铁皮石斛多糖在制备治疗色素减退性皮肤病药物中的应用

摘要

本发明属于皮肤病药物研究领域，公开了铁皮石斛多糖在制备治疗色素减退性皮肤病药物中的应用，具体是在治疗白癜风药物中的应用。

权利要求

1.铁皮石斛多糖在制备治疗色素减退性皮肤病药物中的应用。

2.根据权利要求1所述应用，其特征是，所述治疗色素减退性皮肤病药物是指治疗白癜风的药物。

3.根据权利要求1所述应用，其特征是，所述铁皮石斛多糖的纯度≥90％。

说明书

铁皮石斛多糖在制备治疗色素减退性皮肤病药物中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于皮肤病药物研究领域，具体涉及治疗色素减退性皮肤病药物。

背景技术

[0002] 白癜风是一种常见的皮肤粘膜色素脱失性疾病，表现为皮肤、粘膜黑素细胞数目减少或功能的缺失。白癜风的发病与自身免疫紊乱、黑素细胞自毁、神经内分泌失调、氧化应激、心理应急等因素相关。白癜风不仅严重破坏患者外观，还影响患者正常的生活及社交活动，给患者本人、患者家庭及社会都带来了很大的负担。目前常使用外用药物、系统药物、光学疗法、手术治疗等方法治疗白癜风，但目前即使运用综合治疗，部分白癜风患者颜色恢复仍然困难。因此寻找提高白癜风疗效的新药物十分的迫切。

[0003] 黑素的合成是多级酶促反应过程，其中TYR是黑素合成的关键酶，其表达量或活性可反应细胞内黑素合成水平。另外MITF基因能够诱导TYR的表达。因此，MITF、TYR等常被用作黑素合成的标记物。黑素合成后，在黑素小体中从核周向树突末端形成细胞内转运。在黑素转运过程中，Rab27a等多种蛋白形成的动力复合分子共同参与了黑素小体沿核周向树突伸展方向转运的过程。因此，Rab25a等常被用作黑素转运的标记物。目前研究显示PKA等信号通路是黑素的合成及转运的主要调控通路。黑色素细胞在受到各种刺激下PKA信号通路激活，进而增强转录因子MITF的表达，MITF表达上调后促进了TYR等黑素合成相关基因及Rab27a表达。

[0004] 近年来的研究发现，许多中药在防治白癜风方面有着积极的作用，并且具有高效、无副作用等特点。铁皮石斛属气生兰科草本植物，具有独特的药用价值，以其茎入药，具有增强免疫功能、调节内分泌、抗衰老、促组织再生等作用。铁皮石斛多糖已有文献报道具有以下功效：很好的DPPH清除能力、羟自由基的清除能力及抗氧化能力，有应用于治疗抑郁症、肺炎、便秘、高血压中风、促进毛发生长等方面，然而铁皮石斛多糖在治疗白癜风等色素减退性皮肤病中的作用及机制尚未文献报道。

发明内容

[0005] 针对现有技术的不足，本发明旨在提供一种铁皮石斛多糖的新用途。

[0006] 本发明铁皮石斛多糖在制备治疗色素减退性皮肤病药物中的应用。

[0007] 进一步，所述治疗色素减退性皮肤病药物是指治疗白癜风的药物。

[0008] 进一步，所述铁皮石斛多糖的纯度≥90％，可以是任意市售铁皮石斛多糖产品。

[0009] 本发明的研究结果表明：1、铁皮石斛多糖能通过激活黑素细胞中PKA信号通路促进黑素生成。2、铁皮石斛多糖能刺激角质形成细胞分泌POMC、bFGF、ET-1等因子，并通过旁分泌作用促进黑素细胞黑素的生成。

[0010] 本发明的实验结果发现铁皮石斛多糖对黑素生成具有双重刺激作用，既可以直接刺激黑素细胞生成黑素，还可以通过刺激角质形成细胞通过旁分泌作用促进黑素细胞黑素生成。提示铁皮石斛多糖是治疗白癜风等色素减退性皮肤病的潜在药物。

附图说明

[0011] 图1是铁皮石斛多糖能促进B16F10细胞黑素生成的试验数据图谱。(A)MTT法检测不同浓度铁皮石斛多糖对B16F10细胞活性的影响。(B)NaOH法检测铁皮石斛多糖对B16F10细胞黑素含量的影响。(C-E)RT-PCR法检测铁皮石斛多糖对B16F10细胞中MITF、TYR及Rab27a等黑素生成相关基因表达的影响。

