新生儿50种遗传病基因检测探针组及筛查方法

摘要

本发明公开了一种新生儿50种遗传病基因检测探针组及筛查方法。本发明针对新生儿50种遗传病104种基因，并结合靶序列液相杂交捕获技术和半导体测序技术，设计了1347个探针捕获区域，基于所提供的探针捕获区域可根据常规方法设计获得相应的探针，实现新生儿50种遗传病有效筛查，其具有准确率高，特异性好，通量大的优势，拥有广阔的应用前景。

权利要求

1.一种新生儿遗传病基因检测探针组，其特征在于：所述探针组依据1347个捕获区域设计获得，所述捕获区域如下所示：

2.一种新生儿遗传病基因筛查试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有权利要求1所述的新生儿遗传病基因检测探针组。

说明书

新生儿50种遗传病基因检测探针组及筛查方法

技术领域

[0001] 本发明属于基因测序领域，更具体地涉及新生儿50种遗传病基因检测探针组及筛查方法。

背景技术

[0002] 东莞市每年约有16万名新生儿出生，据统计出生缺陷发生率一直在2.6％左右，预计每年出生的缺陷儿在4000人左右。出生缺陷发生原因比较复杂，其中遗传病是主要原因之一，对于遗传导致出生缺陷，能通过新生儿筛查遗传性相关基因，实现早发现、早诊断、早治疗的目的，从而大幅度提高患者的生存质量、大大降低家庭和社会负担。

[0003] 实现筛查的关键一方面需要满足大样本通量的要求，另一方面需要满足多检测位点或基因的要求，因此，高通量测序技术非常适用于遗传病筛查，可以有效扩大筛查覆盖率和检出率，准确分析遗传方式，预测再发风险，并且为用药提供指导。新生儿常见的遗传病很多，如苯丙酮尿症、酪氨酸血症、枫糖尿病、克拉伯病、结节性硬化症等等，这些遗传病往往与一个或多个基因突变相关，通过检测新生儿遗传病相关基因信息，分析其突变信息可实现筛查目的。探针杂交是基因捕获常用的技术之一，杂交探针是一小段DNA片段(十几到几百个碱基),用于捕获与其互补的目标序列。目前基于探针捕获的高通量测序已有应用于临床，通量大，费用更低，结果更可靠。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供新生儿50种遗传病基因检测探针组及筛查方法。

[0005] 本发明的技术方案是：

[0006] 一种新生儿遗传病基因检测探针组，所述探针组依据1347个捕获区域设计获得，所述捕获区域如表2所示。

[0007] 一种新生儿遗传病基因筛查试剂盒，所述试剂盒含有上述新生儿遗传病基因检测探针组。

[0008] 一种检测新生儿遗传病基因的测序文库构建方法，包括如下步骤：

[0009] (1)样品采集与提取：收集待测样品，提取基因组DNA；

[0010] (2)DNA片段化：将基因组DNA超声打断至100～500bp的DNA片段；

[0011] (3)末端修复与接头连接：对DNA片段进行末端修复及测序接头连接；产物进行纯化；

[0012] (4)杂交前扩增：将上一步纯化产物进行PCR扩增富集、纯化，获得用于杂交捕获的DNA文库；

[0013] (5)第一次探针捕获：将DNA文库进行杂交前封闭，采用上述检测探针组进行杂交捕获；

[0014] (6)目标区域富集：将第一次探针捕获产物洗脱，获得捕获的靶序列，将捕获的靶序列进行PCR扩增，获得富集的靶序列；

[0015] (7)第二次探针捕获与目标区域富集：将富集的靶序列作为第一次探针捕获步骤中的DNA文库，再进行一次探针捕获及目标区域富集，对第二次富集的靶序列进行纯化，获得待测序产物；

[0016] (8)将待测序产物进行二代测序，采用生物信息学分析测序结果。

[0017] 作为上述测序文库构建方法的优选，所述步骤(1)中，待测样品品选自血斑、血液、肌肉组织。

[0018] 作为上述测序文库构建方法的优选，所述步骤(3)和所述步骤(4)中，纯化为磁珠纯化，如实施例所用的Agencourt AMPure XP Kit。

[0019] 作为上述测序文库构建方法的优选，所述步骤(4)中，PCR扩增富集的体系为：纯化产物40μL、接头引物10μL、NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master Mix 50μL；反应条件为：98℃预变性30s；循环5次(98℃变性10s；58℃退火30s；72℃延伸30s)；72℃延伸5min。

[0020] 作为上述测序文库构建方法的优选，所述步骤(6)中，PCR扩增的体系为：捕获的靶序列33.5μL、5×HerculaseⅡReaction Buffer 10μL、dNTP mix(25mM each)0.5μL、接头引物5μL、HerculaseⅡFusion DNA Polymerasel 1μL；反应条件为：98℃预变性2min；循环5次(98℃变性30s；58℃退火30s；72℃延伸1min)；72℃延伸5min。

