双生物光学窗口靶向纳米生物探针的制备与应用方法

摘要

本发明公开了一种双生物光学窗口(650‑1000nm)靶向纳米生物探针的制备与应用。首先以二烯基芴衍生物和窄带隙的芳香杂环基团采用双组分交替共聚的方法，进行有机金属催化的Heck反应，得到中性聚合物，再通过季铵化反应得到一种主链为D‑π‑A结构，同时具有双光子吸收和近红外发射性质的阳离子型水溶性共轭聚合物，其激发和发射波长均处于生物光学窗口(即双生物光学窗口)；再将此阳离子型水溶性共轭聚合物和带相反电荷的肿瘤靶向生物分子通过纳米沉淀法制备得到靶向纳米生物探针，能够实现双生物光学窗口肿瘤靶向双光子荧光细胞成像。

权利要求

1.一种双生物光学窗口靶向纳米生物探针，其特征在于该生物探针基于双光子吸收近红外发射的阳离子型水溶性共轭聚合物和带相反电荷的肿瘤靶向生物分子组成，所述的双生物光学窗口为650-1000nm；该探针中阳离子型水溶性共轭聚合物的共轭主链作为疏水部分，带相反电荷的肿瘤靶向生物分子作为亲水部分，两者通过静电、疏水作用结合后自组装，形成由亲水外壳和疏水内核组成的纳米粒子；

所述的双光子吸收近红外发射的阳离子型水溶性共轭聚合物具有如下分子式：

其中，9位取代的芴基为电子给体，简称D，烯键为共轭桥，窄带隙的芳香杂环Ar为电子受体，简称A，得到一种共轭主链为D-π-A的结构；聚合度n为大于1的自然数，所述的Ar为4,7-双(噻吩-2基)-2,1,3-苯并噻二唑基团或4,7-双(噻吩-2基)-2,1,3-苯并硒二唑基团中的一种；

所述的阳离子型水溶性共轭聚合物，

a.当Ar为4,7-双(噻吩-2基)-2,1,3-苯并噻二唑基团时，其结构式如下：b.当Ar为4,7-双(噻吩-2基)-2,1,3-苯并硒二唑基团时,其结构式如下：

2.一种如权利要求1所述的双生物光学窗口靶向纳米生物探针的制备方法，其特征在于该制备方法为纳米沉淀法：将阳离子型水溶性共轭聚合物溶解在能和水混溶的极性有机溶剂中，然后将溶液在超声状态下迅速加入到带相反电荷的肿瘤靶向生物分子水溶液中，室温搅拌一段时间后静置，以形成稳定的分散的纳米粒子，再通过挥发法或透析法除去极性有机溶剂，冷冻干燥除去水，最后得到靶向纳米生物探针。

3.根据权利要求2所述的双生物光学窗口靶向纳米生物探针的制备方法，其特征在于，所述阳离子型水溶性共轭聚合物的制备方法为：

1)采用有机金属催化的Heck聚合反应，通过A+B双组分交替共聚的方法先合成中性共轭聚合物，其中，A为二烯基芴衍生物单体，B为窄带隙的二溴芳香杂环单体；

2)由步骤1)制备得到的中性共轭聚合物再通过季铵化反应得到双生物光学窗口阳离子型水溶性共轭聚合物。

说明书

双生物光学窗口靶向纳米生物探针的制备与应用方法

技术领域

[0001] 本发明属于化学/生物传感、荧光成像材料技术领域，具体涉及双光子吸收近红外发射的阳离子型水溶性共轭聚合物和带相反电荷的肿瘤靶向生物分子结合制备靶向纳米生物探针,以及其在化学/生物传感、荧光生物成像方面的应用。

