一株卷曲乳杆菌及其应用

摘要

本发明公开了一株卷曲乳杆菌及其应用。本发明所提供的卷曲乳杆菌具体为卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)L49，它在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.15154。实验证明，卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)L49具有抑菌作用，对病原真菌白念珠菌具有较好的抑制活性，可用于调节妇女生殖道微生态平衡、预防妇女生殖道疾病、降低妇患女生殖道疾病机率，对女性生殖健康，人口优生优育以及家庭社会和谐稳定都具有非常重要的意义。

权利要求

1.卷曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus）L49，它在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.15154。

2.一种菌剂，它的活性成分为权利要求1所述的卷曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus）L49。

3.权利要求1所述的卷曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus）L49的发酵液或发酵液的过滤液。

4.权利要求1所述的卷曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus）L49的菌悬液。

5.培养有权利要求1所述的卷曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus）L49的培养液。

6.权利要求1所述的卷曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus）L49或权利要求2所述的菌剂或权利要求3所述的发酵液或发酵液的过滤液或权利要求4所述的菌悬液或权利要求5所述的培养液在制备具有抗白念珠菌和/或抑白念珠菌功能的产品中的应用。

7.权利要求1所述的卷曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus）L49或权利要求2所述的菌剂或权利要求3所述的发酵液或发酵液的过滤液或权利要求4所述的菌悬液或权利要求5所述的培养液在制备用于调节妇女生殖道微生态平衡的产品中的应用。

8.权利要求1所述的卷曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus）L49或权利要求2所述的菌剂或权利要求3所述的发酵液或发酵液的过滤液或权利要求4所述的菌悬液或权利要求5所述的培养液在制备用于预防和/或治疗妇女生殖道感染和/或性传播疾病的产品中的应用。

9.权利要求1所述的卷曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus）L49或权利要求2所述的菌剂在如下任一中的应用：（d1）生产乳酸；

（d2）制备用于生产乳酸的产品。

10.权利要求1所述的卷曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus）L49或权利要求2所述的菌剂在制备用于粘附宫颈癌细胞的产品中的应用。

说明书

一株卷曲乳杆菌及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及微生物领域，具体涉及一株卷曲乳杆菌及其应用。

背景技术

[0002] 目前女性生殖道感染已成为全球危害严重的重要传染病之一，每年全球有数百万女性患有此疾病。其中细菌性生殖道病(bacterial vaginosis,BV)和外阴生殖道念珠菌病(vulvovaginal candidiasis，VVC)在众多感染中最为普遍，发病率约75％，且治疗棘手易复发，对患者身心健康危害较大，严重时影响日常工作或生活，或导致不育、早产、宫颈癌、HIV感染等严重并发症。另外随着抗生素抗性菌株的出现，使得治疗生殖道感染疾病越来越困难，改良药物和新治疗途径的研发显得尤为重要。因此，采用具益生功能的微生态制剂例如乳杆菌活菌制剂来恢复生殖道乳杆菌优势、预防和治疗生殖道感染等疾病已成为一个很有潜力的应用方向。

[0003] 卷曲乳杆菌是健康妇女生殖道的一种占主导地位的乳杆菌，对维持生殖道菌群平衡及健康起关键作用。它能抑制多种生殖道病原细菌和真菌，例如加德纳氏菌和白念珠菌等，也能降低HIV感染和性传播疾病的风险，是一种理想的生殖道益生菌。了解卷曲乳杆菌的一些益生特性，例如产酸能力，粘附能力，发酵碳水化合物的能力以及对生殖道病原真菌的抑制能力，并且将其应用到生殖道疾病的治疗和预防中，对女性生殖健康，人口优生优育以及家庭社会和谐稳定都具有非常重要的意义。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一株健康女性生殖道来源的卷曲乳杆菌及其应用。

[0005] 本发明所提供的卷曲乳杆菌具体为卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)L49，该菌株已于2018年01月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.15154。

[0006] 本发明还提供了一种菌剂。

[0007] 本发明所提供的菌剂的活性成分为所述卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)L49。

