迷你蝴蝶兰脱毒苗的组织培养方法

摘要

本分案申请涉及迷你蝴蝶兰脱毒苗的组织培养方法。本发明采用如下技术方案，迷你蝴蝶兰脱毒苗的组织培养方法包括如下步骤：选取迷你蝴蝶兰无菌试管苗进行热处理，从热处理后的无菌试管苗上取茎尖进行初代培养丛生芽，在初代培养的基础上进行继代培养，将成活的丛生芽进行病毒检测，挑选出病毒阴性丛生芽进行继代培养，最后进行生根培养。本发明采用组织培养技术进行苗木繁育，可以大大加快迷你蝴蝶兰的繁育速度。苗木质量高，由此提高观赏性：采用组织培养技术可以脱除迷你蝴蝶兰的主要病毒，消除了病毒的危害状，提高了迷你蝴蝶兰的观赏性。

权利要求

1.迷你蝴蝶兰脱毒苗的组织培养方法，其特征在于，包括如下步骤：选取迷你蝴蝶兰无菌试管苗进行热处理，从热处理后的无菌试管苗上取大小为0.5-1.0mm茎尖进行初代培养、继代培养，将成活的丛生芽进行病毒检测，挑选出病毒阴性丛生芽进行继代培养，最后进行生根培养，其中，初代培养基中6-BA浓度为3.0-4.0mg/L、NAA浓度为0.3-0.5mg/L、香蕉泥为

25-35g/L、活性炭为2-4 g/L；继代培养基中，6-BA浓度为7.0-9.0mg/L、NAA浓度为0.2-

0.4mg/L、香蕉泥为25-35g/L、活性炭为2-4 g/L；生根培养基中6-BA浓度为3.5-4.5mg/L、NAA浓度为0.7-0.9mg/L、香蕉泥为25-35g/L、活性炭为2-4 g/L；初代培养基中还加入浓度为1-5/L的碳酸氢钠和浓度为20-40mg/L的病毒唑；首先进行两周暗培养，然后于温度25℃，光照强度2000lx，光照周期14 h/d，培养四周；病毒为ORSV和CymMV。

2.根据权利要求1所述的迷你蝴蝶兰脱毒苗的组织培养方法，其特征在于，所述继代培养和生根培养的条件为：温度25℃，光照强度2000lx，光照周期14 h/d；所述迷你蝴蝶兰无菌试管苗热处理的具体方法为：开始处理时温度为30℃，每隔一天的延续期后增加1℃继续热处理培养迷你蝴蝶兰，利用逐步升高温度的方法使迷你蝴蝶兰适应热处理的温度条件，至温度上限38℃，到达38℃之后，继续培养4周，湿度保持80％左右，光照条件为每日16h，光照强度3000Lux。

说明书

迷你蝴蝶兰脱毒苗的组织培养方法

[0001] 本申请为申请号为2017107297756、申请日为2017年8月23日、发明名称为“迷你蝴蝶兰脱毒苗的组织培养方法”的分案申请。

技术领域

[0002] 本发明属于生物技术领域，具体涉及迷你蝴蝶兰脱毒苗的组织培养方法。

背景技术

[0003] 迷你蝴蝶兰又称小花蝴蝶兰，是蝴蝶兰Phalaenopsis aphrodita Rchb.F.的变种，通常指的是高度在20-25cm，可放置于2寸盆器中的蝴蝶兰。由于其体型小，方便包装，在国外经常被用作精致的礼品。由于迷你蝴蝶兰的栽培周期短，自组培瓶取出至可催梗阶段只需7-9个月，资金回收快，因此成为兰花产业入门者的首选。