[0012] 图2是铁皮石斛多糖能激活PKA信号通路的试验数据图谱。Western-Blot法检测B16F10细胞中PKA信号通路关键分子CREB及其磷酸化水平的表达。

[0013] 图3是铁皮石斛多糖促进Hacat细胞分泌POMC、bFGF、ET-1等因子，并通过旁分泌作用刺激黑素细胞黑素生成的试验数据图谱。(A-C)铁皮石斛多糖处理Hacat细胞24h后，RT-PCR检测POMC、bFGF、ET-1的表达。铁皮石斛多糖刺激Hacat细胞24h后，提取细胞上清液，将上清液与PIG1细胞株共培养后，(D)NaOH法检测PIG1细胞中黑素含量，(E-G)RT-PCR法检测PIG1细胞中MITF、TYR及Rab27a等黑素生成相关基因的表达。

具体实施方式

[0014] 下面结合实施例对本发明做进一步的说明。

[0015] 实验方法：

[0016] 1、主要材料

[0017] 90％纯度铁皮石斛多糖购自西安维特生物科技有限责任公司。

[0018] 2、细胞培养：

[0019] 在37℃、5％CO2条件下，永生化人黑色素细胞株(PIG1细胞)培养于5％胎牛血清(Biological Industries,Israel)、1％双抗(Gibco)及1％HMGS(#S0025,Gibco)的254(#M-254-500,Gibco)培养基中。鼠黑素瘤细胞(B16F10细胞)、永生化人角质形成细胞(Hacat细胞)培养于10％胎牛血清及1％双抗(Gibco)的DMEM(Hyclone)培养基中。

[0020] 3、细胞活性检测(MTT assay)

[0021] 胰酶消化B16F10细胞，用含10％胎牛血清的DMEM培养液配成单个细胞悬液，以每孔2000个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积200ul，细胞贴壁后，不同浓度铁皮石斛多糖(10ug/ml、20ug/ml、40ug/ml)处理B16F10细胞48h。每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20ul，37℃孵箱中继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加入150ul DMSO，振荡10min，使结晶物充分溶解。使用酶标仪(PerkinElmer EnVision xcite,UK)在490nm处测量吸光度。

[0022] 4、黑素含量测定

[0023] B16F10细胞(2.5×105个细胞每35mm培养皿)种板，不同浓度铁皮石斛多糖(10ug/ml、20ug/ml、40ug/ml)处理B16F10细胞48h，胰酶消化、离心、收集B16F10细胞，100ul 1mol/L NaOH 70℃水浴加热2小时使细胞溶解,使用酶标仪(PerkinElmer EnVision xcite,UK)在490nm处测量吸光度。

[0024] 5、药物处理及RT-PCR实验

[0025] 不同浓度铁皮石斛多糖处理B16F10细胞48h，提取总RNA，RT-PCR法检测黑素生成及转运基因MITF、TYR、Rab27A的表达。不同浓度铁皮石斛多糖处理Hacat细胞24h，提取总RNA，RT-PCR检测旁分泌因子POMC、bFGF、ET-1的表达。不同浓度铁皮石斛多糖处理Hacat细胞24h，弃去含铁皮石斛多糖的培基，加入2ml培养基培养24小时后收集上清，将1ml上清液加至PIG1细胞的培养液中。共培养24h后提取PIG1细胞总RNA，RT-PCR法检测黑素生成及转运基因MITF、TYR、Rab27A的表达。使用E.Z.N. Total RNA提取试剂盒(OMEGA BIO-TEK,USA)按生产厂家操作说明提取细胞总RNA。使用TOYOBO RT试剂盒(TOYOBO Co.,Ltd,Osaka,Japan)按生产厂家操作说明将总RNA逆转录为cDNA。使用KOD qPCR(TOYOBO Co.,Ltd,Osaka,Japan)试剂盒在实时荧光定量PCR仪(LightCycler480Ⅱ,Mannheim,Germany)上进行RT-PCR反应，各基因引物合成于上海生工公司。

[0026] 6、蛋白质免疫印迹法(Western-Blot)

