一种用于诊断预示三阴性型乳腺癌骨转移的基因诊断试剂盒转让专利
申请号 : CN201711142801.1
文献号 : CN107916291B
文献日 : 2019-01-08
发明人 : 李宜健 , 薛守海 , 王凤祥 , 刘敏涛 , 胡雨祝
申请人 : 吉林华汇生物科技有限公司
摘要 :
本发明公开了lncRNA组合物及制备诊断预示三阴性型乳腺癌骨转移试剂盒的用途。本发明发现，血清lncRNAXLOC_004122、SUMO1P3和NBAT‑1可联合用于诊断预示Luminal A型乳腺癌骨转移，血清lncRNAXLOC_004122、Linc00467和lncRNAAl049452可联合用于诊断预示Luminal B型乳腺癌骨转移，血清lncRNAAK043773和EXOC7可联合用于诊断预示Her‑2过表达型乳腺癌骨转移，lncRNALnc01089和HOTAIR可联合用于诊断预示三阴性型乳腺癌骨转移，准确度高(90％以上)，检测成本低、非介入性、方便快捷。
权利要求 :
1.一种用于诊断预示三阴性型乳腺癌骨转移的基因诊断试剂盒，其特征在于：包括用于测定lncRNA Lnc01089、lncRNA HOTAIR和内参GAPDH表达水平的qPCR引物；lncRNA Lnc01089的qPCR上游引物如Sequence NO. 15所示，其qPCR下游引物如Sequence NO. 16所示；lncRNA HOTAIR的qPCR上游引物如Sequence NO. 17所示，其qPCR下游引物如Sequence NO. 18所示；内参GAPDH的qPCR上游引物如Sequence NO. 19所示，其qPCR下游引物如Sequence NO. 20所示。
2.根据权利要求1所述的基因诊断试剂盒，其特征在于：还包括qPCR所需的酶。
说明书 :
一种用于诊断预示三阴性型乳腺癌骨转移的基因诊断试剂盒
技术领域
[0001] 本发明属于生物化学领域，涉及诊断组合物及诊断试剂盒，具体涉及一种lncRNA诊断组合物及在制备诊断预示不同分子亚型乳腺癌骨转移的诊断试剂盒方面的应用。
背景技术
[0002] 乳腺癌是威胁女性生命健康的恶性肿瘤之一，每年约有40-45万人死于乳腺癌(参考文献：不同分子亚型乳腺癌骨转移患者的临床特征和预后分析，西安交通大学学报·医学版，2017年9月第38卷第5期)。乳腺癌非常容易发生远处转移，骨是乳腺癌最常见的远处转移部位，大于50％的患者首发转移部位是骨组织(参考文献：Genes associated with breast cancer metastatic to bone,J Clin Oncol,2006；Implications of Bone-Only Metastases in Breast Cancer:Favorable Preference with Excellent Outcomes of Hormone Receptor Positive Breast Cancer,Cancer Res Treat,2011)。根据雌激素受体(estrogen receptor,ER)、孕激素受体(progesterone receptor,PR)、人表皮生长因子受体-2(human epidermal growth factor receptor-2,HER-2)的表达情况，可将乳腺癌分为4个亚型，分别为：Luminal A型、Luminal B型、Her-2过表达型和三阴性乳腺癌(参考文献：
Gene expression patterns of breast carcinomas distinguish tumor subclasses with clinical implications,PNAS,2001)。研究表明，乳腺癌骨转移的预后与其分子分型、临床分期、淋巴结状态等密切相关(参考文献：Prevalence and risk factors of bone metastasis and skeletal related events in patients with primary breast cancer in Japan,Int J Clin Onco,2014)。不同分子亚型乳腺癌特定的分子生物学和临床病理特征，决定了其治疗方式及预后的差异。不同分子亚型乳腺癌骨转移的基因表达水平也存在差异。
Gene expression patterns of breast carcinomas distinguish tumor subclasses with clinical implications,PNAS,2001)。研究表明，乳腺癌骨转移的预后与其分子分型、临床分期、淋巴结状态等密切相关(参考文献：Prevalence and risk factors of bone metastasis and skeletal related events in patients with primary breast cancer in Japan,Int J Clin Onco,2014)。不同分子亚型乳腺癌特定的分子生物学和临床病理特征，决定了其治疗方式及预后的差异。不同分子亚型乳腺癌骨转移的基因表达水平也存在差异。
[0003] 早期诊断乳腺癌骨转移是挽救患者生命的关键。目前，放射性核素骨扫描(ECT)、电子计算机断层扫描(CT)、核磁共振(MRI)、正电子发射计算机断层扫描(PET-CT)和骨组织活检是发现和确诊乳腺癌骨转移的金标准。但是，这些方法均存在不同的不足，比如检查费用高，介入诊断增加了患者的负担。这增加了乳腺癌患者骨转移常规检测的压力。
[0004] 长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是指长度超过200个核苷酸、具有调控基因表达作用的非编码RNA。近年来研究表明，长链非编码RNA在肿瘤的发生、发展过程中发挥着促癌或抑癌作用，它们参与了细胞凋亡调控、肿瘤浸润与转移等过程；另外，它们还通过表观遗传调控的方式影响肿瘤细胞的生长，有希望成为新型肿瘤标志物和肿瘤治疗的靶点，在肿瘤诊断和治疗方面显示出良好的临床应用前景(参考文献：长链非编码RNA与肿瘤的关系及其临床价值，中国细胞生物学学报，2012年第34卷第7期)。
[0005] 研究表明，乳腺癌原发肿瘤的多种基因表达是发生骨转移所必需的，因而认为特定器官的转移是多因子共同作用的结果，该结论提示，骨的特异性转移是骨对原发肿瘤内不同表型肿瘤细胞的选择和骨源性因子诱导的结果，不同分子亚型乳腺癌骨转移的差异表达基因有望成为成为乳腺癌骨转移的诊断标志物(参考文献：Kang Y,Siegel PM,Shu W,et al.A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone.Cancer Cell,2003)。
[0006] 申请人旨在研究比较发生骨转移与未发生骨转移的乳腺癌患者血清中lncRNA表达的差异，发现、验证可以用作诊断、预示不同分子亚型乳腺癌骨转移的lncRNA标志物，以提供一种通过血液即可快速诊断、预示不同分子亚型乳腺癌骨转移的试剂盒和方法。
发明内容
[0007] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种lncRNA诊断组合物，制备成一种检测成本低、非介入性、方便快捷诊断预示不同分子亚型乳腺癌骨转移的诊断试剂盒。