[0004] 尽管通过有性繁殖的种子苗几乎不携带病毒，且具有植株生长速度快等优势，但是由于其植株高低不齐且花色不一，因此商品性状较差，生产数量逐年大幅度降低。而通过组织培养技术(无性繁殖)生产的分生苗，因其植株和花色高度一致，逐渐替代种子苗，目前已占据市场份额的90％以上。但长期的无性繁殖必然会导致病毒的积累，致使品种日益退化，品质下降。兰花病毒一直是严重危害蝴蝶兰品质的一类重要病害，其寄主范围广泛，易传染，防治困难。目前世界上已经报道的兰花病毒有25种，其中以建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus，CymMV)和齿兰环斑病毒(Odontoglossum Ring Spot Virus，ORSV)发生最为普遍，危害也最严重。这两种病毒能使蝴蝶兰叶片形成褪绿条纹、凹陷灰白斑或坏死环斑，导致植株生长不良，花少、花期缩短，并且经常复合感染，危害加剧，使蝴蝶兰的观赏价值和经济价值大幅度下降。为避免蝴蝶兰病毒大规模发生，在亲本分生繁殖之前必须经过病毒检测，蝴蝶兰病毒也是苗木出口检疫的必检对象。为了提高蝴蝶兰瓶苗的竞争力，清除ORSV和CymMV以及更多的病毒，培育优质脱毒苗是蝴蝶兰生产发展的必然趋势。

发明内容

[0005] 为弥补现有技术的不足，本发明提供一种迷你蝴蝶兰脱毒苗的组织培养方法，该方法获得苗木质量高，脱出迷你蝴蝶兰的主要病毒，消除了病毒的危害状，提高了迷你蝴蝶兰的观赏性。

[0006] 本发明采用如下技术方案，迷你蝴蝶兰脱毒苗的组织培养方法包括如下步骤：选取迷你蝴蝶兰无菌试管苗进行热处理，从热处理后的无菌试管苗上取茎尖进行初代培养丛生芽，在初代培养的基础上进行继代培养，将成活的丛生芽进行病毒检测，挑选出病毒阴性丛生芽进行继代培养，最后进行生根培养。其中，初代培养基中6-BA浓度为3.0-4.0mg/L、NAA浓度为0.3-0.5mg/L、香蕉泥为25-35g/L、活性炭为2-4g/L；继代培养基中，6-BA浓度为7.0-9.0mg/L、NAA浓度为0.2-0.4mg/L、香蕉泥为25-35g/L、活性炭为2-4g/L；生根培养基中
6-BA浓度为3.5-4.5mg/L、NAA浓度为0.7-0.9mg/L、香蕉泥为25-35g/L、活性炭为2-4g/L。

[0007] 优选的，所取迷你蝴蝶兰茎尖大小为0.5-1.0mm。

[0008] 优选的，初代培养基中还加入浓度为1-5/L的碳酸氢钠和浓度为20-40mg/L的病毒唑。

[0009] 优选的，所述初代培养的条件为：首先进行两周暗培养，然后于温度25℃，光照强度2000lx，光照周期14h/d，培养四周。

[0010] 由于植物病毒是通过输导组织在植物体内进行传播的，而植物的分生组织由于分裂很快且还没有形成输导组织，因此分生组织内不存在病毒，本发明采取抑制和钝化病毒的热处理和化学试剂处理外植体，经过不同阶段的培养，通过分子水平上的病毒检测技术，最终可以获得脱除主要病毒的迷你蝴蝶兰苗木，使迷你蝴蝶兰在无主要病毒的情况下进行快速繁殖。

[0011] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：由于采用组织培养技术进行苗木繁育，可以大大加快迷你蝴蝶兰的繁育速度。苗木质量高，由此提高观赏性：采用组织培养技术可以脱出迷你蝴蝶兰的主要病毒，消除了病毒的危害状，提高了迷你蝴蝶兰的观赏性。

附图说明

[0012] 图1为受蝴蝶兰病毒危害叶片图；其中，左图为褪绿条纹，右图为坏死环斑；

[0013] 图2为迷你蝴蝶兰CyMV RT-PCR产物电泳图；其中，泳道1，2，3，4代表检测结果为阳性，泳道5，6代表检测结果为阴性；431bp为CyMV特异扩增带；

