一种酶法转化生产9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮的方法

摘要

本发明公开了一种酶法转化生产9α‑羟基雄甾‑4‑烯‑3,17‑二酮的方法，属于基因工程和酶工程领域。本发明将来源于Mycobacterium sp.Strain VKMAc‑1817D的3‑甾酮9α‑羟基化酶的氧化亚基KshA，还原亚基KshB，及未知活性亚基KshC成功在E.coliBL21中表达，并鉴定出KshC为氧化亚基，且酶活远高于KshA。利用本实验室已构建的BL21/pET‑28a(+)‑fdh表达甲酸脱氢酶FDH，以KSH(KshB+KshC)和FDH工程菌的粗酶液作为生物催化剂，以甾体化合物AD为底物，同时确定了最佳反应温度为30℃，pH7.0。在最优条件下转化AD生成产物9‑OH‑AD，在20小时内，9‑OH‑AD的产量为4.7g/L，摩尔转化率达到96.7％。本发明产生9‑OH‑AD实现了3‑甾酮9α‑羟基化酶羟化系统与辅酶循环体系的偶联，具有效率高，成本低，绿色环保等优点。

权利要求

1.一种转化雄甾-4-烯-3,17-二酮生成9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮的组合物，其特征在于，所述组合物包括由3-甾酮9α-羟基化酶还原亚基KshB和3-甾酮9α-羟基化酶氧化亚基KshC组成的3-甾酮9α-羟基化酶混合酶液；编码所述3-甾酮9α-羟基化酶还原亚基KshB的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；编码所述3-甾酮9α-羟基化酶氧化亚基KshC的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括辅酶NAD+、NADH、甲酸脱氢酶或三者的任意组合。

3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述3-甾酮9α-羟基化酶还原亚基KshB的氨基酸序列为SEQ ID NO.4。

4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述3-甾酮9α-羟基化酶氧化亚基KshC的氨基酸序列为SEQ ID NO.5。

5.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物为由3-甾酮9α-羟基化酶还原亚基KshB和3-甾酮9α-羟基化酶氧化亚基KshC组成的3-甾酮9α-羟基化酶混合酶液、NADH和甲酸脱氢酶组成。

6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述3-甾酮9α-羟基化酶氧化亚基KshC、

3-甾酮9α-羟基化酶还原亚基KshB与甲酸脱氢酶按酶活添加比例为1～10:1～10:1～10。

7.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述NADH的添加量为0.01～1mol/L。

8.权利要求1所述的组合物的制备方法，其特征在于，所述方法具体是：

(1)以SEQ ID NO.2所示核酸序列为模板，扩增得到编码3-甾酮9α-羟基化酶还原亚基KshB的基因，将其克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a上，获得重组质粒pET-28a-kshB；

(2)以SEQ ID NO.3所示核酸序列为模板，扩增得到编码3-甾酮9α-羟基化酶氧化亚基KshC的基因，将其克隆到大肠杆菌表达载体pET-Duet1(+)上，获得重组质粒pET-Duet1(+)-kshC；

(3)将步骤(1)和步骤(2)的重组质粒分别转化至大肠杆菌中获得重组大肠杆菌BL21/pET-28a(+)-kshB和BL21/pET-Duet1(+)-kshC；

(4)利用步骤(3)的重组大肠杆菌发酵获得3-甾酮9α-羟基化酶还原亚基KshB和3-甾酮

9α-羟基化酶氧化亚基KshC组成的3-甾酮9α-羟基化酶混合酶液。

9.一种提高雄甾-4-烯-3,17-二酮转化生成9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮效率的方法，所述方法是利用权利要求1所述的组合物作为催化剂，进行生物转化。

10.权利要求1所述的组合物在生产甾体化合物领域的应用。

说明书

一种酶法转化生产9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种酶法转化生产9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮的方法，属于基因工程和酶工程领域。

背景技术

[0002] 甾体化合物是广泛存在于生物体组织内的一类重要的天然有机化合物，由于甾体类药物具有多种生理功能并发挥独特疗效，故在临床上有广泛的应用，是仅次于抗生素的第二大类药物，年增长率在15％以上。甾类化合物通常具有一系列独特的生理功能，这主要是由于甾体化合物母核上取代基、双键位置或立体构型的不同。甾类化合物拥有类似的结构且结构复杂数目繁多，普遍存在于动、植物组织和某些微生物中，比较常见的有动物组织中的胆固醇、胆酸、性激素、肾上腺皮质激素、孕酮和雄酮等植物中的薯预皂素和谷甾醇等以及酵母细胞中的麦角固醇等。