[0008] 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
[0009] 一、Luminal A型乳腺癌骨转移
[0010] 一种lncRNA诊断组合物，由lncRNA XLOC_004122、lncRNA SUMO1P3和lncRNA NBAT-1组成。
[0011] 上述诊断组合物在制备诊断预示Luminal A型乳腺癌骨转移的诊断试剂盒方面的应用。
[0012] 用于诊断预示Luminal A型乳腺癌骨转移的诊断试剂盒，包括lncRNA XLOC_004122、lncRNA SUMO1P3和lncRNA NBAT-1的qPCR引物。
[0013] 优选地，所述的诊断试剂盒中，lncRNA XLOC_004122的qPCR上游引物如Sequence NO.1所示，qPCR下游引物如Sequence NO.2所示。
[0014] 优选地，所述的诊断试剂盒中，lncRNA SUMO1P3的qPCR上游引物如Sequence NO.3所示，qPCR下游引物如Sequence NO.4所示。
[0015] 优选地，所述的诊断试剂盒中，lncRNA NBAT-1的qPCR上游引物如Sequence NO.5所示，qPCR下游引物如Sequence NO.6所示。
[0016] 优选地，所述的诊断试剂盒中还包括内参GAPDH的qPCR引物。
[0017] 优选地，所述的诊断试剂盒中，所述内参GAPDH的qPCR上游引物如Sequence NO.19所示，qPCR下游引物如Sequence NO.20所示。
[0018] 上述任一所述的诊断试剂盒中还包括qRT-PCR所需的酶。
[0019] 一种诊断预示Luminal A型乳腺癌骨转移的方法，包括如下步骤：
[0020] 步骤S1，采集Luminal A型乳腺癌患者空腹静脉血，自然凝固后离心分离出血清；
[0021] 步骤S2，提取血清总RNA，用qRT-PCR法测定总RNA中lncRNA XLOC_004122、lncRNA SUMO1P3和lncRNA NBAT-1相对于内参GAPDH的相对表达水平，依次用X3、X1、X2表示；
[0022] 步骤S3，将X3、X1、X2值代入二元逻辑回归方程Y＝-2.577+2.045X1+1.956X2+1.676X3得到Y值，Y值大于0.598预示该乳腺癌患者发生骨转移，小于0.598预示未发生骨转移。
[0023] 二、Luminal B型乳腺癌骨转移
[0024] 一种lncRNA诊断组合物，由lncRNA XLOC_004122、lncRNA Linc00467和lncRNA Al049452组成。
[0025] 上述诊断组合物在制备诊断预示Luminal B型乳腺癌骨转移的诊断试剂盒方面的应用。
[0026] 用于诊断预示Luminal B型乳腺癌骨转移的诊断试剂盒，包括lncRNA XLOC_004122、lncRNA Linc00467和lncRNA Al049452的qPCR引物。
[0027] 优选地，所述的诊断试剂盒中，lncRNA XLOC_004122的qPCR上游引物如Sequence NO.1所示，qPCR下游引物如Sequence NO.2所示。
[0028] 优选地，所述的诊断试剂盒中，lncRNA Linc00467的qPCR上游引物如Sequence NO.7所示，qPCR下游引物如Sequence NO.8所示。
[0029] 优选地，所述的诊断试剂盒中，lncRNA Al049452的qPCR上游引物如Sequence NO.9所示，qPCR下游引物如Sequence NO.10所示。
[0030] 优选地，所述的诊断试剂盒中，还包括内参GAPDH的qPCR引物。
[0031] 优选地，所述的诊断试剂盒中，所述内参GAPDH的qPCR上游引物如Sequence NO.19所示，qPCR下游引物如Sequence NO.20所示。
[0032] 上述任一所述的诊断试剂盒还包括qRT-PCR所需的酶。
[0033] 一种诊断预示Luminal B型乳腺癌骨转移的方法，包括如下步骤：
[0034] 步骤S1，采集Luminal B型乳腺癌患者空腹静脉血，自然凝固后离心分离出血清；
[0035] 步骤S2，提取血清总RNA，用qRT-PCR法测定总RNA中lncRNA XLOC_004122、lncRNA Linc00467和lncRNA Al049452相对于内参GAPDH的相对表达水平，用X3、X1、X2表示；
[0036] 步骤S3，将X3、X1、X2值代入二元逻辑回归方程Y＝Y＝-2.241+1.883X1+2.275X2+1.975X3得到Y值，Y值大于0.607预示该乳腺癌患者发生骨转移，小于0.607预示未发生骨转移。
[0037] 三、Her-2过表达型乳腺癌骨转移
[0038] 一种lncRNA诊断组合物，由lncRNA AK043773和lncRNA EXOC7组成。
[0039] 上述诊断组合物在制备诊断预示Her-2过表达型乳腺癌骨转移的诊断试剂盒方面的应用。
[0040] 一种用于诊断预示Her-2过表达型乳腺癌骨转移的诊断试剂盒，包括lncRNA AK043773和lncRNA EXOC7的qPCR引物。
[0041] 优选地，所述的诊断试剂盒中，lncRNA AK043773的qPCR上游引物如Sequence NO.11所示，qPCR下游引物如Sequence NO.12所示。
[0042] 优选地，所述的诊断试剂盒中，lncRNA EXOC7的qPCR上游引物如Sequence NO.13所示，qPCR下游引物如Sequence NO.14所示。
[0043] 优选地，所述的诊断试剂盒中，还包括内参GAPDH的qPCR引物。
[0044] 优选地，所述的诊断试剂盒中，所述内参GAPDH的qPCR上游引物如Sequence NO.19所示，qPCR下游引物如Sequence NO.20所示。
[0045] 上述任一所述的诊断试剂盒还包括qRT-PCR所需的酶。
[0046] 一种诊断预示Her-2过表达型乳腺癌骨转移的方法，包括如下步骤：
[0047] 步骤S1，采集Her-2过表达型乳腺癌患者空腹静脉血，自然凝固后离心分离出血清；
[0048] 步骤S2，提取血清总RNA，用qRT-PCR法测定总RNA中lncRNA AK043773和lncRNA EXOC7相对于内参GAPDH的相对表达水平，依次用X1、X2表示；
[0049] 步骤S3，将X1、X2值代入二元逻辑回归方程Y＝-2.918+2.618X1+2.115X2得到Y值，Y值大于0.495预示该乳腺癌患者发生骨转移，小于0.495预示未发生骨转移。
[0050] 四、三阴性乳腺癌骨转移
[0051] 一种lncRNA诊断组合物，由lncRNA Lnc01089和lncRNA HOTAIR组成。
[0052] 上述诊断组合物在制备诊断预示三阴性型乳腺癌骨转移的诊断试剂盒方面的应用。
[0053] 一种用于诊断预示三阴性型乳腺癌骨转移的诊断试剂盒，包括lncRNA Lnc01089和lncRNA HOTAIR的qPCR引物。