背景技术

[0002] 水溶性共轭聚合物主要是指在主链上引入带有离子官能团侧链的共轭聚合物，这类聚合物因官能团侧链的引入从而表现出在水或其它极性有机溶剂中良好的溶解性，同时还保留了共轭聚合物的特性，如：优良的半导体性能、高摩尔消光系数、荧光信号放大效应等。近年来，水溶性共轭聚合物由于其强的光捕获能力、分子导线效应、超分子自组装性能和生物相容性好等诸多优点，在荧光传感、生物成像和诊疗等方面引起了广泛的研究兴趣。研究表明，在红光/近红外光区(650–1000nm)，生物组织对光的吸收和散射较少，光对生物组织的穿透能力更强,同时生物的自发荧光更弱，背景荧光干扰更低，因而有利于对活体进行深度成像检测。因此,这个区域被称为生物光学窗口,开发激发和发射波长在此窗口的探针材料对提高荧光成像效果至关重要。

[0003] 双光子吸收理论最早于1931年为Goppert-Mayer所预测，至1961年Kaiser等在CaF2:Eu2+晶体中观测到双光子激发现象，双光子理论得以证实。与单光子相比，双光子技术所采用的激发光波长较长(700—1000nm)，这一波段的光对生物体的光损伤小，对样本的穿透能力强，同时具有三维成像能力，在生物成像研究领域有着无可比拟的优越性。

[0004] 过去研究的很多水溶性共轭聚合物只有激发或发射波长处于生物光学窗口，激发和发射波长均处于生物光学窗口的双生物光学窗口材料仍十分少见。而且，很多纳米荧光探针只具有被动靶向作用，而主动靶向作用能够进一步显著提升生物成像效果。因此，本发明以具有优异荧光发射性质的芴为电子给体(D)，以烯键为共轭桥，以窄带隙的芳香杂环为电子受体(A)，得到一种主链为D-π-A结构，具有双光子吸收性质的阳离子型水溶性共轭聚合物，并且窄带隙芳香杂环的引入使其同时具有近红外发射性质。研究结果表明，这种聚合物在水中具有较高的荧光量子效率，本身具有较好的生物成像能力，并且能够和带相反电荷的肿瘤靶向生物分子通过静电、疏水等超分子相互作用结合制备成靶向纳米生物探针，实现双生物光学窗口肿瘤靶向双光子荧光细胞成像。

发明内容

[0005] 技术问题：本发明的目的在于提出一种双生物光学窗口靶向纳米生物探针的制备与应用方法，该类探针由于同时具有双光子吸收和近红外发射性质，在荧光生物成像时对生物体的光损伤小、对生物组织的穿透能力更强，分辨率和对比度高，而且对肿瘤细胞具有主动靶向作用，从而使其在化学/生物传感和荧光成像方面有着潜在的广泛应用前景。

[0006] 技术方案：本发明的一种双生物光学窗口靶向纳米生物探针基于双光子吸收近红外发射的阳离子型水溶性共轭聚合物和带相反电荷的靶向生物分子，所述的双生物光学窗口为650-1000nm，该探针中阳离子型水溶性共轭聚合物的共轭主链作为疏水部分，带相反电荷的靶向生物分子作为亲水部分，两者通过静电、疏水作用结合后自组装，形成由亲水外壳和疏水内核组成的纳米粒子。

[0007] 所述的阳离子型水溶性共轭聚合物具有如下分子式：

[0008]

[0009] 其中，9位取代的芴基为电子给体，简称D，烯键为共轭桥，窄带隙的芳香杂环Ar为电子受体，简称A，得到一种共轭主链为D-π-A的结构；聚合度n为大于1的自然数，R，R’选自下列基团：R1R2R3R4N+；这里R1，R2，R3，R4，分别为烷基、烷氧基中的一种。

[0010] 所述的Ar为4,7-双(噻吩-2基)-2,1,3-苯并噻二唑基团或4,7-双(噻吩-2基)-2,1,3-苯并硒二唑基团中的一种。

[0011] 所述的阳离子型水溶性共轭聚合物，

[0012] a.当Ar为4,7-双(噻吩-2基)-2,1,3-苯并噻二唑基团时，其中一种典型的结构如下：R和R’均位于芴基的9位上，R和R’的结构都是R1R2R3R4N+，R1为烷氧基，R2、R3和R4均为烷基；其结构式如下：

[0013]

