一种莎草醌及类似物在诱导干细胞成骨分化方面的应用

摘要

本发明公开了一种莎草醌及类似物在诱导干细胞成骨分化方面的应用。本发明发现莎草醌及其类似物去甲莎草醌、羟基莎草醌具有多种药理活性，比如可以作为CIK细胞和NK细胞的冻存保护剂，可以促进CIK细胞和NK细胞体外增殖，可以促进脂肪干细胞成骨分化；本发明还提供了莎草醌及其类似物的单开环衍生物、双开环衍生物及其制备方法，莎草醌及其类似物的单开环衍生物、双开环衍生物可以促进CIK细胞体外增殖。经检索，现有技术没有公开过莎草醌及其类似物促进CIK细胞、NK细胞增殖和促进干细胞成骨分化的用途，也没有莎草醌及其类似物的单呋喃环、双呋喃环开环衍生物的报道。

权利要求

1.莎草醌、去甲莎草醌或羟基莎草醌在诱导脂肪干细胞成骨分化方面的应用；

其中：

莎草醌的化学结构式为：；

去甲莎草醌的化学结构式为：；

羟基莎草醌的化学结构式为：。

说明书

一种莎草醌及类似物在诱导干细胞成骨分化方面的应用

技术领域

[0001] 本发明属于化学领域，涉及已知天然产物的开发利用，具体涉及莎草醌及其类似物去甲莎草醌、羟基莎草醌在促进CIK细胞、NK细胞增殖和促进干细胞分化方面的应用，还涉及莎草醌及其类似物的单开环衍生物、双开环衍生物及其制备方法和在CIK细胞培养中的应用。

背景技术

[0002] 莎草醌及其类似物去甲莎草醌、羟基莎草醌为从两歧飘拂草的全草中分离得到的三种醌类化合物，其化学结构等信息如下所示。

[0003]

[0004] 关于这三种化合物的研究极少，相关活性报道几乎为空白。申请人研究发现，这三种化合物具有优异的促进CIK细胞、NK细胞增殖和促进干细胞分化的作用。而且，在用于促进CIK细胞增殖的用途时，母核上的呋喃环开环后活性显著进一步增强。

[0005] 经检索，现有技术没有公开过莎草醌及其类似物促进CIK细胞、NK细胞增殖和促进干细胞分化的用途，也没有莎草醌及其类似物的单呋喃环、双呋喃环开环衍生物的报道。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于填补现有技术的不足，提供莎草醌及其类似物去甲莎草醌、羟基莎草醌在促进CIK细胞、NK细胞增殖和促进干细胞分化方面的应用，还提供莎草醌及其类似物的单开环衍生物、双开环衍生物及其制备方法和在CIK细胞培养中的应用。

[0007] 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：

[0008] 一种莎草醌及其类似物的单开环衍生物，化学结构如下：

[0009]

[0010] 上述单开环衍生物的制备方法，包括如下步骤：

[0011] 步骤S1，将如下化学结构的原料添加到用挥发性酸调至pH值6.2-6.4的酸性水溶液中；

[0012]

[0013] 步骤S2，将上述溶液移入反应釜中，密闭后在170-190℃温度下进行水热反应，反应时间为8-12h，反应结束后自然降到常温；

[0014] 步骤S3，加热浓缩使挥发性酸挥发，剩余水溶液冷冻干燥即得。

[0015] 优选地，挥发性酸优选盐酸、硝酸、甲酸。

[0016] 优选地，1mL酸性水溶液添加3-5mg原料。

[0017] 上述单开环衍生物在CIK细胞体外培养方面的应用。

[0018] 一种莎草醌及其类似物的双开环衍生物，化学结构如下：

[0019]

[0020] 上述双开环衍生物的制备方法，包括如下步骤：

[0021] 步骤S1，将如下化学结构的原料添加到用挥发性酸调至pH值5.3-5.5的酸性水溶液中；

[0022]