[0054] 优选地，所述的诊断试剂盒中，lncRNA Lnc01089的qPCR上游引物如Sequence NO.15所示，qPCR下游引物如Sequence NO.16所示。
[0055] 优选地，所述的诊断试剂盒中，lncRNA HOTAIR的qPCR上游引物如Sequence NO.17所示，qPCR下游引物如Sequence NO.18所示。
[0056] 优选地，所述的诊断试剂盒中，还包括内参GAPDH的qPCR引物。
[0057] 优选地，所述的诊断试剂盒中，所述内参GAPDH的qPCR上游引物如Sequence NO.19所示，qPCR下游引物如Sequence NO.20所示。
[0058] 上述任一所述的诊断试剂盒还包括qRT-PCR所需的酶。
[0059] 一种诊断预示三阴性型乳腺癌骨转移的方法，包括如下步骤：
[0060] 步骤S1，采集三阴性型乳腺癌患者空腹静脉血，自然凝固后离心分离出血清；
[0061] 步骤S2，提取血清总RNA，用qRT-PCR法测定总RNA中lncRNA Lnc01089和lncRNA HOTAIR相对于内参GAPDH的相对表达水平，依次用X1、X2表示；
[0062] 步骤S3，将X1、X2值代入二元逻辑回归方程Y＝-2.537+2.793X1+2.181X2得到Y值，Y值大于0.633预示该乳腺癌患者发生骨转移，小于0.633预示未发生骨转移。
[0063] 本发明发现，血清lncRNA XLOC_004122、lncRNA SUMO1P3和lncRNA NBAT-1可以联合用于诊断预示Luminal A型乳腺癌是否骨转移，在独立验证集中诊断预示准确率达90％以上；血清lncRNA XLOC_004122、lncRNA Linc00467和lncRNA Al049452可以联合用于诊断预示Luminal B型乳腺癌是否骨转移，在独立验证集中诊断预示准确率达90％以上；血清lncRNA AK043773和lncRNA EXOC7可以联合用于诊断预示Her-2过表达型乳腺癌是否骨转移，在独立验证集中诊断预示准确率达90％以上；lncRNA Lnc01089和lncRNA HOTAIR可以联合用于诊断预示三阴性型乳腺癌是否骨转移，在独立验证集中诊断预示准确率达90％以上。使用上述血清lncRNA诊断预示不同分子亚型乳腺癌骨转移不仅准确度高，而且检测成本低、非介入性、方便快捷，极大降低患者痛苦和负担。
附图说明
[0064] 图1为测试集中lncRNA XLOC_004122、lncRNA SUMO1P3和lncRNA NBAT-1联合用于诊断区分Luminal A型乳腺癌未转移和Luminal A型乳腺癌骨转移的ROC曲线；
[0065] 图2为验证集中lncRNA XLOC_004122、lncRNA SUMO1P3和lncRNA NBAT-1联合用于诊断区分Luminal A型乳腺癌未转移和Luminal A型乳腺癌骨转移的准确率；
[0066] 图3为测试集中lncRNA XLOC_004122、lncRNA Linc00467和lncRNA Al049452联合用于诊断区分Luminal B型乳腺癌未转移和Luminal B型乳腺癌骨转移的ROC曲线；
[0067] 图4为验证集中lncRNA XLOC_004122、lncRNA Linc00467和lncRNA Al049452联合用于诊断区分Luminal B型乳腺癌未转移和Luminal B型乳腺癌骨转移的准确率；
[0068] 图5为测试集中lncRNA AK043773和lncRNA EXOC7联合用于诊断区分Her-2过表达型乳腺癌未转移和Her-2过表达型乳腺癌骨转移的ROC曲线；
[0069] 图6为验证集中lncRNA AK043773和lncRNA EXOC7联合用于诊断区分Her-2过表达型乳腺癌未转移和Her-2过表达型乳腺癌骨转移的准确率；
[0070] 图7为测试集中lncRNA Lnc01089和lncRNA HOTAIR联合用于诊断区分三阴性型乳腺癌未转移和三阴性型乳腺癌骨转移的ROC曲线；
[0071] 图8为验证集中lncRNA Lnc01089和lncRNA HOTAIR联合诊断区分三阴性型乳腺癌未转移和三阴性型乳腺癌骨转移的准确率。
具体实施方式
[0072] 下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。
[0073] 本项目所有乳腺癌样本均取自2014年9月至2017年9月来南通大学附属医院或南通市第一人民医院或南京鼓楼医院检查确诊为乳腺癌且不合并其他恶性肿瘤的患者。所有样本根据免疫组化检测分为Luminal A型、Luminal B型、Her-2过表达型和三阴性型，各种分子亚型根据是否转移分为乳腺癌未转移组和乳腺癌骨转移组，且乳腺癌骨转移组各病例均属于骨为首发远处转移部位。乳腺癌未转移组和乳腺癌骨转移组经过放射性核素骨扫描(ECT)、电子计算机断层扫描(CT)、核磁共振(MRI)、正电子发射计算机断层扫描(PET-CT)和/或组织活检等检查证实。各分子亚型中乳腺癌未转移组和骨转移组患者年龄比较无明显差异，具有可比性。最后将各组样本随机对半均分为测试集和验证集。
[0074] 所有样本分组信息及样本数经上述金标准诊断后如下表所示：
[0075]
[0076] 血清标本的收集：采集患者空腹静脉血5.0mL，自然凝固后离心(4000r/min，2860×g)7min后分离出血清，置于-80℃保存，用于检测血清中目标lncRNA的相对表达量。
[0077] 实施例1：Luminal A型乳腺癌骨转移
[0078] 一、实验样本和实验方法
[0079] 1、实验样本
[0080] Luminal A型中乳腺癌未转移组、Luminal A型乳腺癌骨转移组的测试集和验证集。
[0081] 2、RNA抽提与qRT-PCR
[0082] 应用Trizol试剂(Invitrogen，中国上海)从血清样本中提取总RNA。用NanoDrop ND-2000分光光度计(Thermo Scientific)在260nm处测定总RNA的浓度和纯度，电泳检测显示，提纯的RNA质量良好后进行后续操作。应用反转录试剂盒(Takara，中国大连)将总RNA转化为cDNA。采用SYBR Green法进行荧光定量PCR(Takara，中国大连)，并应用ABI Prism 7000荧光定量PCR系统(Agilent Technologies)进行数据收集。引物由博尚生物(中国上海)合成，lncRNA XLOC_004122引物序列：上游5’-CTGGCAGGAACACCGGGTACTT-3’，下游5’-TGACTTTTACTTAGGAGCCACTTCTTG-3’；lncRNA SUMO1P3引物序列：上游5’-CTGGAACTGGGAATGGAGGAAGA-3’，下游5’-GATTGAGAAAGGATTGAGGGAAA-3’；lncRNA NBAT-1引物序列：上游5’-CTGGGAAAGCCTGTGCTCTTGGA-3’，下游5’-GCTTCACAGTGCTGCTCAATCGT-3’；
GAPDH引物序列：上游5’-CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC-3’，下游5’-ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC-