[0003] 9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-OH-AD)化学结构上9-羟基的存在，可借助常规甾体化学合成手段形成C9，11-双键体系，从而很方便地在C9位引入一个卤素原子形成糖皮质激素必不可缺少的功能羟基。9α-OH-AD是一种重要的甾体药物中间体，其9α位作为被羟基化的位点，在进行简单的卤化反应后便可引入F或Cl等卤素取代基，从而有效提升某些皮质类激素(如地塞米松、倍他米松、糠酸莫米松及氯地米松等药物)的药效，工艺流程的实现可根本解决目前工业生产中存在的C11α-羟基化转化率低、副产物多的问题，具有极高的商业价值。

[0004] 3-甾酮9α-羟基化酶(3-ketosteroid-9-alpha-hydroxylase(KSH))是甾体微生物代谢的一个关键酶，该酶在微生物中广泛存在，例如红球菌属Rhodococcus，诺卡氏菌属Nocardia，节杆菌属Arthrobacter，分枝杆菌属Mycobacteriu。3-甾酮9α-羟基化酶系统是一个双组分酶，由KshA(3-甾酮9α-羟基化酶氧化酶)和KshB(3-甾酮9α-羟基化酶还原酶)组成，由基因kshA和kshB分别编码KshA和KshB，这一点最早在Rhodococcus erythropolis SQ1中获得证实，且对Rhodococcus erythropolis SQ1所进行的基因敲除研究表明，kshA和kshB都是KSH表达所必需的组分。KshB是3-甾酮9α-羟基化酶系统的还原组件，它负责将来自NADH的还原力传递给KshA，使其从氧化态重新回到还原态并不断地在甾体的相应位置产生羟基化反应，另外，KshB是一个多功能酶，它不仅仅在3-甾酮9α-羟基化酶系统中发挥作用，在生物体内其他需要还原力的地方也发挥着重要的作用。

[0005] 甲酸脱氢酶(FDH)能催化甲酸分解生成CO2，同时将NAD+还原生成NADH，可与3-甾酮9α-羟基化酶系统结合。大量研究表明，FDH是最好的NADH再生酶，在手性化合物的合成中具有独特的优势：(1)FDH催化的反应不可逆，主反应产物回收率可达99％以上；(2)底物甲酸根离子较廉价，产物CO2易从体系中逃逸，简化分离纯化步骤；(3)FDH在较宽的耐受性，此反应只产生一种副产物-CO2，而CO2对任何酶的活性均没有任何影响，且反应完全，同时CO2作为一种气体，很容易从反应体系中逃逸出来。

发明内容

[0006] 为解决上述问题，本发明基于KSH和FDH的不同催化功能，成功建立了用粗酶液将雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)转化为9-OH-AD的方法，实现了羟化体系和辅酶再生体系的偶联。

[0007] 本发明的第一个目的是提供一种转化雄甾-4-烯-3,17-二酮生成9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮的组合物，所述组合物包括由3-甾酮9α-羟基化酶还原亚基KshB和3-甾酮9α-羟基化酶氧化亚基KshC组成的3-甾酮9α-羟基化酶混合酶液。

[0008] 在本发明的一种实施方式中，所述组合物还包括辅酶NAD+、NADH、甲酸脱氢酶或三者的任意组合。

[0009] 在本发明的一种实施方式中，所述3-甾酮9α-羟基化酶还原亚基KshB的氨基酸序列为SEQ ID NO.4。

[0010] 在本发明的一种实施方式中，所述3-甾酮9α-羟基化酶氧化亚基KshC的氨基酸序列为SEQ ID NO.5。

[0011] 在本发明的一种实施方式中，所述组合物为由3-甾酮9α-羟基化酶还原亚基KshB和3-甾酮9α-羟基化酶氧化亚基KshC组成的3-甾酮9α-羟基化酶混合酶液、NADH和甲酸脱氢酶。

[0012] 在本发明的一种实施方式中，所述3-甾酮9α-羟基化酶氧化亚基KshC、3-甾酮9α-羟基化酶还原亚基KshB与甲酸脱氢酶按酶活添加比例为1～10:1～10:1～10。

[0013] 在本发明的一种实施方式中，所述NADH的添加量为0.01～1mol/L。

[0014] 本发明的第二个目的是所述组合物的制备方法，所述方法具体是：

[0015] (1)以SEQ ID NO.2所示核酸序列为模板，扩增得到编码3-甾酮9α-羟基化酶还原亚基KshB的基因，将其克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a上，获得重组质粒pET-28a-kshB；

