雌激素受体ER-α36抗原多肽及其单克隆抗体

摘要

本发明提供了雌激素受体ER‑α36的一种新的鼠源单克隆抗体，其是以ER‑α36受体的高度保守蛋白序列为基础，设计合成4种不同多肽，与载体蛋白偶联作为免疫原，将上述4种免疫原混合后免疫小鼠，制备筛选得到一株杂交瘤细胞株4E11。该细胞株分泌的单克隆抗体能够特异性识别ER‑α36蛋白，为开发ER‑α36免疫诊断产品提供了新的候选抗体。

权利要求

1.一种特异性地识别ER-α36蛋白的单克隆抗体，其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ NO .9所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ NO .10所示。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其是以ER-α36特异的高度保守蛋白序列为基础，设计合成4种不同抗原多肽，与载体蛋白偶联作为免疫原，将上述4种免疫原混合后免疫小鼠制备获得，所述多肽选自ER-α36特异的氨基酸序列 SEQ NO.13。

3.根据权利要求2所述的单克隆抗体，所述载体蛋白为KLH。

4. 根据权利要求2所述的单克隆抗体，所述4种抗原多肽为：SEQ NO.4，SEQ NO.6，SEQ NO.7，SEQ NO.8。

5.根据权利要求1所述的单克隆抗体，重链恒定区选自鼠的IgG2b。

6.根据权利要求1所述的单克隆抗体，轻链恒定区选自鼠Kappa链。

7.一种含有权利要求1-6任一权利要求所述单克隆抗体的检测试剂盒。

8.权利要求1-6任一权利要求所述的单克隆抗体在制备用于检测ER-α36蛋白表达药物中的应用。

说明书

雌激素受体ER-α36抗原多肽及其单克隆抗体

技术领域

[0001] 本发明涉及细胞工程技术领域，具体涉及4种ER-α36特异性抗原多肽和1 种特异抗ER-α36蛋白的单克隆抗体。

背景技术

[0002] 雌激素受体ER-α36是新发现的一种雌激素受体亚型主要表达在细胞膜上，介导非基因组雌激素信号通路，并且能抑制传统的雌激素信号通路，在细胞的正常生理和疾病发生及发展过程中起到至关重要的作用。其表达水平与癌症的一些生物学指标如淋巴结转移、肿瘤细胞分化和肿瘤分期及分级有着密切联系。

[0003] 在临床回顾性研究中发现，709例乳腺癌样本中，约70％都检测到ER-α36 的表达，更重要的是，在因缺少ER-α66表达而归属于雌激素受体阴性的乳腺癌样本中，有41％检测出ER-α36的表达。此外，ER-α36在白血病、子宫内膜癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌和结肠癌中都有所表达。因此，ER-α36及其介导的信号通路在这些癌症，尤其是乳腺癌的发生和发展过程中，可能发挥着重要作用。显示出开发针对ER-α36的检测试剂和抗肿瘤药物的迫切性和重要性。

[0004] ER-α36主要表达在细胞膜上和细胞质中，不同于ER-α66主要存在于细胞核中。这种表达模式将有利于针对ER-α36抗体药物的开发。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供4种ER-α36特异的抗原多肽。

[0006] 本发明的另一目的是提供能与ER-α36蛋白特异性结合的单克隆抗体。

[0007] 本发明通过以下技术方案实现上述目的：

[0008] 首先筛选合适的多肽序列，ER-α36蛋白共有310个氨基酸，经过对其进行穿膜区域、保守区域等多方面的研究，最终筛选确定4种多肽序列作为抗原。

[0009] 优选地，4种多肽序列如下所示：

[0010] hER-α36-1：EYDPTRPFSE(SEQ NO.6)

[0011] hER-α36-2：QGKCVEGMVE(SEQ NO.4)

[0012] hER-α36-3：SHVEAKKRIL(SEQ NO.7)

[0013] hER-α36-4：IFGNKWFPRV(SEQ NO.8)

[0014] 该抗ER-α36单克隆抗体的制备方法如下：

[0015] (1)ER-α36抗原多肽化学合成，与KLH(keyhole limpet hemocyanin，血蓝蛋白)偶联后混合免疫BALB/c小鼠；

[0016] (2)杂交瘤细胞株制备与筛选：取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，培养，采用间接ELISA方法检测筛选，得到能分泌单克隆抗体clone 4E11 的杂交瘤细胞株；