3’。取3次测量的平均值用2-ΔΔCt法计算lncRNA XLOC_004122、lncRNA SUMO1P3和lncRNA NBAT-1的相对表达量。
GAPDH引物序列：上游5’-CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC-3’，下游5’-ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC-
3’。取3次测量的平均值用2-ΔΔCt法计算lncRNA XLOC_004122、lncRNA SUMO1P3和lncRNA NBAT-1的相对表达量。
[0083] 3、统计学处理
[0084] 数据采用SPSS 19.0进行分析。计量资料用均值±偏差表示，采用t检验，计数资料用百分率表示，采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义，并建立ROC曲线，计算曲线下面积(area under the curve，AUC)及95％可信区间。运用Logistic回归筛选变量，建立回归方程，产生一组新变量Y。对新变量及各单项指标进行ROC曲线分析。
[0085] 二、实验结果
[0086] 1、Luminal A型乳腺癌未转移和骨转移组lncRNA XLOC_004122、lncRNA SUMO1P3和lncRNA NBAT-1相对表达水平
[0087] 在测试集中，分别测定各样本中lncRNA XLOC_004122、lncRNA SUMO1P3和lncRNA NBAT-1相对表达水平。与Luminal A型乳腺癌未转移组相比，Luminal A型乳腺癌骨转移组样本中lncRNA XLOC_004122、lncRNA SUMO1P3和lncRNA NBAT-1相对表达水平显著上调，骨转移组lncRNA XLOC_004122、lncRNA SUMO1P3和lncRNA NBAT-1相对表达水平分别为未转移组相对表达水平的(1.9±0.4)倍、(2.3±0.5)倍、(2.5±0.4)倍。
[0088] 2、lncRNA XLOC_004122、lncRNA SUMO1P3或lncRNA NBAT-1相对表达水平单独用于诊断区分Luminal A型乳腺癌未转移和Luminal A型乳腺癌骨转移的ROC曲线分析[0089] ROC曲线评价法的原理：
[0090] 诊断试验的基本评价指标有敏感度、特异性等，综合评价指标有Youden指数、ROC、AUC等。对于诊断试验的评价，首先需要通过金标准知道待测样本的真实组别。对于按金标准确定的疾病组(相当于本发明中的乳腺癌骨转移组)和健康组(相当于本发明中的乳腺癌未转移组)，采用诊断试验检测的结果可以分为如下情况：
[0091] 阳性(True Positive,TP)；诊断试验检测为阳性(与金标准结果一致)；
[0092] 阴性(True Negative,TN)；诊断试验检测为阴性(与金标准结果一致)；
[0093] 假阳性(False Positive,FP)：诊断试验检测为阳性(与金标准结果不一致)；
[0094] 假阴性(False Negative,FN)：诊断试验检测为阴性(与金标准结果不一致)。
[0095] 可以用下表表示：
[0096]
[0097] 诊断试验的敏感度＝A/(A+C)；诊断试验的特异性＝D/(B+D)。通过敏感度和特异性可以得出诊断试验相对于金标准的诊断灵敏程度和特异程度。敏感度高代表将疾病例诊断为阴性的个数少，漏诊率低；特异性高代表将健康例诊断为阳性的个数少，误诊率低。
[0098] ROC曲线正是基于上述敏感度和特异性绘制出的曲线。以诊断试验中可能的诊断界值作为诊断点，根据上述表格计算出相应的敏感度和特异性。然后，以敏感度为纵坐标，1-特异性为横坐标，将各诊断点时各点的敏感度和特异性点在坐标图中标出，连接坐标点得到平滑曲线，该曲线即为ROC曲线。诊断点设置的越多越密，得到的ROC曲线就越平滑。
[0099] ROC曲线是以每一个检测结果作为可能的诊断界值，其曲线下面积AUC的大小表明了诊断试验准确度的大小。ROC曲线下面积AUC作为诊断试验真实性评价的固有准确度指标已被普遍认可，AUC为0.5时，即无诊断意义；AUC在0.5～0.7时，表示诊断准确率较低；AUC在0.7～0.9时，表示诊断准确性中等；AUC＞0.9时，表示诊断有较高的准确性。
[0100] 在SPSS 19.0中绘制lncRNA XLOC_004122、lncRNA SUMO1P3或lncRNA NBAT-1相对表达水平单独用于诊断区分Luminal A型乳腺癌未转移和Luminal A型乳腺癌骨转移的ROC曲线，AUC分别为0.601、0.697、0.729，具有较低或中等的准确性。
[0101] 3、lncRNA XLOC_004122、lncRNA SUMO1P3和lncRNA NBAT-1相对表达水平联合诊断模型的构建及用于诊断区分Luminal A型乳腺癌未转移和Luminal A型乳腺癌骨转移的ROC曲线分析
[0102] 以测试集样本中lncRNA XLOC_004122、lncRNA SUMO1P3和lncRNA NBAT-1的相对表达水平作为自变量(设X1＝lncRNA SUMO1P3相对表达水平，X2＝lncRNA NBAT-1相对表达水平，X3＝lncRNA XLOC_004122相对表达水平)，以组别(即根据金标准该样本属于骨转移组还是未转移组)作为应变量，对lncRNA XLOC_004122、lncRNA SUMO1P3和lncRNA NBAT-1在Luminal A型乳腺癌未转移和Luminal A型乳腺癌骨转移样本中的相对表达水平进行二元逻辑回归，得到二元逻辑回归方程：Y＝-2.577+2.045X1+1.956X2+1.676X3；再将各样本中lncRNA XLOC_004122、lncRNA SUMO1P3和lncRNA NBAT-1的相对表达水平代入该二元逻辑回归方程，即可得到各个样本的回归值Y，以可能的回归值Y作为诊断点，计算灵敏度和特异性，据此绘制ROC曲线(如图1所示)，AUC为0.921，具有较高的准确性。根据ROC曲线的坐标计算维登指数＝特异性+灵敏度-1，维登指数最大值时对应的Y值为能进行诊断区分Luminal A型乳腺癌未转移组和骨转移组的最佳cut-off值0.598(即诊断阈值)。
[0103] 4、验证集中验证lncRNA XLOC_004122、lncRNA SUMO1P3和lncRNA NBAT-1相对表达水平联合诊断区分Luminal A型乳腺癌未转移和Luminal A型乳腺癌骨转移的准确程度[0104] 在验证集中，将各样本lncRNA XLOC_004122、lncRNA SUMO1P3和lncRNA NBAT-1相对表达水平代入上述回归模型，得到各样本的回归值Y，Y高于诊断阈值0.598的预测为Luminal A型乳腺癌骨转移，低于诊断阈值0.598的预测为Luminal A型乳腺癌未转移，准确度为98.2％(108/110)，如图2所示。
[0105] 实施例2：Luminal B型乳腺癌骨转移
[0106] 一、实验样本和实验方法
[0107] 1、实验样本
