维通利华有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK(京)2012-0001，实验动物使用许可证号为SYXK(京)2014-0023。

[0055] 2.造模试剂：阿霉素(doxorubicin，DOX)，深圳万乐药业有限公司。

[0056] 3.治疗试剂：中乌宁碱由人工分离提取获得。阳性药去乙酰毛花洋地黄甙(西地兰，Cedilanid)购自上海旭东海普药业有限公司。

[0057] 4.其他试剂：肌酸激酶和乳酸脱氢酶测定试剂盒购自江苏南京建成生物有限公司。麻醉药戊巴比妥钠购自Sigma公司。

[0058] 实施例1阿霉素诱导心肌纤维化小鼠模型的制备、实验分组及给药方案[0059] 我们选用经典的多次小剂量给予阿霉素诱导慢性心衰模型考察了中乌宁碱对于心肌纤维所致慢性心衰的影响。如表1所示，将C57BL/6小鼠按体重均衡随机分为6组。除正常小鼠外其它小鼠每周腹腔注射(i.p.)阿霉素3.5mg/kg，重复9周，从造模后第64天开始，每天给予高、中、低剂量中乌宁碱以及阳性药西地兰(Cedilanid)(待测样品用生理盐水溶解，给药体积为10ml/kg)连续治疗57天，第121天实验结束，利用超声心动检测系统评价小鼠心脏结构与功能，收集心脏组织与血清备用。正常对照组(Normal)与模型组(Model)在相同时间注射等体积的生理盐水(N.S)。具体安排如图1所示。

[0060] 表1.治疗性给予中乌宁碱抗阿霉素诱导心肌纤维化小鼠模型实验

[0061]

[0062] 表2治疗性给予中乌宁碱抗阿霉素诱导心肌纤维化小鼠模型实验数据(即下述1.1～1.5中各个测试指标的结果统计表)

[0063]

[0064] 1.1中乌宁碱对阿霉素诱导心肌纤维化小鼠心肌纤维化及炎症的影响

[0065] 心脏组织纤维化是心脏病致死的重要原因之一。胶原绝对面积百分率是评价组织纤维化程度的可靠指标，利用Masson染色检测心脏组织胶原沉积可以在一定程度反映心肌纤维化的情况。将心脏的病理切片做Masson染色后，在显微镜下随机挑选10个视野进行观察并照相记录，用Image-pro plus5.1测定每个视野下纤维化区域的相对大小。阿霉素诱导心肌纤维化后第121天实验结束，正常组心肌组织胶原组织相对较少，阿霉素诱导后的心肌纤维化模型小鼠心肌组织胶原明显增加，形成严重心肌纤维，胶原面积百分率增至正常值的6.2倍，中乌宁碱可以显著降低阿霉素引起的小鼠心肌组织胶原沉积，且具有剂量依赖性，与模型组比较中乌宁碱各组均有显著性差异(P<0.05)。图2为心肌组织切片Masson染色的典型图片。图3为心肌组织胶原面积百分率的具体统计结果，具体数值见表2。

[0066] 阿霉素诱导心肌纤维化后第121天实验结束，将心脏的病理切片做HE染色，在显微镜下随机挑选10个视野进行观察并照相记录，观察其炎症细胞浸润情况。发现阿霉素致心肌纤维化小鼠心脏组织，常伴随有心肌细胞萎缩变性以及凋亡坏死，表现为：心肌组织中无规则分隔心肌细胞增多；局部心肌细胞肥大、扭曲，排列紊乱，细胞间隙增大；病变明显部位心肌细胞可见空泡样变性，间质可见散在炎性细胞浸润。而给予中乌宁碱治疗57天后可以显著改善上述病理学变化。图4为心肌组织切片HE染色的典型病理图片。图5为心肌组织炎症评分的具体统计结果，具体见表2，中剂量和高剂量组与模型组比较均有显著性差异(P<0.05)。

[0067] 1.2中乌宁碱对阿霉素致心肌纤维化小鼠生存率的影响

[0068] 以心肌细胞损失和组织纤维化为特征的心脏组织异常重构是慢性心衰的核心病理改变，也是导致模型小鼠死亡的主要原因之一。从造模后第64天开始，统计每天各组实验动物死亡情况并进行计算，例如某组动物未出现死亡则生存率计算为100％，某组动物全部死亡则生存率计算为0％。生存率结果如图6所示(具体数值见表2)：除正常组以外，实验期间其它各组都有数目不等的动物死亡。模型组动物在第121天的生存率为43.8％，阳性药西地兰并未改善心肌纤维化小鼠生存率，与模型组比较无显著差异。然而给予高、中、低剂量中乌宁碱治疗可以显著提高动物生存率，治疗57天后的生存率分别为88.9％、75.0％和69.2％，对阿霉素引起的心肌纤维化小鼠的死亡具有明显的保护作用，与模型组比较具有显著性差异(P<0.05)。