[0014] 图3为迷你蝴蝶兰ORSV RT-PCR产物电泳图，其中，泳道1，2，3，4代表检测结果为阴性，泳道5，6，7，8代表检测结果为阳性；332bp为ORSV特异扩增带。

具体实施方式

[0015] 下面通过附图和具体实施例详述本发明，但不限制本发明的保护范围。如无特殊说明，本发明所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从化学公司购买。

[0016] 实施例1

[0017] 取带毒的迷你蝴蝶兰无菌试管苗，将其置于变温光照培养箱中。开始处理时温度为30℃，每隔一天的延续期后增加1℃继续热处理培养迷你蝴蝶兰，利用逐步升高温度的方法使迷你蝴蝶兰适应热处理的温度条件，至温度上限38℃。到达38℃之后，继续培养4周，湿度保持80％左右，光照条件为每日16h，光照强度3000Lux。将热处理4周后仍健康的迷你蝴蝶兰无菌苗，在解剖镜下剥取茎尖生长点，茎尖大小为0.5mm。将其接种在初代培养基1/2MS+6-BA 3.0mg/L+NAA 0.3mg/L+琼脂8g/L+蔗糖30g/L+香蕉泥30g/L+活性炭2g/L上，在初代培养基中加入病毒唑和碳酸氢钠，病毒唑使用的浓度为20mg/L，碳酸氢钠的使用浓度为1.0g/L。先进行两周的暗培养后，继续按培养条件：温度25℃，光照强度2000lx，光照周期
14h/d，培养4周，将成活的茎尖丛生芽继续接种在继代培养基(1/2MS+6-BA 8.0mg/L+NAA 
0.2mg/L+琼脂8g/L+蔗糖30g/L+香蕉泥30g/L+活性炭2g/L)上，将成活的丛生芽进行扩大化培养，培养条件为：温度25℃，光照强度2000lx，光照周期14h/d，然后进行病毒检测。对无毒的无根苗进行生根培养，所用生根培养基为1/2MS+6-BA 4.0mg/L+NAA 0.8mg/L+琼脂8g/L+蔗糖30g/L+香蕉泥30g/L+活性炭2g/L，生根培养条件为：温度25℃，光照强度2000lx，光照周期14h/d。

[0018] 实施例2

[0019] 迷你蝴蝶兰处理同实施例1。在解剖镜下剥取茎尖生长点，茎尖大小为0.8mm。将其接种在初代培养基1/2MS+6-BA 3.5mg/L+0.4mg/L NAA琼脂8g/L+蔗糖30g/L+香蕉泥35g/L+活性炭3g/L上，在初代培养基中加入病毒唑和碳酸氢钠，病毒唑使用的浓度为30mg/L，碳酸氢钠的使用浓度为3.0g/L。先进行两周的暗培养后，继续按培养条件：温度25℃，光照强度2000lx，光照周期14h/d，培养4周，将成活的茎尖丛生芽继续接种在继代培养基(1/2MS+6-BA 7.0mg/L+NAA 0.3mg/L+琼脂8g/L+蔗糖30g/L+香蕉泥35g/L+活性炭3g/L)上，将成活的丛生芽进行扩大化培养，培养条件为：温度25℃，光照强度2000lx，光照周期14h/d，然后进行病毒检测。对无毒的无根苗进行生根培养，所用生根培养基为1/2MS+6-BA 4.5mg/L+NAA 
0.9mg/L+琼脂8g/L+蔗糖30g/L+香蕉泥35g/L+活性炭3g/L，生根培养条件为：温度25℃，光照强度2000lx，光照周期14h/d。