[0108] Luminal B型中乳腺癌未转移组、Luminal B型乳腺癌骨转移组的测试集和验证集。
[0109] 2、RNA抽提与qRT-PCR
[0110] 应用Trizol试剂(Invitrogen，中国上海)从血清样本中提取总RNA。用NanoDrop ND-2000分光光度计(Thermo Scientific)在260nm处测定总RNA的浓度和纯度，电泳检测显示，提纯的RNA质量良好后进行后续操作。应用反转录试剂盒(Takara，中国大连)将总RNA转化为cDNA。采用SYBR Green法进行荧光定量PCR(Takara，中国大连)，并应用ABI Prism7000荧光定量PCR系统(Agilent Technologies)进行数据收集。引物由博尚生物(中国上海)合成，lncRNA XLOC_004122引物序列：上游5’-CTGGCAGGAACACCGGGTACTT-3’，下游5’-TGACTTTTACTTAGGAGCCACTTCTTG-3’；lncRNA Linc00467引物序列：上游5’-GCCTGGTTGTTCAGCACCTTCG-3’，下游5’-TCGGATCGGTGCTGGTTTTGGT-3’；lncRNA Al049452引物序列：上游5’-CAGTTAAACCCACAGGTGGTAGCATGAC-3’，下游5’-TAGTGGGAAAACCTAGTTTCCGACAGTT-3’；GAPDH引物序列：上游5’-CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC-
3’，下游5’-ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC-3’。取3次测量的平均值用2-ΔΔCt法计算lncRNA XLOC_004122、lncRNA Linc00467和lncRNA Al049452的相对表达量。
3’，下游5’-ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC-3’。取3次测量的平均值用2-ΔΔCt法计算lncRNA XLOC_004122、lncRNA Linc00467和lncRNA Al049452的相对表达量。
[0111] 3、统计学处理
[0112] 数据采用SPSS 19.0进行分析。计量资料用均值±偏差表示，采用t检验，计数资料用百分率表示，采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义，并建立ROC曲线，计算曲线下面积(area under the curve，AUC)及95％可信区间。运用Logistic回归筛选变量，建立回归方程，产生一组新变量Y。对新变量及各单项指标进行ROC曲线分析。
[0113] 二、实验结果
[0114] 1、Luminal B型乳腺癌未转移和骨转移组lncRNA XLOC_004122、lncRNA Linc00467和lncRNA Al049452相对表达水平
[0115] 在测试集中，分别测定各样本的lncRNA XLOC_004122、lncRNA Linc00467和lncRNA Al049452相对表达水平。与Luminal B型乳腺癌未转移组相比，Luminal B型乳腺癌骨转移组样本中lncRNA XLOC_004122、lncRNA Linc00467和lncRNA Al049452相对表达水平显著上调，骨转移组lncRNA XLOC_004122、lncRNA Linc00467和lncRNA Al049452相对表达水平分别为未转移组相对表达水平的(2.2±0.4)倍、(2.7±0.3)倍、(2.3±0.3)倍。
[0116] 2、lncRNA XLOC_004122、lncRNA Linc00467或lncRNA Al049452相对表达水平单独用于诊断区分Luminal B型乳腺癌未转移和Luminal B型乳腺癌骨转移的ROC曲线分析[0117] ROC曲线评价法的原理：
[0118] 诊断试验的基本评价指标有敏感度、特异性等，综合评价指标有Youden指数、ROC、AUC等。对于诊断试验的评价，首先需要通过金标准知道待测样本的真实组别。对于按金标准确定的疾病组(相当于本发明中的乳腺癌骨转移组)和健康组(相当于本发明中的乳腺癌未转移组)，采用诊断试验检测的结果可以分为如下情况：
[0119] 阳性(True Positive,TP)；诊断试验检测为阳性(与金标准结果一致)；
[0120] 阴性(True Negative,TN)；诊断试验检测为阴性(与金标准结果一致)；
[0121] 假阳性(False Positive,FP)：诊断试验检测为阳性(与金标准结果不一致)；
[0122] 假阴性(False Negative,FN)：诊断试验检测为阴性(与金标准结果不一致)。
[0123] 可以用下表表示：
[0124]
[0125] 诊断试验的敏感度＝A/(A+C)；诊断试验的特异性＝D/(B+D)。通过敏感度和特异性可以得出诊断试验相对于金标准的诊断灵敏程度和特异程度。敏感度高代表将疾病例诊断为阴性的个数少，漏诊率低；特异性高代表将健康例诊断为阳性的个数少，误诊率低。
[0126] ROC曲线正是基于上述敏感度和特异性绘制出的曲线。以诊断试验中可能的诊断界值作为诊断点，根据上述表格计算出相应的敏感度和特异性。然后，以敏感度为纵坐标，1-特异性为横坐标，将各诊断点时各点的敏感度和特异性点在坐标图中标出，连接坐标点得到平滑曲线，该曲线即为ROC曲线。诊断点设置的越多越密，得到的ROC曲线就越平滑。
[0127] ROC曲线是以每一个检测结果作为可能的诊断界值，其曲线下面积AUC的大小表明了诊断试验准确度的大小。ROC曲线下面积AUC作为诊断试验真实性评价的固有准确度指标已被普遍认可，AUC为0.5时，即无诊断意义；AUC在0.5～0.7时，表示诊断准确率较低；AUC在0.7～0.9时，表示诊断准确性中等；AUC＞0.9时，表示诊断有较高的准确性。
[0128] 在SPSS 19.0中绘制lncRNA XLOC_004122、lncRNA Linc00467或lncRNA Al049452相对表达水平单独用于诊断区分Luminal B型乳腺癌未转移和Luminal B型乳腺癌骨转移的ROC曲线，AUC分别为0.687、0.744、0.706，具有较低或中等的准确性。
[0129] 3、lncRNA XLOC_004122、lncRNA Linc00467和lncRNA Al049452相对表达水平联合诊断模型的构建及用于诊断区分Luminal B型乳腺癌未转移和Luminal B型乳腺癌骨转移的ROC曲线分析