[0016] (2)以SEQ ID NO.3所示核酸序列为模板，扩增得到编码3-甾酮9α-羟基化酶氧化亚基KshC的基因，将其克隆到大肠杆菌表达载体pET-Duet1(+)上，获得重组质粒pET-Duet1(+)-kshC；

[0017] (3)将步骤(1)和步骤(2)的重组质粒分别转化至大肠杆菌中获得重组大肠杆菌BL21/pET-28a(+)-kshB和BL21/pET-Duet1(+)-kshC；

[0018] (4)利用步骤(3)的重组大肠杆菌发酵获得3-甾酮9α-羟基化酶还原亚基KshB和3-甾酮9α-羟基化酶氧化亚基KshC组成的3-甾酮9α-羟基化酶混合酶液。

[0019] 本发明的第三个目的是提供一种提高雄甾-4-烯-3,17-二酮转化生成9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮效率的方法，所述方法是利用上述组合物作为催化剂，进行生物转化。

[0020] 本发明的第四个目的是提供所述组合物在医药领域的应用。

[0021] 本发明的有益效果：

[0022] 本发明利用分子技术克隆了来自Mycobacterium sp.Strain VKM Ac-1817D的3-甾酮9α-羟基化酶的氧化亚基基因kshA，还原亚基基因kshB，及未知活性亚基基因kshC，构建重组表达载体pET-28a(+)-kshA，pET-28a(+)-kshB，pET-Duet1(+)-kshC并通过化学方法将其转化至E.coli BL21中，成功构建了基因工程菌BL21/pET-28a(+)-kshA，BL21/pET-28a(+)-kshB，BL21/pET-Duet1(+)-kshC，鉴定出KshC为氧化亚基。并利用本实验室已构建的BL21/pET-28a(+)-fdh，酶活测定结果发现KSH(KshB+KshC)和FDH的酶活分别为5.66U/mL和0.25U/mL。基于获得的基因工程菌，通过细胞破碎获得每株工程菌的粗酶液，用于转化AD产生9-OH-AD进行了初步研究，在20小时内，9-OH-AD的产量为4.7g/L，摩尔转化率达到
96.7％。

具体实施方式

[0023] KSH测定体系包括：105μM NADH，200μM底物AD(溶于100％异丙醇)，50m Tris-HCL(200μL，pH7.0)，以及KSH酶。因此其活性定义为，1min内氧化甾体底物AD所需要的酶量，表-1 -1示为1min内氧化1nmol NADH所需要的酶量，比活力单位为nmol min mg (U/mg)。

[0024] FDH酶活测定方法：配制17mg·mL-1的甲酸钠溶液(pH 7.5)，3mg·mL-1的NAD+溶液,取1.48mL的甲酸钠溶液置于石英比色皿中，依次加入80μLNAD+溶液和10μL粗酶液，在340nm下检测每分钟的吸光值变化，酶活定义单位为1min催化1μmol NAD+转化成NADH所需的酶量。

[0025] HPLC分析：AD与9-OH-AD在254nm紫外波长下均有特征吸收峰，所以采用HPLC法制定10μL，流速：1.0ml/min。

[0026] LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L(固体培养基加入2％琼脂粉)[0027] 实施例1：3-甾酮9α-羟基化酶引物设计

[0028] 根据NCBI中Mycobacterium sp.Strain VKMAc-1817D的全基因组核酸序列中kshA基因序列(SEQ ID NO.1)，设计3-甾酮9α-羟基化酶氧化亚基KshA的PCR引物P1和P2(SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7)。

[0029] P1：5’-CGGGATCCATGACGACTGAGCACGCCGG-3’(BamH I)

[0030] P2：5’-CCCAAGCTTTCAGCTTGATTGAGCGGTTTC-3’(Hind III)

[0031] 根据NCBI中Mycobacterium sp.Strain VKMAc-1817D的全基因组核酸序列中kshB基因序列(SEQ ID NO.2)，设计3-甾酮9α-羟基化酶还原亚基KshB的PCR引物P3和P4(SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9)。

[0032] P3：5’-CGGGATCCATGACTGATGAACCGTTAGGTAG-3’(BamH I)

[0033] P4：5’-CCCAAGCTTTCACTCGTCGTAGGTCACCTC-3’(Hind III)