[0008] 所述卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)L49的发酵液或发酵液的过滤液也属于本发明的保护范围。

[0009] 在本发明的一个实施例中，所述发酵液具体为将所述卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)L49接种于MRS培养基中，在37℃静置培养后得到的发酵液。其中，培养时间最好在15小时以上。

[0010] 所述卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)L49的代谢物也属于本发明的保护范围。

[0011] 所述卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)L49的菌悬液也属于本发明的保护范围。

[0012] 培养有所述卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)L49的培养液也属于本发明的保护范围。

[0013] 所述卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)L49或所述菌剂或所述发酵液或发酵液的过滤液或代谢物或菌悬液或培养液在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：

[0014] (a1)抗菌和/或抑菌；

[0015] (a2)制备具有抗菌和/或抑菌功能的产品。

[0016] 其中，所述抗菌是指采用化学或物理方法杀灭菌或妨碍菌生长繁殖及其活性的过程；包括杀菌、抑菌。所述抑菌是指采用化学或物理方法抑制菌或妨碍菌生长繁殖及其活性的过程。

[0017] 在本发明中，所述菌为真菌。

[0018] 更加具体的，所述真菌为白念珠菌。

[0019] 在本发明的一个实施例中，所述抑菌具体体现为抑制白念珠菌的生长和/或抑制白念珠菌菌丝形成。

[0020] 所述卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)L49或所述菌剂或所述发酵液或发酵液的过滤液或代谢物或菌悬液或培养液在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：

[0021] (b1)调节妇女生殖道微生态平衡；

[0022] (b2)制备用于调节妇女生殖道微生态平衡的产品。

[0023] 所述卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)L49或所述菌剂或所述发酵液或发酵液的过滤液或代谢物或菌悬液或培养液在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：

[0024] (c1)预防和/或治疗妇女生殖道感染和/或性传播疾病；

[0025] (c2)制备用于预防和/或治疗妇女生殖道感染和/或性传播疾病的产品。

[0026] 所述卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)L49或所述菌剂在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：

[0027] (d1)生产乳酸；

[0028] (d2)制备用于生产乳酸的产品。

[0029] 其中，所述乳酸主要为D型乳酸。

[0030] 所述卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)L49或所述菌剂在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：

[0031] (e1)粘附宫颈癌细胞；

[0032] (e2)制备用于粘附宫颈癌细胞的产品。

[0033] 在本发明的一个实施例中，所述宫颈癌细胞具体为Hela细胞。

[0034] 本发明提供了一株卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)L49。实验证明，卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)L49具有抑菌作用，对病原真菌白念珠菌具有较好的抑制活性，可用于调节妇女生殖道微生态平衡、预防妇女生殖道疾病、降低妇患女生殖道疾病机率，对女性生殖健康，人口优生优育以及家庭社会和谐稳定都具有非常重要的意义。

[0035] 保藏说明

[0036] 菌种名称：卷曲乳杆菌

[0037] 拉丁名：Lactobacillus crispatus

[0038] 菌株编号：L49

[0039] 保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

[0040] 保藏机构简称：CGMCC

[0041] 地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

[0042] 保藏日期：2018年01月03日

[0043] 保藏中心登记入册编号：CGMCC No.15154

附图说明

[0044] 图1为L49菌株发酵液乳酸含量分析结果。A为L49菌株产乳酸较快较多，在发酵15小时左右产酸量达到最大，约为150mM；B为L49菌株产较多的D型乳酸，在稳定期D型乳酸的产量约为110mM/108cfu。

[0045] 图2为L49菌株粘附宫颈癌细胞Hela的分析结果。

[0046] 图3为L49菌株对白念珠菌生长抑制的实验结果。

[0047] 图4为L49菌株对白念珠菌菌丝形成抑制的实验结果。图中的“对照”为新鲜的MRS培养基。

[0048] 图5为L49菌株利用碳水化合物能力的分析结果。

具体实施方式

[0049] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0050] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0051] 下述实施例中的白念珠菌SC5314(Candida albicans SC5314)在文献“Xie J,Tao L,Nobile CJ,Tong Y,Guan G,Sun Y,Cao C,Hernday AD,Johnson AD,Zhang L,Bai FY,Huang G(2013).White-opaque switching in natural MTLa/αisolates of Candida albicans:evolutionary implications for roles in host adaptation,pathogenesis,and sex.PLoS Biol 11(3):e1001525.”中公开过，公众可从中国科学院微生物研究所获得，仅可用于重复本发明实验使用。