[0069] 1.3中乌宁碱对阿霉素致心肌纤维化小鼠心室重构及心功能障碍的影响[0070] 心室重构是慢性心衰重要的心脏结构病理改变。阿霉素诱导心肌纤维化后第121天，小鼠按50mg/kg剂量腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉后，对其胸腹部进行脱毛处理，仰卧位固定于超声检测台，使用VisualSonics Vevo 770(VisualSonics,加拿大)超声系统进行检测：先用10M Hz超声探头对小鼠心脏长轴方向进行B型超声监测，确定左心室乳头肌位置后，再转为心脏短轴方向进行监测，并记录其10～20个心动周期的M型超声变化图；用Vevo770软件分别测量舒张末期左室前壁厚度(LVAWd)、左室后壁厚度(LVPWd)、左心室内径(LVIDd)、短轴缩短率(Fractional Shortening，FS)、射血分数(Ejection Fraction，EF)等各项心脏结构和心功能指标。结果表明，模型组小鼠出现明显的左心室扩张和心室壁变薄等病理改变，而给予不同剂量中乌宁碱治疗57天后可以显著抑制LVIDd的增加，不同程度改善心室LVAWd与LVPWd变薄，且具有剂量依赖性(图7为心脏结构指标LVAWd具体统计结果；图8为心脏结构指标LVPWd具体统计结果；图9为心脏结构指标LVIDd具体统计结果，具体数值见表2，与模型组比较中乌宁碱各组均有显著性差异P<0.05)。随后我们通过对小鼠整体心脏进行纵切，HE染色也表明，模型组小鼠心室的确发生明显重构，中乌宁碱可以显著改善扩心病小鼠心室扩张和心室壁变薄等结构性病理变化(图10)。

[0071] 利用VasualSonics超声心动检测系统记录心脏射血分数(Ejection Fraction，EF)和左心室短轴缩短率(Fractional Shortening，FS)。结果表明：阿霉素诱导心肌纤维化后121天，模型组动物表现出左心室收缩功能的显著下降，表现为EF和FS均低于正常小鼠，从造模后64天开始进行中乌宁碱治疗57天，中、高剂量中乌宁碱可以剂量依赖性地改善体现心脏收缩功能，与模型组比较有显著性差异，P<0.05。(图11为M型超声心动检测代表性图片；图12为左心室收缩指标EF具体统计结果；图13为左心室收缩指标FS具体统计结果，具体数值见表2)。

[0072] 1.4中乌宁碱对阿霉素致心肌纤维化小鼠心肌酶活性的影响

[0073] 血清心肌酶测定时诊断心肌损伤的重要手段，我们选用经典的心肌酶指标——肌酸激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)对各组小鼠的心肌损伤程度进行间接评价。阿霉素诱导心肌纤维化后第121天实验结束，各组小鼠眶静脉采血，置于室温30min析出血清，于4℃，3000rpm离心10min，分离血清，使用酶标仪按试剂盒说明书检测心肌酶——肌酸激酶(CK)，乳酸脱氢酶(LDH)活力。结果表明：阿霉素诱导慢性心衰121天，模型组动物血清中CK和LDH活性显著高于正常小鼠，从造模后64天开始进行中乌宁碱治疗57天，中、高剂量的中乌宁碱可以剂量依赖性地降低CK和LDH活性，与模型组比较有显著性差异(P<0.05)。图14为血清肌酸激酶活力具体统计结果；图15为血清乳酸脱氢酶活力具体统计结果(具体数值见表2)。

[0074] 1.5中乌宁碱对阿霉素致心肌纤维化小鼠心肌细胞凋亡的影响

[0075] 心肌细胞凋亡是心肌纤维化致慢性心衰的主要病理表现之一。我们利用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(Transferase dUTP nick end-labeling,TUNEL)检测了阿霉素素引起的心肌细胞凋亡情况。TUNEL方法是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，尤其可检测出极少量的凋亡细胞，敏感性高，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。阿霉素诱导心肌纤维化后第121天实验结束，将心脏的病理切片做原位末端DNA标记法(TUNEL)染色，在荧光显微镜下随机挑选10不同视野进行观察并照相记录，用Image-pro plus 5.1测定每个视野下凋亡区域的相对大小。结果表明，阿霉素可以造成心脏组织TUNEL阳性细胞增加(阳性细胞呈现绿色荧光，细胞核呈现蓝色荧光，高、中、低剂量的中乌宁碱可以剂量依赖性的抑制阿霉素引起的细胞凋亡(P<0.05)。图16为TUNEL染色典型图；图17为TUNEL染色测得心肌细胞凋亡率的具体统计结果(具体数值见表2)。