[0020] 实施例3

[0021] 迷你蝴蝶兰处理同实施例1。在解剖镜下剥取茎尖生长点，茎尖大小为1.0mm。将其接种在初代培养基1/2MS+6-BA 4.0mg/L+NAA 0.5mg/L+琼脂8g/L+蔗糖30g/L+香蕉泥25g/L+活性炭4g/L上，在初代培养基中加入病毒唑和碳酸氢钠，病毒唑使用的浓度为40mg/L，碳酸氢钠的使用浓度为5.0g/L。先进行两周的暗培养后，继续按培养条件：温度25℃，光照强度2000lx，光照周期14h/d，培养4周，将成活的茎尖丛生芽继续接种在继代培养基(1/2MS+6-BA 9.0mg/L+NAA 0.4mg/L+琼脂8g/L+蔗糖30g/L+香蕉泥25g/L+活性炭4g/L)上，将成活的丛生芽进行扩大化培养，培养条件为：温度25℃，光照强度2000lx，光照周期14h/d，然后进行病毒检测。对无毒的无根苗进行生根培养，所用生根培养基为1/2MS+6-BA 3.5mg/L+NAA 0.7mg/L+琼脂8g/L+蔗糖30g/L+香蕉泥25g/L+活性炭4g/L，生根培养条件为：温度25℃，光照强度2000lx，光照周期14h/d。

[0022] 试验例

[0023] 蝴蝶兰主要病毒RT-PCR检测结果：

[0024] 一.迷你蝴蝶兰总RNA的提取：

[0025] (1)取500mg迷你蝴蝶兰组培苗幼嫩叶片，加液氮研磨成粉末状，迅速移入1.5mL Eppendorf管中，加入600μL RNA提取缓冲液(pH8.0)，1μL RNasin混匀。4℃，12000rpm，离心15min。

[0026] (2)取上清，加入等体积氯仿：异戊醇(24:1)溶液，混匀，4℃，12000rpm，离心10min。重复1～2次，去除蛋白层。

[0027] (3)取水相，加2.5倍体积的无水乙醇及1/10体积3mol/L NaAc(pH5.3)，混匀。-20℃置2h。取出后，4℃，12000rpm，离心15min。

[0028] (4)弃上清，用200μL 70％无水乙醇洗沉淀，4℃，12000rpm，5min，清洗多次，至沉淀为纯白色。

[0029] (5)室温下干燥后15min左右，溶于30μL 1‰DEPC水中，-20℃冰箱保存。

[0030] 二.CyMV RT-PCR检测体系：

[0031] 1.RT优化体系及程序：

[0032] (1)反应体系：

[0033] 5×Buffer 2.0μl；dNTPs 0.25mmol/L；RNasin 8U；引物CyMV-RP 1μmol/L；总RNA 1.0μl；Mo-MLV RTase 50U。用DEPC水补足10μl。

[0034] (2)反应程序：37℃ 2h；95℃ 5min灭活Mo-MLVRTase；反应结束后4℃保存。

[0035] 2.PCR优化体系及程序：

[0036] (1)反应体系：

[0037] 10×Buffer 2.5μl；dNTPs 0.2mmol/L；MgCl2 1.5mmol/L；CyMV-FP 0.8μmol/L；CyMV-RP 0.8μmol/L；TagE 1U；RT产物10μl。用DEPC水补足25μl。

[0038] (2)反应程序：94℃ 1min；55℃ 2min；72℃ 2min；循环35次，最后一轮延伸5min，4℃保存。

[0039] 三.ORSVRT-PCR检测体系：

[0040] 1.RT体系：5×Buffer 1.0μL；dNTPs 0.25mmol/L；RNasin 8U；引物ORSV-RP 2μmol/L；总RNA 1.0μL；Mo-MLV RTase 50U。用1‰DEPC水补足10μL。

[0041] 按下列反应程序进行RT：37℃ 2h；95℃ 5min灭活MO-MLV RTase；反应结束后4℃保存。

[0042] 2.PCR扩增体系如下：10×Buffer 2.0μL；dNTPs 0.2mmol/L；MgCl2 1.5mmol/L；ORSV-FP 0.8μmol/L；ORSV-RP 0.8μmol/L；TagE 0.5U；RT产物10μL。用1‰DEPC水补足25μL。

[0043] 反应程序为：94℃ 1min；55℃ 2min；72℃ 2min；循环35次，最后一轮延伸5min，4℃保存。

[0044] 以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。