[0017] (3)单克隆抗体clone 4E11的鉴定和可变区基因扩增：收集clone 4E11的杂交瘤细胞沉淀，使用RNA柱提取试剂盒提取总RNA，使用反转录试剂盒 (Thermo)以RNA为模板，Oligo(dT)为引物，反转录合成cDNA第一链。以cDNA第一链为模板，使用抗体可变区通用引物PCR扩增VH、VL基因，获得重链和轻链可变区产物片段，将获得的序列翻译成氨基酸序列得到clone 4E11 抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ NO.9所示，重链可变区的氨基酸序列如 SEQ NO.10所示。

[0018] (4)单克隆抗体clone 4E11的制备：将clone 4E11的重链VH和轻链VK 基因分别克隆到真核表达载体中，载体质粒中分别带有重链IgG2b(SEQ NO.11) 和轻链κ链(SEQ NO.12)的恒定区基因，提取载体质粒，转染，使用protein A 亲和柱纯化得到所述单克隆抗体clone 4E11。

[0019] 本发明扩增得到的单克隆抗体能够特异性地识别ER-α36蛋白，将这个单克隆抗体命名为clone 4E11。ELISA实验结果表明该抗体具有较高的亲和力，可用于ER-α36蛋白及上述多肽的检测，具有高特异性、高灵敏度的优点，在临床检测和实验研究中将会广泛应用。

附图说明

[0020] 图1为ER-α66及其异构体氨基酸序列比对示意图，其中P03372-1为ER-α66； P03372-2为ER-α66 255-366氨基酸缺失的变体；P03372-3为ER-α46，1-173位氨基酸缺失；P03372-4为1-173位氨基酸缺失，458-595位氨基酸被取代。

[0021] 图2为计算机软件分析蛋白结构和抗原设计位点；

[0022] 图3为clone 4E11单克隆抗体SDS-PAGE电泳图；

[0023] 图4为重链和轻链可变区PCR产物电泳图；

[0024] 图5为基于包埋细胞的ELISA方法比较不同抗体的亲和力。

具体实施方式

[0025] 本发明详细的实施方法参见实施例，实施例中所述的实验方法和试剂，若无特殊说明均为常规实验方法和试剂。以下实施例仅用于说明和解释本发明，而不是以任何方式限制本发明。

[0026] 实施例1.ER-α36抗原多肽设计

[0027] 以ER-α36蛋白为研究对象，蛋白立体结构如图2所示。ER-α36是ERα的剪接变异体，与其它ER-α结构有所不同，氨基酸序列对比示意图如图1所示， ER-α36缺乏转录激活域但保留了ER-α66的DNA结合、二聚体及配体结合域，其C端最后的138个氨基酸由ER-α基因的外显子7编码，外显子8被额外的独特的27个氨基酸序列的C末端取代。

[0028] 通过蛋白质软件对ER-α66全长氨基酸序列进行分析，在其中与ER-α36重叠位置分析胞内和胞外段序列，筛选寻找适合作为抗原肽段的位置，约10个氨基酸长度，在保守区内，筛选条件需要兼顾亲水性、表露性、柔韧性、免疫原性及结构分析，经过大量筛选，发明人得到表1中的6个氨基酸序列。

[0029] 表1

[0030]

[0031]

[0032] 对以上得到的6个序列，考察其α-螺旋、β-转角、亲水性以及抗原指数，最后选择其中2个作为抗原肽段(SEQ NO.4和SEQ NO.6)；同时考虑在蛋白C端关键特异27个氨基酸区域内寻找新的抗原设计位点，最后在该区域两端各选定 1段序列作为抗原肽段。以上获得的4个肽段设计位置确保了能涵盖蛋白C端关键特异27个氨基酸区域及其临近LBD区域。将选择的氨基酸序列进行抗原表位等特性预测，应用IEDB(immune epitope database，IEDB)，同时通过蛋白质软件和protein blast分析确定。4个肽段名称和序列如下所示：

[0033] hER-α36-1：EYDPTRPFSE(SEQ NO.6)