[0014] b.当Ar为4,7-双(噻吩-2基)-2,1,3-苯并硒二唑基团时，其中一种典型的结构如下：R和R’均位于芴基的9位上，R和R’的结构都是R1R2R3R4N+，R1为烷氧基，R2、R3和R4均为烷基。其结构式如下：

[0015]

[0016] 本发明的双生物光学窗口靶向纳米生物探针的制备方法为纳米沉淀法：

[0017] 将阳离子型水溶性共轭聚合物溶解在能和水混溶的极性有机溶剂中，然后将溶液在超声状态下迅速加入到带相反电荷的肿瘤靶向生物分子水溶液中，室温搅拌一段时间后静置，以形成稳定的分散的纳米粒子，再通过挥发法或透析法除去极性有机溶剂，冷冻干燥除去水，最后得到靶向纳米生物探针。

[0018] 其中，所述阳离子型水溶性共轭聚合物的制备方法为：

[0019] 1)采用有机金属催化的Heck聚合反应，通过A+B双组分交替共聚的方法先合成中性共轭聚合物，其中，A为二烯基芴衍生物单体，B为窄带隙的二溴芳香杂环单体；

[0020] 2)由步骤1)制备得到的中性共轭聚合物再通过季铵化反应得到双生物光学窗口阳离子型水溶性共轭聚合物。

[0021] 本发明的一种双生物光学窗口靶向纳米生物探针应用在肿瘤靶向双光子荧光细胞成像中，该应用方法包括以下步骤：

[0022] 1)制备双光子吸收近红外发射的阳离子型水溶性共轭聚合物；

[0023] 2)将上述阳离子型水溶性共轭聚合物与带相反电荷的靶向生物分子结合，制备靶向纳米生物探针；

[0024] 3)将上述靶向纳米生物探针用于激光共聚焦双光子荧光成像，实现肿瘤靶向双生物光学窗口双光子荧光细胞成像。

[0025] 有益效果：在本发明中，采用纳米沉淀法制备得到一种双生物光学窗口靶向纳米生物探针。其中，双生物光学窗口阳离子型水溶性共轭聚合物在水中具有较高的荧光量子效率，可用800nm波长激发，其近红外荧光发射范围在650-850nm，在生物成像方面有较大的优势；其与带相反电荷的靶向生物分子结合制备的靶向纳米生物探针有利于细胞进行内吞作用，在有效改善材料被细胞膜吸附的问题的同时还具有靶向功能，从而能够更好地实现基于近红外发射的肿瘤靶向双光子荧光细胞成像，从而使这类材料在化学/生物传感和荧光成像方面有着潜在的广泛应用前景。

附图说明

[0026] 图1.为本发明制备的阳离子型水溶性共轭聚合物P1’在水中的紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱，浓度为1×10-5mol/L。

[0027] 图2.为本发明制备的阳离子型水溶性共轭聚合物P1’和靶向生物分子透明质酸(HA)结合制备的靶向纳米生物探针的透射电镜(TEM)图像。

[0028] 图3.为本发明制备的靶向纳米生物探针的HeLa细胞激光共聚焦荧光显微镜双光子模式下的细胞成像(激发波长：800nm，收集波长范围：650-750nm)。

具体实施方式

[0029] 为了更好地理解本发明的内容，下面通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，但不能以此来限制本发明的范围。

[0030] 实施例1：

[0031] 1)通过以下方法制备单体(1)，将(1)和(2)按物质的量比为1:1投料，然后在Pd(OAc)2/P(o-tolyl)3催化下通过Heck反应将二者偶联起来，反应12小时后，即得到中性水溶性共轭聚合物P1；进一步用碘甲烷进行季铵化反应，反应3天，得到阳离子型水溶性共轭聚合物P1’。

[0032]

[0033] 2)按照电荷比例1:5，将步骤1)中制备的阳离子型水溶性共轭聚合物P1’甲醇溶液快速注入到的超声环境下HA水溶液中，快速搅拌10分钟，缓慢搅拌6小时，静置过夜，冷冻干燥，得到靶向纳米生物探针。HA的结构式如下。

[0034]

[0035] 3)将步骤2)中制备的靶向纳米生物探针进行TEM测试后用于肿瘤靶向双光子荧光细胞成像。