[0130] 以测试集样本中lncRNA XLOC_004122、lncRNA Linc00467和lncRNA Al049452的相对表达水平作为自变量(设X1＝lncRNA Linc00467相对表达水平，X2＝lncRNA Al049452相对表达水平，X3＝lncRNA XLOC_004122相对表达水平)，以组别(即根据金标准该样本属于骨转移组还是未转移组)作为应变量，对lncRNA XLOC_004122、lncRNA Linc00467和lncRNA Al049452在Luminal B型乳腺癌未转移和Luminal B型乳腺癌骨转移样本中的相对表达水平进行二元逻辑回归，得到二元逻辑回归方程：Y＝-2.241+1.883X1+2.275X2+1.975X3；再将各样本中lncRNA XLOC_004122、lncRNA Linc00467和lncRNA Al049452的相对表达水平代入该二元逻辑回归方程，即可得到各个样本的回归值Y，以可能的回归值Y作为诊断点，计算灵敏度和特异性，据此绘制ROC曲线(如图3所示)，AUC为0.935，具有较高的准确性。根据ROC曲线的坐标计算维登指数＝特异性+灵敏度-1，维登指数最大值时对应的Y值为能进行诊断区分Luminal B型乳腺癌未转移组和骨转移组的最佳cut-off值0.607(即诊断阈值)。
[0131] 4、验证集中验证lncRNA XLOC_004122、lncRNA Linc00467和lncRNA Al049452相对表达水平联合诊断区分Luminal B型乳腺癌未转移和Luminal B型乳腺癌骨转移的准确程度
[0132] 在验证集中，将各样本lncRNA XLOC_004122、lncRNA Linc00467和lncRNA Al049452相对表达水平代入上述回归模型，得到各样本的回归值Y，Y高于诊断阈值0.607的预测为Luminal B型乳腺癌骨转移，低于诊断阈值0.607的预测为Luminal B型乳腺癌未转移，准确度为95.2％(60/63)，如图4所示。
[0133] 实施例3：Her-2过表达型乳腺癌骨转移
[0134] 一、实验样本和实验方法
[0135] 1、实验样本
[0136] Her-2过表达型中乳腺癌未转移组、Her-2过表达型乳腺癌骨转移组的测试集和验证集。
[0137] 2、RNA抽提与qRT-PCR
[0138] 应用Trizol试剂(Invitrogen，中国上海)从血清样本中提取总RNA。用NanoDrop ND-2000分光光度计(Thermo Scientific)在260nm处测定总RNA的浓度和纯度，电泳检测显示，提纯的RNA质量良好后进行后续操作。应用反转录试剂盒(Takara，中国大连)将总RNA转化为cDNA。采用SYBR Green法进行荧光定量PCR(Takara，中国大连)，并应用ABIPrism 7000荧光定量PCR系统(Agilent Technologies)进行数据收集。引物由博尚生物(中国上海)合成，lncRNA AK043773引物序列：上游5’-GTGACGCCAGGGATGGCATTA-3’，下游5’-CAGAGCCTTGCATTGGTCAGT-3’；lncRNA EXOC7引物序列：上游5’-GAGTCTGGGATCAGAGAGCAAAGG-3’，下游5’-GGTACTGTAGAAAGGCCCCGTAGG-3’；GAPDH引物序列：
上游5’-CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC-3’，下游5’-ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC-3’。取3次测量的平均值用2-ΔΔCt法计算lncRNA AK043773和lncRNA EXOC7的相对表达量。
上游5’-CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC-3’，下游5’-ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC-3’。取3次测量的平均值用2-ΔΔCt法计算lncRNA AK043773和lncRNA EXOC7的相对表达量。
[0139] 3、统计学处理
[0140] 数据采用SPSS19.0进行分析。计量资料用均值±偏差表示，采用t检验，计数资料用百分率表示，采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义，并建立ROC曲线，计算曲线下面积(area under the curve，AUC)及95％可信区间。运用Logistic回归筛选变量，建立回归方程，产生一组新变量Y。对新变量及各单项指标进行ROC曲线分析。
[0141] 二、实验结果
[0142] 1、Her-2过表达型乳腺癌未转移组和骨转移组lncRNA AK043773和lncRNA EXOC7相对表达水平
[0143] 在测试集中，分别测定各样本的lncRNA AK043773和lncRNA EXOC7相对表达水平。与Her-2过表达型乳腺癌未转移组相比，Her-2过表达型乳腺癌骨转移组样本中lncRNA AK043773和lncRNA EXOC7相对表达水平显著上调，骨转移组lncRNA AK043773和lncRNA EXOC7相对表达水平分别为未转移组的(3.3±0.5)倍、(2.6±0.3)倍。
[0144] 2、lncRNA AK043773或lncRNA EXOC7相对表达水平单独用于诊断区分Her-2过表达型乳腺癌未转移和Her-2过表达型乳腺癌骨转移的ROC曲线分析
[0145] ROC曲线评价法的原理：
[0146] 诊断试验的基本评价指标有敏感度、特异性等，综合评价指标有Youden指数、ROC、AUC等。对于诊断试验的评价，首先需要通过金标准知道待测样本的真实组别。对于按金标准确定的疾病组(相当于本发明中的乳腺癌骨转移组)和健康组(相当于本发明中的乳腺癌未转移组)，采用诊断试验检测的结果可以分为如下情况：
[0147] 阳性(True Positive,TP)；诊断试验检测为阳性(与金标准结果一致)；
[0148] 阴性(True Negative,TN)；诊断试验检测为阴性(与金标准结果一致)；
[0149] 假阳性(False Positive,FP)：诊断试验检测为阳性(与金标准结果不一致)；
[0150] 假阴性(False Negative,FN)：诊断试验检测为阴性(与金标准结果不一致)。
[0151] 可以用下表表示：
[0152]
[0153] 诊断试验的敏感度＝A/(A+C)；诊断试验的特异性＝D/(B+D)。通过敏感度和特异性可以得出诊断试验相对于金标准的诊断灵敏程度和特异程度。敏感度高代表将疾病例诊断为阴性的个数少，漏诊率低；特异性高代表将健康例诊断为阳性的个数少，误诊率低。
[0154] ROC曲线正是基于上述敏感度和特异性绘制出的曲线。以诊断试验中可能的诊断界值作为诊断点，根据上述表格计算出相应的敏感度和特异性。然后，以敏感度为纵坐标，1-特异性为横坐标，将各诊断点时各点的敏感度和特异性点在坐标图中标出，连接坐标点得到平滑曲线，该曲线即为ROC曲线。诊断点设置的越多越密，得到的ROC曲线就越平滑。
[0155] ROC曲线是以每一个检测结果作为可能的诊断界值，其曲线下面积AUC的大小表明了诊断试验准确度的大小。ROC曲线下面积AUC作为诊断试验真实性评价的固有准确度指标已被普遍认可，AUC为0.5时，即无诊断意义；AUC在0.5～0.7时，表示诊断准确率较低；AUC在0.7～0.9时，表示诊断准确性中等；AUC＞0.9时，表示诊断有较高的准确性。
[0156] 在SPSS19.0中绘制lncRNA AK043773或lncRNA EXOC7相对表达水平单独用于诊断区分Her-2过表达型乳腺癌未转移和Her-2过表达型乳腺癌骨转移的ROC曲线，AUC分别为0.762、0.717，具有中等的准确性。