[0023] 步骤S2，将上述溶液移入反应釜中，密闭后在170-190℃温度下进行水热反应，反应时间为8-12h，反应结束后自然降到常温；

[0024] 步骤S3，加热浓缩使挥发性酸挥发，剩余水溶液冷冻干燥即得。

[0025] 优选地，挥发性酸优选盐酸、硝酸、甲酸。

[0026] 优选地，1mL酸性水溶液添加3-5mg原料。

[0027] 上述双开环衍生物在CIK细胞体外培养方面的应用。

[0028] 如下化学结构的莎草醌及其类似物在CIK细胞冻存复苏和体外培养方面的应用：

[0029]

[0030] 优选地，所述的应用为：将莎草醌及其类似物添加到冻存液中提高CIK细胞复苏率。优选地，所述的应用为：将莎草醌及其类似物添加到培养液中提高CIK细胞增殖率。如下化学结构的莎草醌及其类似物在NK细胞冻存复苏和体外培养方面的应用：

[0031]

[0032] 优选地，所述的应用为：将莎草醌及其类似物添加到冻存液中提高NK细胞复苏率。

[0033] 优选地，所述的应用为：将莎草醌及其类似物添加到培养液中提高NK细胞增殖率。

[0034] 如下化学结构的莎草醌及其类似物在诱导干细胞成骨分化方面的应用：

[0035]

[0036] 优选地，所述干细胞为脂肪干细胞。

[0037] 本发明发现：莎草醌及其类似物去甲莎草醌、羟基莎草醌具有多种药理活性，比如可以作为CIK细胞和NK细胞的冻存保护剂，可以促进CIK细胞和NK细胞体外增殖，可以促进脂肪干细胞成骨分化；本发明还提供了莎草醌及其类似物的单开环衍生物、双开环衍生物及其制备方法，莎草醌及其类似物的单开环衍生物、双开环衍生物可以促进CIK细胞体外增殖。

附图说明

[0038] 图1为莎草醌及其类似物的单开环衍生物对CIK细胞体外增殖的影响；

[0039] 图2为莎草醌及其类似物的双开环衍生物对CIK细胞体外增殖的影响；

[0040] 图3为莎草醌及其类似物对CIK细胞冻存复苏(A)及体外增殖(B)的影响；

[0041] 图4为莎草醌及其类似物对NK细胞冻存复苏(A)及体外增殖(B)的影响；

[0042] 图5为莎草醌及其类似物对脂肪干细胞成骨分化的影响。

具体实施方式

[0043] 下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。

[0044] 实施例1：莎草醌及其类似物的单开环衍生物的制备

[0045] 首先，将莎草醌、去甲莎草醌、羟基莎草醌分别添加到酸性水溶液(去离子水用盐酸调节pH值至6.3，当然也可以用硝酸或甲酸等其他挥发性酸替代)中，1mL酸性水溶液添加4mg原料。然后将该溶液移入反应釜中，密闭后在180℃温度下进行水热反应，反应时间为
10h，反应结束后自然降到常温。最后，加热浓缩，待溶液pH近中性时冷冻干燥即得莎草醌单开环衍生物、去甲莎草醌单开环衍生物、羟基莎草醌单开环衍生物，纯度均在95％以上。莎草醌单开环衍生物、去甲莎草醌单开环衍生物、羟基莎草醌单开环衍生物核磁数据见表1-
3。

[0046] 实施例2：莎草醌及其类似物的双开环衍生物的制备

[0047] 首先，将莎草醌、去甲莎草醌、羟基莎草醌分别添加到酸性水溶液(去离子水用盐酸调节pH值至5.4，当然也可以用硝酸或甲酸等其他挥发性酸替代)中，1mL酸性水溶液添加4mg原料。然后将该溶液移入反应釜中，密闭后在180℃温度下进行水热反应，反应时间为
10h，反应结束后自然降到常温。最后，加热浓缩，待溶液pH近中性时冷冻干燥即得莎草醌双开环衍生物、去甲莎草醌双开环衍生物、羟基莎草醌双开环衍生物，纯度均在95％以上。莎草醌双开环衍生物、去甲莎草醌双开环衍生物、羟基莎草醌双开环衍生物核磁数据见表1-
3。表1莎草醌、莎草醌单开环衍生物、莎草醌双开环衍生物的核磁数据比较