[0052] 实施例1、L49菌株的分离与鉴定

[0053] 一、L49菌株的分离

[0054] L49分离自健康的妇女生殖道。具体分离方法如下：将生殖道拭子置于含1mL无菌的PBS试管中振荡30s，以此为原液连续十倍稀释，取100μL稀释10000倍的液体涂布于MRS培养基固体平板(1L的MRS培养基配方为：牛肉膏10g，酪蛋白胨10g，酵母提取物5g，葡萄糖20g，乙酸钠5g，柠檬酸氢二铵2g，Tween 80 1mL，K2HPO4 2g，MgSO4.7H2O 0.58g，MnSO4.H2O 
0.25g，琼脂粉15g，双蒸水定容到l L，高压灭菌)，置于厌氧培养箱中37℃，培养48h。然后挑取单克隆在MRS液体培养基中培养。过夜培养后检测单克隆的发酵液上清对白念珠菌SC5314的抑菌活性，发现有一株菌的抑菌活性很强，将其命名为L49。

[0055] 二、L49菌株的鉴定

[0056] 将L49菌体培养后收集，提取基因组DNA，利用引物(27F：5'-AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3'和1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')对16S rRNA序列进行扩增，得到PCR产物。并对PCR产物进行测序。

[0057] 测序结果表明：PCR产物的序列如SEQ ID No.1所示，将此序列经过在NCBI网站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对分析，鉴定为卷曲乳杆菌。

[0058] 经过上述鉴定结果，确定L49菌株名称为卷曲乳杆菌，其分类命名为卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)，该菌株已于2018年01月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.15154。

[0059] 实施例2、L49菌株发酵液上清中乳酸的含量分析

[0060] 乳酸(lactic acid，LA)是一种重要的益生物质，而在生殖道环境中D-型乳酸的含量与生殖道健康呈正相关，它是评价生殖道益生菌性质的一个重要标准。

[0061] 将实施例1中分离得到的L49菌株接种于MRS培养基中，在37℃静置培养得到L49发酵液(设置不同培养时间)。L49发酵液在12000g条件下离心5min，收集得到L49发酵液上清。将L49发酵液上清用0.2μm滤器过滤处理后，用去离子水稀释5倍后采用有机酸分析柱结合高效液相色谱对该上清中的乳酸含量进行测定。同时用去离子水稀释50倍后采用手性柱结合高效液相色谱对该上清中的L型(L-LA)和D型(D-LA)乳酸含量进行分析。其中，手性柱为MCI GEL CRS10W，色谱条件：流动相为2mM GuSO4，流速为0.5mL/min，检测波长为254nm。

[0062] 结果表明：(1)L49菌株产乳酸较快较多，在发酵15小时左右产酸量达到最大，约为8
150mM(图1中A)。(2)L49菌株产较多的D型乳酸，在稳定期D型乳酸的产量约为110mM/10cfu(图1中B)。

[0063] 实施例3、L49菌株的益生特性表征

[0064] 一、L49菌株对宫颈癌细胞Hela的粘附作用分析

[0065] HeLa细胞源自妇女的子宫颈癌细胞，增殖迅速，常用作阴道上皮细胞的替代细胞用于体外研究。益生菌对上皮细胞的黏附力越强越有利于定殖于人体，与病原菌竞争占位，防止病原菌的入侵，而且更有利于其发挥益生功能。