[0157] 3、lncRNA AK043773和lncRNA EXOC7相对表达水平联合诊断模型的构建及用于诊断区分Her-2过表达型乳腺癌未转移和Her-2过表达型乳腺癌骨转移的ROC曲线分析[0158] 以测试集样本中lncRNA AK043773和lncRNA EXOC7的相对表达水平作为自变量(设X1＝lncRNA AK043773相对表达水平，X2＝lncRNA EXOC7相对表达水平)，以组别(即根据金标准该样本属于骨转移组还是未转移组)作为应变量，对lncRNA AK043773和lncRNA EXOC7在Her-2过表达型乳腺癌未转移和Her-2过表达型乳腺癌骨转移样本中的相对表达水平进行二元逻辑回归，得到二元逻辑回归方程：Y＝-2.918+2.618X1+2.115X2；再将各样本中lncRNA AK043773和lncRNA EXOC7的相对表达水平代入该二元逻辑回归方程，即可得到各个样本的回归值Y，以可能的回归值Y作为诊断点，计算灵敏度和特异性，据此绘制ROC曲线(如图5所示)，AUC为0.939，具有较高的准确性。进一步根据ROC曲线的坐标计算维登指数＝特异性+灵敏度-1，维登指数最大值时对应的Y值为能诊断区分Her-2过表达型乳腺癌未转移组和骨转移组的最佳cut-off值0.495(即诊断阈值)。
[0159] 4、验证集中验证lncRNA AK043773和lncRNA EXOC7相对表达水平联合诊断区分Her-2过表达型乳腺癌未转移和Her-2过表达型乳腺癌骨转移的准确程度
[0160] 在验证集中，将各样本lncRNA AK043773和EXOC7相对表达水平代入上述回归模型，得到各样本的回归值Y，Y高于诊断阈值0.495的预测为Her-2过表达型乳腺癌骨转移，低于诊断阈值0.495的预测为Her-2过表达型乳腺癌未转移，准确度为91.1％(51/56)，如图6。
[0161] 实施例4：三阴性乳腺癌骨转移
[0162] 一、实验样本和实验方法
[0163] 1、实验样本
[0164] 三阴性型中乳腺癌未转移组、三阴性型乳腺癌骨转移组的测试集和验证集。
[0165] 2、RNA抽提与qRT-PCR
[0166] 应用Trizol试剂(Invitrogen，中国上海)从血清样本中提取总RNA。用NanoDrop ND-2000分光光度计(Thermo Scientific)在260nm处测定总RNA的浓度和纯度，电泳检测显示，提纯的RNA质量良好后进行后续操作。应用反转录试剂盒(Takara，中国大连)将总RNA转化为cDNA。采用SYBR Green法进行荧光定量PCR(Takara，中国大连)，并应用ABI Prism 7000荧光定量PCR系统(Agilent Technologies)进行数据收集。引物由博尚生物(中国上海)合成，lncRNA Lnc01089引物序列：上游5’-TCGCTGGGTTGCTCTGCTTC-3’，下游5’-GTCAGGAGGTCACAGTCTTAGGG-3’；lncRNA HOTAIR引物序列：上游5’-
CGTGGAAAGATCCAAATGGGACCA-3’，下游5’-AGCCTAGGAATCAGCACGAAGCAAA-3’；GAPDH引物序列：上游5’-CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC-3’，下游5’-ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC-3’。取3次测量的平均值用2-ΔΔCt法计算lncRNA Lnc01089和lncRNA HOTAIR的相对表达量。
CGTGGAAAGATCCAAATGGGACCA-3’，下游5’-AGCCTAGGAATCAGCACGAAGCAAA-3’；GAPDH引物序列：上游5’-CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC-3’，下游5’-ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC-3’。取3次测量的平均值用2-ΔΔCt法计算lncRNA Lnc01089和lncRNA HOTAIR的相对表达量。
[0167] 3、统计学处理
[0168] 数据采用SPSS 19.0进行分析。计量资料用均值±偏差表示，采用t检验，计数资料用百分率表示，采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义，并建立ROC曲线，计算曲线下面积(area under the curve，AUC)及95％可信区间。运用Logistic回归筛选变量，建立回归方程，产生一组新变量Y。对新变量及各单项指标进行ROC曲线分析。
[0169] 二、实验结果
[0170] 1、三阴性型乳腺癌未转移组和骨转移组lncRNA Lnc01089和HOTAIR相对表达水平[0171] 在测试集中，分别测定各样本的lncRNA Lnc01089和lncRNA HOTAIR相对表达水平。与三阴性型乳腺癌未转移组相比，三阴性型乳腺癌骨转移组样本中lncRNA Lnc01089和lncRNA HOTAIR相对表达水平显著上调，骨转移组lncRNA Lnc01089和lncRNA HOTAIR相对表达水平分别为未转移组的(3.5±0.6)倍、(3.2±0.5)倍。
[0172] 2、lncRNA Lnc01089或lncRNA HOTAIR相对表达水平单独用于诊断区分三阴性型乳腺癌未转移和三阴性型乳腺癌骨转移的ROC曲线分析
[0173] ROC曲线评价法的原理：
[0174] 诊断试验的基本评价指标有敏感度、特异性等，综合评价指标有Youden指数、ROC、AUC等。对于诊断试验的评价，首先需要通过金标准知道待测样本的真实组别。对于按金标准确定的疾病组(相当于本发明中的乳腺癌骨转移组)和健康组(相当于本发明中的乳腺癌未转移组)，采用诊断试验检测的结果可以分为如下情况：
[0175] 阳性(True Positive,TP)；诊断试验检测为阳性(与金标准结果一致)；
[0176] 阴性(True Negative,TN)；诊断试验检测为阴性(与金标准结果一致)；
[0177] 假阳性(False Positive,FP)：诊断试验检测为阳性(与金标准结果不一致)；
[0178] 假阴性(False Negative,FN)：诊断试验检测为阴性(与金标准结果不一致)。
[0179] 可以用下表表示：
[0180]
[0181] 诊断试验的敏感度＝A/(A+C)；诊断试验的特异性＝D/(B+D)。通过敏感度和特异性可以得出诊断试验相对于金标准的诊断灵敏程度和特异程度。敏感度高代表将疾病例诊断为阴性的个数少，漏诊率低；特异性高代表将健康例诊断为阳性的个数少，误诊率低。
[0182] ROC曲线正是基于上述敏感度和特异性绘制出的曲线。以诊断试验中可能的诊断界值作为诊断点，根据上述表格计算出相应的敏感度和特异性。然后，以敏感度为纵坐标，1-特异性为横坐标，将各诊断点时各点的敏感度和特异性点在坐标图中标出，连接坐标点得到平滑曲线，该曲线即为ROC曲线。诊断点设置的越多越密，得到的ROC曲线就越平滑。