[0048]

[0049] 表2去甲莎草醌、去甲莎草醌单开环衍生物、去甲莎草醌双开环衍生物的核磁数据比较

[0050]

[0051] 表3羟基莎草醌、羟基莎草醌单开环衍生物、羟基莎草醌双开环衍生物的核磁数据比较

[0052]

[0053] 实施例3：莎草醌及其类似物提高CIK细胞冻存复苏率

[0054] 1、实验材料

[0055] AIM-VCTSTM培养基购自Gibco公司，重组人白细胞介素2(rh IL-2)购自双鹭药业；淋巴细胞分离液购自Nycomed Pharma公司(Nycomed PharmaAS，Oslo，Norway)，APC标记的抗CD56(CD56-APC)、PE标记的CD4(CD4-PE)、Per CP标记的CD3(CD3-PerCP)、APC-H7标记的CD8(CD8-APC-H7)单克隆抗体均购自BD公司。

[0056] 2、CIK细胞的分离、培养扩增、流式检测

[0057] 抽取健康志愿者的外周血至含有肝素钠的离心管中，离心获得血清和全血细胞，将全血细胞经密度梯度离心获得单个核细胞(PBMCs)。收集的PBMCs重悬于含10％灭活的自体血浆的AIM-VCTSTM培养基，调整细胞密度1.5×106/ml左右，并加入IFN-γ(1000U/ml)，细胞置37℃、5％CO2培养箱中培养，24h后加入抗CD3McAb(50ng/ml)、rh IL-2(500U/ml)和rh IL-1α(300U/ml)。之后每隔2天添加含有5％自体血浆、1000U/ml rh IL-2的AIM-VCTSTM培养基，每次补液后将细胞密度控制为1.5×106/ml。

[0058] 流式检测：取培养14天的CIK细胞，1000r/min离心5min后用1×PBS洗1次，1500r/min离心5min，调整细胞数约为7.5×105/管/100μl，加CD4-PE、CD3-Per CP、CD8-APC-H7、CD56-APC各2μl，吹匀，避光孵育20min，PBS洗1次，最后以PBS 400μl重悬，上机检测。检测培养14天后CIK细胞的比例，流式细胞仪检测结果使用BD CellQuest软件进行分析。

[0059] 流式结果显示，培养14天后CIK细胞高表达，含量为58.5％。

[0060] 3、CIK细胞的冻存、复苏、细胞活率测定和流式检测

[0061] 取扩增培养至第14天的CIK细胞，1000r/min离心10min，弃上清液，按照如下分组加入不同组成的冻存液，分别调整细胞浓度至2×107/ml，首先于4℃冰箱中放置1h，然后-20℃冰箱中放置2h，转至-80℃低温冰箱放置2个月。

[0062] 常规对照组：AIM-VCTSTM培养基、自体血浆和二甲基亚砜体积比5:4:1；

[0063] 莎草醌组：在常规对照组基础上添加5μg/mL的莎草醌；

[0064] 去甲莎草醌组：在常规对照组基础上添加5μg/mL的去甲莎草醌；

[0065] 羟基莎草醌组：在常规对照组基础上添加5μg/mL的羟基莎草醌；

[0066] 复苏：从-80℃冰箱中取出冻存的CIK细胞，迅速放入37℃水浴锅内融化，用AIM-VCTSTM培养基洗涤，重悬于AIM-VCTSTM培养基中，加入自体血浆培养4h，测定活率。

[0067] 细胞活率测定：2g/L锥虫蓝染液分别与冻存前和复苏后的CIK细胞悬液1:1混匀，染色2min后，采用全自动细胞计数仪进行细胞活率测定，每个样本计数3次，取平均值。