[0066] HeLa细胞采用1640细胞培养液培养，置于37℃含5％CO2培养箱中。待细胞培养板中盖玻片上的Hela细胞长满80％时，换用无青霉素及链霉素的1640细胞培养液培养24h。黏附实验前，用PBS洗涤细胞三次。将L49菌体重悬于PBS磷酸缓冲液中并用磷酸缓冲液洗涤三次。黏附实验时在细胞培养板中按每孔加入1mL无青霉素及链霉素和小牛血清的1640细胞培养液，分别和1mL L49菌悬浮液混合。细胞培养板置于培养箱中培养2.5h后，从中取出盖玻片，用冷PBS洗涤三遍，置于室温(25℃)下自然干燥，甲醇固定，革兰氏染色，油镜下观察L49菌株在Hela细胞上的黏附情况。

[0067] 结果表明：L49菌株对Hela细胞的粘附作用很强，每个细胞周围都有较多细菌粘附(图2)。

[0068] 二、L49菌株对白念珠菌生长的抑制作用

[0069] 白念珠菌是引起生殖道感染的一种常见致病菌，其导致的念珠菌病很难治疗，且容易与其它病原微生物一起造成混合感染，对生命造成严重威胁。另外最近耐药性的白念珠菌的出现使其治疗更加棘手，因而对其有抑制作用的益生菌制剂是对该疾病预防和治疗的一个有效手段。

[0070] 将L49菌株和白念珠菌SC5314分别用MRS培养基和YPD培养基(1L的YPD培养基配方为：酵母提取物10g，蛋白胨20g，和葡萄糖20g，高压灭菌)于37℃培养。收集各自的菌体并用MRS培养基清洗2次，然后L49和SC5314按照1×108cfu/mL和1×107cfu/mL加入到MRS培养基中共培养，于不同时间点取样稀释涂布于MRS(含50μg/mL的纳他霉素)和YPD(含100μg/mL的氨苄青霉素)培养基，分别用于计数L49和SC5314的活菌数。

[0071] 结果表明：L49菌株对白念珠菌的抑制效果明显，共培养刚开始时白念珠菌的生长就明显减缓，在约12h其数量开始急剧下降，到22h时白念珠菌的死亡率达到99％(图3)。

[0072] 三、L49菌株对白念珠菌菌丝的抑制作用

[0073] 白念珠菌致病时由酵母相向菌丝相发生形态转变，使其能够形成较致密的生物被膜而造成严重的组织感染，如果能抑制这个形态转变的发生将很大程度上降低白念珠菌的毒性。

[0074] 将白念珠菌SC5314在YPD培养基中过夜培养，收集菌体后用PBS缓冲液清洗2遍后，用100％的胎牛血清重悬。然后将100μL的该重悬液与100μL的L49发酵液上清混合加入到96孔板中，37℃培养箱放置2h。采用结晶紫染色法定量分析SC5314在96孔板中形成菌丝的量。具体操作如下：首先将未吸附的菌体吸出，依次用70％乙醇、0.25％SDS和无菌水清洗。接着加入0.1％的结晶紫染色5分钟后，用无菌水和SDS清洗。最后用0.04M HCl-异丙醇溶液和
0.25％SDS重悬吸附的菌体，用分光光度计测量各孔590nm波长下的吸收值。

[0075] 结果表明：L49菌株发酵液上清对白念珠菌菌丝形成具有明显的抑制作用，抑制率达到90％左右(图4)。

[0076] 四、L49菌株利用碳水化合物能力的分析

[0077] 益生菌对碳水化合物，特别是对生理环境中寡糖和或多糖的利用，能增加其在生理环境中的定殖能力，更有利于其长期发挥益生作用。

[0078] 分析L49菌株在含不同碳水化合物培养基中的生长情况。这些碳水化合物包括麦芽三糖，可溶性淀粉，普鲁兰多糖以及支链淀粉。将这些碳水化合物按终浓度为0.5％(质量浓度)添加到不含葡萄糖的MRS培养基中，37℃静置培养24h后用分光光度计测量各碳水化合物下L49的OD600值。

[0079] 结果表明：L49菌株都能在上述碳水化合物培养基中生长良好，表明其利用寡糖和多糖的能力较强(图5)。