[0034] 根据NCBI中Mycobacterium sp.Strain VKMAc-1817D的全基因组核酸序列中kshC基因序列(SEQ ID NO.3)，设计3-甾酮9α-羟基化酶KshC的PCR引物P5和P6(SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11)。

[0035] P5：5’-CGGGATCCGATGGCCGGTCTGAACAACGATAG-3’(BamH I)

[0036] P6：5’-CCCAAGCTTTCAGCCGCTGGCCGGGGCGGCC-3’(Hind III)

[0037] 实施例2：3-甾酮9α-羟基化酶基因kshA，kshB，kshC的克隆

[0038] 以合成的DNA为模板，利用上面提供的引物做PCR扩增，扩增条件为：94℃预变性，5min，一个循环；94℃变性，l min，58℃返火，l min，72℃延伸，90s，34个循环；72℃终延伸
10min。PCR扩增体系：模板1μL，上下游引物各0.4μL，dNTP Mix 4μL，10x Ex Taq Buffer5μL，灭菌的双蒸水37μL，Ex Taq DNA聚合酶1μL。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。回收产物存放在1.5ml的离心管中，20℃冰箱保存备用。回收产物与pMD18-TVector连接，连接产物转化E.coil JM109，转化产物涂布含氨苄抗性的LB平板，经37℃培养过夜，挑取菌落到10ml液体LB培养基中，37℃摇床过夜培养后提取质粒，命名为pMD18T-kshA，pMD18T-kshB，pMD18T-kshC，经酶切验证连接成功后，加入甘油至终浓度15％～20％(w/v)，-70℃冰箱保藏。

[0039] 实施例3：重组表达载体pET-28a(+)-kshA，pET-28a(+)-kshB，pET-Duet1(+)-kshC的构建

[0040] 提取保存于E.colijM109中的质粒pMD18T-kshA，pMD18T-kshB，pMD18T-kshC和pET-28a(+)，pET-Duet1(+)并分别用BamHI/HindIII进行双酶切，利用凝胶回收试剂盒回收后进行连接，连接体系:目的基因酶切产物7μL，pET-28a(+)或pET-Duet1(+)酶切产物1μL，T4DNA连接酶buffer 111L，T4DNA连接酶1μL，16℃过夜连接。将连接好的重组质粒pET-28a(+)-kshA，pET-28a(+)-kshB，pET-Duet1(+)-kshC转化到感受态E.coiljM109，用LB卡那霉素抗性和氨苄抗性培养基，挑取阳性菌落。37℃摇床过夜培养后提取质粒，命名为pET-28a(+)-kshA，pET-28a(+)-kshB，pET-Duet1(+)-kshC，酶切验证正确后，加入甘油至终浓度15％-20％(w/v)，-70℃冰箱保藏备用。

[0041] 实施例4：重组质粒pET-28a(+)-kshA，pET-28a(+)-kshB，pET-Duet1(+)-kshC转化E.coli BL21

[0042] E.coli BL21感受态制备：(1)从LB平板上挑取新活化的单菌落，接种于10mL的LB液体培养基中培养12h左右，再将该菌悬液以1％的接种量接种于50mL的LB液体培养基培养2-3h，直至OD600达到0.5左右。(2)将菌液置于冰水浴中15min，使菌液迅速冷却。(3)分装菌液于若干个1.5mL离心管中，8000rpm离心1min后弃去上洁，用。.1M的CaCl2溶液洗细胞2-3次。(4)经过清洗的菌液用80μL Ca Cl2和40μL50％的甘油悬浮后，于-40℃长期保存。

[0043] 转化：将10μL重组质粒pET-28a(+)-kshA，pET-28a(+)-kshB，pET-Duet1(+)-kshC各加入到两管E.coli BL21感受态细胞中，轻轻混匀后置于冰上45min，然后42℃水浴热激90s后再置于冰上5min，然后加入800μL LB液体培养基后置于37℃培养1h后，8000rpm离心
1min弃去上洁，将剩余菌液涂布于含卡那霉素抗性和氨苄抗性的LB平板上，370℃培养后挑取阳性菌落，提取质粒酶切验证，得到重组菌BL21/pET-28a(+)-kshA，BL21/pET-28a(+)-kshB和BL21/pET-Duet1(+)-kshC。