[0068] 采用上述流式测定方法对复苏后培养4h的细胞进行流式细胞仪检测。

[0069] 结果如图3中的A所示，冻存前细胞活率为(97.5±2.1)％；与冻存前相比，常规对照组复苏后细胞碎片增多，细胞活率明显降低，为(70.4±2.3)％，差异有统计学意义(P＜0.05)；与常规对照组相比，莎草醌组、去甲莎草醌组和羟基莎草醌组复苏后细胞碎片明显较少，细胞活率较高，分别为(93.5±2.2)％、(94.4±1.9)％、(93.9±2.3)％。流式细胞仪检测结果表明，莎草醌组、去甲莎草醌组和羟基莎草醌组复苏后CIK细胞含量仍在50％以上。

[0070] 因此，通过上述实验可见莎草醌、去甲莎草醌和羟基莎草醌对CIK细胞冻存具有保护作用，复苏率高，且不影响CIK细胞表型，可以用作CIK细胞冻存保护剂。

[0071] 实施例4：莎草醌及其类似物提高NK细胞冻存复苏率

[0072] 1、实验材料

[0073] NK细胞培养基购自德国CellGro SCGM，重组人白细胞介素2(rh IL-2)购自双鹭药业；淋巴细胞分离液购自Nycomed Pharma公司(Nycomed Pharma AS，Oslo，Norway)，Per CP-Cy5.5标记的CD3、FITC标记的CD56单克隆抗体均购自BD公司。

[0074] 2、NK细胞的分离、培养扩增、流式检测

[0075] 抽取健康志愿者的外周血至含有肝素钠的离心管中，离心获得血清和全血细胞，将全血细胞经密度梯度离心获得单个核细胞(PBMCs)。收集的PBMCs重悬于含500U/ml rh IL-2的NK细胞培养基，调整细胞密度为3.5×105/ml，接种于6孔培养板中，每孔5ml，于37℃、5％CO2培养箱培养，每2天半量换液1次，并调整细胞数为5×104/ml，收集培养10d的NK细胞，加入Per CP-Cy5.5标记的CD3、FITC标记的CD56进行细胞表面标志检测。

[0076] NK细胞表型为CD3-CD56+；收集经rh IL-2诱导培养10d的细胞进行流式检测，PBMC未培养前NK细胞(CD3-CD56+)比例为6.5％，培养10d后NK细胞比例增加到78.5％。

[0077] 3、NK细胞的冻存、复苏、细胞活率测定和流式检测

[0078] 取扩增培养至第10天的NK细胞，1000r/min离心10min，弃上清液，按照如下分组加入不同组成的冻存液，分别调整细胞浓度至2×107/ml，首先于4℃冰箱中放置1h，然后-20℃冰箱中放置2h，转至-80℃低温冰箱放置2个月。

[0079] 常规对照组：NK细胞培养基和二甲基亚砜体积比9:1；

[0080] 莎草醌组：在常规对照组基础上添加5μg/mL的莎草醌；

[0081] 去甲莎草醌组：在常规对照组基础上添加5μg/mL的去甲莎草醌；

[0082] 羟基莎草醌组：在常规对照组基础上添加5μg/mL的羟基莎草醌；

[0083] 复苏：从-80℃冰箱中取出冻存的NK细胞，迅速放入37℃水浴锅内融化，用NK细胞培养基洗涤，重悬于NK细胞培养基中培养4h，测定活率。

[0084] 细胞活率测定：2g/L锥虫蓝染液分别与冻存前和复苏后的NK细胞悬液1:1混匀，染色2min后，采用全自动细胞计数仪进行细胞活率测定，每个样本计数3次，取平均值。