[0183] ROC曲线是以每一个检测结果作为可能的诊断界值，其曲线下面积AUC的大小表明了诊断试验准确度的大小。ROC曲线下面积AUC作为诊断试验真实性评价的固有准确度指标已被普遍认可，AUC为0.5时，即无诊断意义；AUC在0.5～0.7时，表示诊断准确率较低；AUC在0.7～0.9时，表示诊断准确性中等；AUC＞0.9时，表示诊断有较高的准确性。
[0184] 在SPSS 19.0中绘制lncRNA Lnc01089或lncRNA HOTAIR相对表达水平单独用于诊断区分三阴性型乳腺癌未转移和三阴性型乳腺癌骨转移的ROC曲线，AUC分别为0.755、0.732，均具有中等的准确性。
[0185] 3、lncRNA Lnc01089和lncRNA HOTAIR相对表达水平联合诊断模型的构建及用于诊断区分三阴性型乳腺癌未转移和三阴性型乳腺癌骨转移的ROC曲线分析
[0186] 以测试集样本中lncRNA Lnc01089和lncRNA HOTAIR的相对表达水平作为自变量(设X1＝lncRNA Lnc01089相对表达水平，X2＝lncRNA HOTAIR相对表达水平)，以组别(即根据金标准该样本属于骨转移组还是未转移组)作为应变量，对lncRNA Lnc01089和lncRNA HOTAIR在三阴性型乳腺癌未转移和三阴性型乳腺癌骨转移样本中的相对表达水平进行二元逻辑回归，得到二元逻辑回归方程：Y＝-2.537+2.793X1+2.181X2；再将各样本中lncRNA Lnc01089和lncRNA HOTAIR的相对表达水平代入该二元逻辑回归方程，即可得到各个样本的回归值Y，以可能的回归值Y作为诊断点，计算灵敏度和特异性，据此绘制ROC曲线(如图7所示)，AUC为0.948，具有较高的准确性。进一步根据ROC曲线的坐标计算维登指数＝特异性+灵敏度-1，维登指数最大值时对应的Y值为能进行诊断区分三阴性型乳腺癌未转移组和骨转移组的最佳cut-off值0.633(即诊断阈值)。
[0187] 4、验证集中验证lncRNA Lnc01089和lncRNA HOTAIR相对表达水平联合诊断区分三阴性型乳腺癌未转移和三阴性型乳腺癌骨转移的准确程度
[0188] 在验证集中，将各样本lncRNA Lnc01089和lncRNA HOTAIR相对表达水平代入上述回归模型，得到各样本的回归值Y，Y高于诊断阈值0.633的预测为三阴性型乳腺癌骨转移，低于诊断阈值0.633的预测为三阴性型乳腺癌未转移，准确度为92.9％(52/56)，如图8。
[0189] 实施例5：诊断预示不同亚型乳腺癌骨转移的诊断试剂盒
[0190] 1、Luminal A型乳腺癌骨转移诊断预示试剂盒
[0191] 包括lncRNA XLOC_004122、lncRNA SUMO1P3和lncRNA NBAT-1的qPCR引物：lncRNA XLOC_004122的qPCR上游引物如Sequence NO.1所示，qPCR下游引物如Sequence NO.2所示；lncRNA SUMO1P3的qPCR上游引物如Sequence NO.3所示，qPCR下游引物如Sequence NO.4所示；lncRNA NBAT-1的qPCR上游引物如Sequence NO.5所示，qPCR下游引物如Sequence NO.6所示。还包括内参GAPDH的qPCR引物：内参GAPDH的qPCR上游引物如Sequence NO.19所示，qPCR下游引物如Sequence NO.20所示。
[0192] 还包括qRT-PCR所需的酶等其他qRT-PCR试剂。
[0193] 2、Luminal B型乳腺癌骨转移诊断预示试剂盒
[0194] 包括lncRNA XLOC_004122、lncRNA Linc00467和lncRNA Al049452的qPCR引物：lncRNA XLOC_004122的qPCR上游引物如Sequence NO.1所示，qPCR下游引物如Sequence NO.2所示；lncRNA Linc00467的qPCR上游引物如Sequence NO.7所示，qPCR下游引物如Sequence NO.8所示；lncRNA Al049452的qPCR上游引物如Sequence NO.9所示，qPCR下游引物如Sequence NO.10所示。还包括内参GAPDH的qPCR引物：内参GAPDH的qPCR上游引物如Sequence NO.19所示，qPCR下游引物如Sequence NO.20所示。
[0195] 还包括qRT-PCR所需的酶等其他qRT-PCR试剂。
[0196] 3、Her-2过表达型乳腺癌骨转移诊断预示试剂盒
[0197] 包括lncRNA AK043773和lncRNA EXOC7的qPCR引物：lncRNA AK043773的qPCR上游引物如Sequence NO.11所示，qPCR下游引物如Sequence NO.12所示；lncRNA EXOC7的qPCR上游引物如Sequence NO.13所示，qPCR下游引物如Sequence NO.14所示。还包括内参GAPDH的qPCR引物：内参GAPDH的qPCR上游引物如Sequence NO.19所示，qPCR下游引物如Sequence NO.20所示。
[0198] 还包括qRT-PCR所需的酶等其他qRT-PCR试剂。
[0199] 4、三阴性型乳腺癌骨转移诊断预示试剂盒
[0200] 包括lncRNA Lnc01089和lncRNA HOTAIR的qPCR引物：lncRNA Lnc01089的qPCR上游引物如Sequence NO.15所示，qPCR下游引物如Sequence NO.16所示；lncRNA HOTAIR的qPCR上游引物如Sequence NO.17所示，qPCR下游引物如Sequence NO.18所示。还包括内参GAPDH的qPCR引物：内参GAPDH的qPCR上游引物如Sequence NO.19所示，qPCR下游引物如Sequence NO.20所示。
[0201] 还包括qRT-PCR所需的酶等其他qRT-PCR试剂。
[0202] 综上可知，本发明发现，血清lncRNA XLOC_004122、lncRNA SUMO1P3和lncRNA NBAT-1可以联合用于诊断预示Luminal A型乳腺癌是否骨转移，在独立验证集中诊断预示准确率达90％以上；血清lncRNA XLOC_004122、lncRNA Linc00467和lncRNA Al049452可以联合用于诊断预示Luminal B型乳腺癌是否骨转移，在独立验证集中诊断预示准确率达90％以上；血清lncRNA AK043773和lncRNA EXOC7可以联合用于诊断预示Her-2过表达型乳腺癌是否骨转移，在独立验证集中诊断预示准确率达90％以上；lncRNA Lnc01089和lncRNA HOTAIR可以联合用于诊断预示三阴性型乳腺癌是否骨转移，在独立验证集中诊断预示准确率达90％以上。使用上述血清lncRNA诊断预示不同分子亚型乳腺癌骨转移不仅准确度高，而且检测成本低、非介入性、方便快捷，极大降低患者痛苦和负担。
[0203] 上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。