[0027] 不同浓度铁皮石斛多糖处理B16F10细胞48h后，用裂解缓冲液提取蛋白，并在4℃以12,000rpm离心10分钟。通过BCA蛋白测定法测定蛋白质浓度，实验前煮沸5分钟。每孔上样20μg蛋白质样品，用10％SDS PAGE(Well Biological Co.，Ltd，Changsha，China)分离，转移到PVDF膜(Millipore，USA)。5％BSA封闭2小时后，将膜在4℃下与CREB(1:1000)、p-CREB(1:1000)、GAPDH(1:5000)抗体孵育过夜。用PBST洗涤PVDF膜，然后在室温下与有HRP标记的山羊抗兔IgG或抗小鼠IgG二抗(CST，USA)孵育60分钟，通过ECL化学发光法检测结合的抗体。

[0028] 7、统计学分析

[0029] 以SPSS 19.0统计学软件对实验数据进行统计学分析。实验重复三次，数据用Mean±SD表示，组间差异比较采用方差分析或T检验分析，当P<0.05时，认为差异具有统计学意义(****P<0.0001,***P<0.001,**P<0.01,*P<0.05)。

[0030] 实验结果：

[0031] 1.铁皮石斛多糖能促进B16F10细胞黑素生成

[0032] B16F10是小鼠黑色素瘤细胞，因其能产生大量黑素颗粒，因此可被作用黑素生成研究的工具细胞。我们的研究发现低浓度铁皮石斛多糖对B16F10细胞无明显毒副作用(图1A)。且低浓度铁皮石斛多糖能促进黑素的产生(图1B)，并能上调MITF、TYR等黑素合成相关基因及Rab27a等黑素转移相关基因的表达(图1C，D，E)。图1是铁皮石斛多糖能促进B16F10细胞黑素生成的试验数据图谱。(A)MTT法检测不同浓度铁皮石斛多糖对B16F10细胞活性的影响。(B)NaOH法检测铁皮石斛多糖对B16F10细胞黑素含量的影响。(C-E)RT-PCR法检测铁皮石斛多糖对B16F10细胞中MITF、TYR及Rab27a等黑素生成相关基因表达的影响。

[0033] 2.铁皮石斛多糖能激活PKA信号通路

[0034] PKA信号通路的激活在黑素生成中起关键作用，因此我们探索了铁皮石斛多糖对B16F10细胞PKA信号通路关键分子CREB及CREB磷酸化水平(p-CREB)的影响。我们的研究发现铁皮石斛多糖能促进PKA信号通路关键分子CREB的磷酸化水平，提示铁皮石斛多糖可能通过激活PKA信号通路促进了黑素的生成。图2是铁皮石斛多糖能激活PKA信号通路的试验数据图谱。Western-Blot法检测B16F10细胞中PKA信号通路关键分子CREB及其磷酸化水平的表达。

[0035] 3.铁皮石斛多糖能通过促进Hacat细胞分泌POMC、bFGF、ET-1等因子，并通过旁分泌作用刺激黑素细胞黑素生成

[0036] 既往的研究已证实皮肤组织中角质形成细胞能分泌POMC(POMC裂解产物α-MSH具有促黑素生成作用)、bFGF、ET-1等因子通过旁分泌作用促进黑素细胞黑素的生成。我们发现铁皮石斛多糖能促进永生化角质形成细胞Hacat细胞株中POMC、bFGF、ET-1的表达(图3A，B，C)。进一步的我们提取铁皮石斛多糖刺激Hacat细胞24h后的细胞上清液，将上述上清液与永生化人黑素细胞PIG1细胞株共培养后发现PIG1细胞黑素含量明显增加(图3D)，且PIG1细胞中MITF、TYR等黑素合成相关基因及Rab27a等黑素转移相关基因表达上调(图3E，F，G)。图3是铁皮石斛多糖促进Hacat细胞分泌POMC、bFGF、ET-1等因子，并通过旁分泌作用刺激黑素细胞黑素生成的试验数据图谱。(A-C)铁皮石斛多糖处理Hacat细胞24h后，RT-PCR检测POMC、bFGF、ET-1的表达。铁皮石斛多糖刺激Hacat细胞24h后，提取细胞上清液，将上清液与PIG1细胞株共培养后，(D)NaOH法检测PIG1细胞中黑素含量，(E-G)RT-PCR法检测PIG1细胞中MITF、TYR及Rab27a等黑素生成相关基因的表达。

[0037] 结论：1、铁皮石斛多糖能通过激活黑素细胞中PKA信号通路促进黑素生成。

[0038] 2、铁皮石斛多糖能刺激角质形成细胞分泌POMC、bFGF、ET-1等因子，并通过旁分泌作用促进黑素细胞黑素的生成。