[0085] 采用上述流式测定方法对复苏后培养4h的细胞进行流式细胞仪检测。

[0086] 结果如图4中的A所示，冻存前细胞活率为(96.7±2.5)％；与冻存前相比，常规对照组复苏后细胞碎片增多，细胞活率明显降低，为(73.5±2.4)％，差异有统计学意义(P＜0.05)；与常规对照组相比，莎草醌组、去甲莎草醌组和羟基莎草醌组复苏后细胞碎片明显较少，细胞活率较高，分别为(92.3±2.5)％、(94.6±2.4)％、(92.8±2.5)％。流式细胞仪检测结果表明，莎草醌组、去甲莎草醌组和羟基莎草醌组复苏后NK细胞含量仍在75％以上。

[0087] 因此，通过上述实验可见莎草醌、去甲莎草醌和羟基莎草醌对NK细胞冻存具有保护作用，复苏率高，且不影响NK细胞表型，可以用作NK细胞冻存保护剂。

[0088] 实施例5：莎草醌及其类似物、单开环衍生物、双开环衍生物促进CIK细胞体外增殖[0089] 用CCK8法检测莎草醌及其类似物、单开环衍生物、双开环衍生物对人CIK细胞生长的影响。具体方法为：取实施例3中扩增培养至第14天的CIK细胞，用AIM-VCTSTM培养基重悬成5×104/ml的细胞悬液；接种于96孔板，分别加入含2.0μM的莎草醌、去甲莎草醌、羟基莎草醌及其单开环衍生物、双开环衍生物，对照组不添加莎草醌及其类似物、单开环衍生物、双开环衍生物，每组设3个复孔，于37℃、5％CO2培养箱中继续培养48h后，每孔加入CCK820μl，继续培养4h后弃去上清，于酶标仪450nm处检测各孔吸光值(OD)记录结果，求其平均值，最后按照如下公式计算各给药组CIK细胞生长增殖率(％)。

[0090] CIK细胞增殖率(％)＝[(给药组OD值)－(对照组OD值)]/(对照组OD值)×100％。

[0091] 莎草醌及其类似物对人CIK细胞生长的促进作用如表4-6和图1、图2和图3中B所示。

[0092] 表4莎草醌及其类似物给药组的CIK细胞增殖率(％)

[0093]

[0094] 表5莎草醌及其类似物的单开环衍生物给药组的CIK细胞增殖率(％)

[0095]

[0096] 表6莎草醌及其类似物的双开环衍生物给药组的CIK细胞增殖率(％)

[0097]

[0098] 因此，通过上述实验可见莎草醌、去甲莎草醌、羟基莎草醌及其单开环衍生物、双开环衍生物可以促进CIK细胞的增殖，且莎草醌、去甲莎草醌、羟基莎草醌开环后药效更强。

[0099] 实施例6：莎草醌及其类似物促进NK细胞体外增殖

[0100] 用CCK8法检测莎草醌及其类似物对人NK细胞生长的影响。具体方法为：

[0101] 取实施例4中扩增培养至第10天的NK细胞，用NK细胞培养基重悬成5×104/ml的细胞悬液；接种于96孔板，分别加入含2.0μM的莎草醌、去甲莎草醌和羟基莎草醌，对照组不添加莎草醌及其类似物，每组设3个复孔，于37℃、5％CO2培养箱中继续培养48h后，每孔加入CCK820μl，继续培养4h后弃去上清，于酶标仪450nm处检测各孔吸光值(OD)记录结果，求其平均值，最后按照如下公式计算各给药组NK细胞生长增殖率(％)。

[0102] NK细胞增殖率(％)＝[(给药组OD值)－(对照组OD值)]/(对照组OD值)×100％。

[0103] 莎草醌及其类似物对人NK细胞生长的促进作用如表7和图4中B所示。

[0104] 表7莎草醌及其类似物给药组的NK细胞增殖率(％)

[0105]

[0106] 因此，通过上述实验可见莎草醌、去甲莎草醌和羟基莎草醌可以促进NK细胞的增殖。

[0107] 实施例7：莎草醌及其类似物促进脂肪干细胞成骨分化

[0108] 1、实验材料

[0109] 清洁级健康新西兰大白兔，3月龄，体重2-3kg；H-DMEM(HyClone公司，美国)；胎牛血清FBS(杭州四季青)；地塞米松、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠(Sigma公司)。