[0044] 实施例5：KshC的功能鉴定及3-甾酮9α-羟基化酶活力测定

[0045] 将实施例4构建的重组菌BL21/pET-28a(+)-kshA，BL21/pET-28a(+)-kshB与出发菌株BL21/pET-28a(+)分别接种于10ml含卡那霉素的LB培养基中，BL21/pET-Duet1(+)-kshC接种于10ml含氨苄的LB培养基中37℃振荡培养过夜，次日按1％的接种量转接于50ml LB培养基中，37℃培养2h后至OD600为0.8时加入终浓度为0.8mM的IPTG，28℃诱导9h后将菌液于4℃，10000r/min离心10min，pH 7.5的磷酸盐缓冲液(Na2HP04-NaH2P04)清洗2次，最后用5ml pH 7.5磷酸盐缓冲液悬浮。超声波破碎处理制备粗酶液。

[0046] KSH测定体系为105μM NADH，200μM底物AD(溶于100％异丙醇)，50m Tris-HCL(200μL，pH7.0)，以及KSH酶(包括氧化亚基与还原亚基)。通过验证，KshC为氧化亚基，且在保证诱导培养细胞浓度相同的情况下，相同添加量的KshB粗酶液+KshC粗酶液一起作用的酶活为30.7U/mL，远高于KshA与KshB粗酶液共同作用的KSH酶活6.1U/mL，前者是后者的5.4倍，而原始菌E.coli BL21/pET-28a(+)并没有检测到KSH的酶活，从而实现了在E.coli BL21中3-甾酮9α-羟基化酶酶活力的从无到有。

[0047] 实施例6：利用3-甾酮9α-羟基化酶转化AD生成9-OH-AD

[0048] 将实施例5获得的KshA或KshC粗酶液和KshB粗酶液以酶量添加量为1:1.5的比例加入到10mL转化体系：0.1M Tris-Hcl缓冲液，pH 7.0，0.32mMol NADH，1g·L-1底物AD(先溶于乙酸乙酯)和粗酶混合液(KshA+KshB或KshC+KshB)，用20％甲酸和50％氨水调节pH，转速160r·min-1，30℃转化20h，且需要适时补加底物AD及辅酶NADH，结果表明，KshA+KshB粗酶液转化体系中9-OH-AD的产量为0.98g/L,而KshC+KshB粗酶液转化体系的9-OH-AD产量为7.8g/L。由此看出3-甾酮9α-羟基化酶的氧化亚基KshC比KshA有更好的效果。

[0049] 实施例7：E.coli BL21/pET-28a(+)-fdh甲酸脱氢酶活力测定

[0050] 将本实验室构建的重组菌E.coli BL21/pET-28a(+)-fdh接种于10ml含卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，次日按1％的接种量转接于50ml LB培养基中，37℃培养2h后至OD600为0.8时加入终浓度为0.8mM的IPTG，28℃诱导9h后将菌液于4℃，10000r/min离心10min，(Na2HP04-NaH2P04)清洗2次，最后用5ml pH 7.5磷酸盐缓冲液悬浮。超声波破碎处理制备粗酶液。

[0051] 配制17mg/mL的甲酸纳溶液(pH 7.5)，3mg/mL的NAD+溶液，取1.48mL的甲酸纳溶液置于石英比色皿中，依次加入80μLNAD+溶液和10μL粗酶液，在340nm下检测每分钟的吸光值变化，酶活定义单位为1min催化1umol NAD+转化成NADH所需的酶量。结果表明重组菌E.coli BL21/pET-28a(+)-fdh的酶活为0.25U/mL。

[0052] 实施例8：利用3-甾酮9α-羟基化酶和甲酸脱氢酶转化AD生成9-OH-AD[0053] 将通过超声破碎所获得的3-甾酮9α-羟基化酶和甲酸脱氢酶(FDH)粗酶液按照酶活添加量为1:0.5的比例加入到25mL转化体系：0.1M Tris-Hcl缓冲液，pH 7.0，包含10g·L-1甲酸铵，0.25mmol NAD+或者NADH任一种，10g·L-1底物AD(先溶于乙酸乙酯)和粗酶混合液(KSH和FDH)，用20％甲酸和50％氨水调节pH，转速160r·min-1，30℃转化20h，且需要适时补加底物，同时以不添加NAD+，NADH或FDH作为对照实验，结果如表1所示，3-甾酮9α-羟基化酶为KshC+KshB粗酶液时，且添加FDH+NADH参与辅酶再生时，9-OH-AD的产量为9.7g/L，摩尔转化率达到97％。

[0054] 综上所述，可得产量结果如下表：

[0055] 表1不同酶液和辅酶添加合成9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮

[0056]

[0057] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。