[0021] 其中，接头引物为适应测序平台接头的选择，如实施例中的接头引物是针对Ion Torrent测序平台的A和P接头的接头引物。

[0022] 作为上述测序文库构建方法的优选，所述步骤(6)中，洗脱采用Invitrogen公司的Dynabeads MyOne Streptavidin T1。

[0023] 作为上述测序文库构建方法的优选，所述步骤(3)中，末端修复与接头连接采用NEBNext Fast DNA Library Prep Set for Ion Torrent试剂盒。

[0024] 作为上述测序文库构建方法的优选，所述步骤(8)中，二代测序采用半导体测序。

[0025] 本发明的有益效果：

[0026] 本发明针对新生儿50种遗传病104种基因，并结合靶序列液相杂交捕获技术和半导体测序技术，设计了1347个探针捕获区域(如表2所示)，基于所提供的探针捕获区域可根据常规方法设计获得相应的探针，实现新生儿50种遗传病有效筛查，其具有准确率高，特异性好，通量大的优势，拥有广阔的应用前景。

具体实施方式

[0027] 发明人结合靶序列液相杂交捕获技术和半导体测序技术，设计了一组新生儿50种遗传病基因检测探针，并提供了新生儿遗传病筛查方法。

[0028] 实施例1、新生儿50种遗传病基因检测探针组

[0029] 发明人经过查阅大量新生儿遗传病致病基因相关文献及数据库，获得了新生儿50种遗传病及其相关基因(详见表1)，通过高通量的实验筛选及相关实验验证，最终优选出1347个探针捕获区域(捕获区域见表2所示)，针对探针捕获区域的探针联合使用可用于检测新生儿50种遗传病致病基因；针对所设计的探针捕获区域的探针特异性强、灵敏度高，对新生儿遗传病致病基因缺失、重复、点突变的情况均能进行有效的检测。

[0030] 表1、新生儿50种遗传病及其相关致病基因

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[0033] 表2、50种新生儿遗传病对应104个致病基因的捕获区域

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[0051] 实施例2、新生儿50种遗传病致病基因捕获和测序方法

[0052] (1)样品采集与提取：以东莞市第八人民医院提供的6例经临床确诊为新生儿遗传病的患者外周血为例，分别采用QIAamp DNA Blood Mini Kit进行基因组DNA提取；

[0053] (2)DNA片段化：将基因组DNA超声打断至100～500bp的DNA片段；

[0054] (3)末端修复与接头连接：使用NEBNext Fast DNA Library Prep Set for Ion Torrent试剂盒对DNA片段进行末端修复及测序接头连接；产物用Agencourt AMPure XP Kit纯化；

[0055] (4)杂交前扩增：将上一步纯化产物进行PCR扩增富集，PCR体系为：纯化产物40μL、接头引物10μL、NEBNext High-Fidelity 2X PCR Master Mix 50μL；反应条件为：98℃预变性30s；循环5次(98℃变性10s；58℃退火30s；72℃延伸30s)；72℃延伸5min；PCR扩增产物用Agencourt AMPure XP Kit进行纯化，获得用于杂交捕获的DNA文库；

[0056] (5)第一次探针捕获：使用SureSelect TE Reagent Kit,PTN,16(Agilent)试剂盒，按说明书操作，将DNA文库进行杂交前封闭，获得已封闭的DNA文库；再将实施例1针对探针捕获区域的探针配制成探针混合液；与已封闭的DNA文库进行17小时的杂交捕获；

[0057] (6)目标区域富集：将第一次探针捕获产物使用Dynabeads MyOne Streptavidin T1(Invitrogen)进行洗脱，获得捕获的靶序列，将捕获的靶序列进行PCR扩增，获得富集的靶序列，PCR扩增体系为：捕获的靶序列33.5μL、5×HerculaseⅡReaction Buffer 10μL、dNTP mix(25mM each)0.5μL、引物5μL、HerculaseⅡFusion DNA Polymerasel 1μL；反应条件为：98℃预变性2min；循环5次(98℃变性30s；58℃退火30s；72℃延伸1min)；72℃延伸5min；

[0058] (7)第二次探针捕获与目标区域富集：将富集的靶序列作为第一次探针捕获步骤中的DNA文库，再进行一次探针捕获及目标区域富集，第二次富集的靶序列用Agencourt AMPureXP Kit进行纯化，获得待测序产物；

[0059] (8)将待测序产物用Ion Torrent平台测序，采用生物信息学分析测序结果。

[0060] 本实施例中，基因组DNA提取浓度及DNA文库浓度用Qubit定量，结果如表3所示。

[0061] 表3、基因组DNA提取浓度及DNA文库浓度

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[0063] 本实施例中，待测序产物的Qubit定量和qPCR定量结果如表4所示。

[0064] 表4、测序产物的Qubit定量和qPCR定量浓度

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[0066] 本实施例中，6份样本的新生儿50种遗传病的筛查结果，如表5所示。

[0067] 表5、6份样本的新生儿50种遗传病的筛查结果

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[0069] 综上，根据本发明的探针捕获区域(如表2所示)设计相应的探针，即可实现新生儿50种遗传病的筛查。

[0070] 以上所述仅为本发明的实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均落在本发明要求的保护范围之内。