[0110] 2、脂肪干细胞(ADSCs)分离培养

[0111] 采用文献方法分离培养脂肪干细胞(不同浓度地塞米松诱导脂肪干细胞成骨分化的实验研究，中国修复重建外科杂志2011年12月第25卷第12期)，具体操作为：新西兰大白兔以3％戊巴比妥钠(30mg/kg)耳缘静脉注射麻醉，取仰卧位，作腹股沟中部纵形切口约3cm，切取皮下脂肪4～6mL，尽量剔除血管、筋膜，PBS(pH7.4)冲洗5遍，去除红细胞，充分剪碎至1mm×1mm×1mm大小组织块，置入50mL锥形瓶，加入3～5倍体积的0.1％Ⅰ型胶原酶，37℃摇床震荡消化60min，加入等体积H-DMEM(含10％FBS和100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素)培养液终止消化。常温下以离心半径20cm、1200r/min离心10min，弃上清及上层脂肪。5mLH-DMEM(含10％FBS和双抗)培养液悬浮沉淀，200目尼龙滤网过滤，滤液同上法离心，弃上清，
3mLH-DMEM(含10％FBS和双抗)培养液悬浮沉淀，接种于50mL细胞培养瓶，37℃、5％CO2及饱和湿度培养箱培养。48h首次换液，去除未贴壁细胞，之后2～3d换液1次，待细胞达70％～
80％融合时进行传代。

[0112] 3、ADSCs成骨分化诱导培养及茜素红染色

[0113] H-DMEM成骨诱导基础培养液：H-DMEM培养液中添加10％FBS、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、10mmol/Lβ-磷酸甘油钠、50μmol/L抗坏血酸。

[0114] 取第3代ADSCs细胞离心后用上述H-DMEM成骨诱导基础培养液重悬成1×105个/mL，给药组分别加入含5.0μM的莎草醌、去甲莎草醌和羟基莎草醌，对照组不添加莎草醌及其类似物，37℃、5％CO2及饱和湿度培养箱培养7d。

[0115] 取成骨诱导培养7d的各组细胞爬片，PBS漂洗3次，每次5min；95％乙醇4℃固定30min；三蒸水漂洗3次，每次5min；加入0.1％茜素红染液，37℃作用30min；三蒸水漂洗3次，每次5min；自然干燥，中性树胶封片，倒置相差显微镜下观察细胞外钙盐沉积情况。

[0116] 茜素红染色结果如图5所示。成骨细胞会出现钙化现象，会被茜红素染成红色，未钙化的细胞不会被染色。对照组无明显钙化，各给药组出现不同程度的钙化染色，莎草醌、去甲莎草醌组钙化结节点较少，零星分布，羟基莎草醌组则出现大面积钙化结节，说明莎草醌、去甲莎草醌和羟基莎草醌可以有效诱导脂肪干细胞成骨分化，且羟基莎草醌药效最强。

[0117] 创伤或肿瘤导致的骨缺损是骨科、整形修复科、口腔颌面外科等科室的常见疾病，严重影响患者的外形和功能。骨水泥或其他人工材料可促进轻度骨缺损的愈合，较大的骨缺损则需要血管化的骨移植修复。常用的髂骨或腓骨瓣移植虽然可以修复大部分骨缺损，但供区损伤较大。组织工程和再生医学为修复或替换受损组织提供了新的思路，而种子细胞是其中的关键。脂肪干细胞的来源充足、获取简便、产量高、增殖快，具有多向分化潜能，可旁分泌各种细胞因子，促进血管形成，发挥免疫调节作用，并能招募其他细胞参与重建，因此一直是种子细胞的热门之选。莎草醌、去甲莎草醌和羟基莎草醌可以有效诱导脂肪干细胞成骨分化，充分利用脂肪干细胞的资源优势，为骨移植提供成骨细胞。

[0118] 上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。