[0034] hER-α36-2：QGKCVEGMVE(SEQ NO.4)

[0035] hER-α36-3：SHVEAKKRIL(SEQ NO.7)

[0036] hER-α36-4：IFGNKWFPRV(SEQ NO.8)

[0037] 实施例2制备抗ER-α36蛋白的单克隆抗体

[0038] (1)多肽合成与动物免疫

[0039] 根据实施例1设计的抗原多肽进行化学合成，使用碳化二亚胺法将多肽偶联于载体蛋白KLH，制备步骤如下：取30mg多肽和50mgEDC.HCl分别加入0.5 ml去离子水充分溶解，混合后4℃搅拌反应30min；将5mg KLH溶于1ml去离子水中，将其缓慢滴加入搅拌反应液中，调节pH至7.4，4℃搅拌反应过夜；维持温度和pH值不变，采用透析法纯化反应液，收集终产物分装于-20℃保存。采用光谱法测定产物的吸光值，计算偶联率和浓度。

[0040] 动物免疫：选择6-8周龄的BALB/c小鼠，按照每只注射量100ug计算，与等体积的完全弗氏佐剂混合乳化，进行皮下多点注射。二、三次免疫以后小鼠尾静脉采血，收集血清，间接ELISA法检测抗体滴度，选择效价高(1:5000以上) 的小鼠进行加强免疫后准备细胞融合。

[0041] (2)制备杂交瘤细胞系

[0042] 选择小鼠骨髓瘤SP2/0细胞株用含10％胎牛血清的DMEM培养基培养，细胞呈半贴壁状态，保持对数生长状态传代3代后，收集细胞，计算活细胞数。取加强免疫3天后的小鼠，收集小鼠脾细胞，制备单细胞悬液，计算活细胞数，与对数生长期的SP2/0细胞按5:1比例混合，在PEG1450介导下进行融合，稀释后加入96孔板培养。使用HAT和HT培养基进行选择性培养，观察细胞生长状态，直至杂交瘤细胞团生长到足够大小，取上清采用间接ELISA法检测。设待检样品A450的值为P，阴性对照A450值为N，当P/N>2.0时判为阳性，P/N<1.5判为阴性。最终筛选到4个分泌阳性抗体的细胞孔，上清样品滴度如下表所示。对所得4个阳性克隆株进行亚克隆，采用有限稀释法(一般稀释至0.8个细胞/孔)，使一部分孔板中仅有单个细胞生长分裂，当细胞覆盖大于10％孔底时，吸取培养基上清使用ELISA法检测抗体滴度。经过3次亚克隆筛选，有3个阳性克隆细胞孔的抗体滴度逐渐降低，亚克隆阳性率低于70％，无法稳定分泌抗体；仅有一株分泌特异性抗体的细胞株(4E11)，3次亚克隆后阳性率约为80％，进行扩大培养用于扩增抗体基因。

[0043] 表2

[0044]

[0045] 实施例3单克隆抗体clone 4E11的鉴定和可变区基因扩增

[0046] 采用小鼠抗体亚类鉴定试剂盒检测细胞培养上清液，结果显示，clone 4E11 的抗体亚型为IgG2b。

[0047] 收集clone 4E11的杂交瘤细胞沉淀(细胞数1X106以上)，使用RNA柱提取试剂盒(Qiagen)提取总RNA，使用反转录试剂盒(Thermo)以RNA为模板， Oligo(dT)为引物，按照说明书步骤操作，反转录合成cDNA第一链。以cDNA 第一链为模板，使用抗体可变区通用引物PCR扩增VH、VL基因，获得重链和轻链可变区产物片段；使用1％的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，结果如图3所示，扩增出的VH和VL片段约350bp，与理论大小相符。胶回收纯化试剂盒回收目的片段，将非功能VK基因产物使用限制性内切酶BciVI去除，分别将产物克隆至pMD18-T载体，采用热激法转化大肠杆菌E.coli TOP10，挑取单克隆菌落培养，提取质粒测序；使用IMGT/V-QUEST数据库进行测序结果比对，进一步分析，将获得的序列翻译成氨基酸序列。clone 4E11抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ NO.9所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ NO.10所示。

[0048] 实施例4Clone 4E11全长抗体的制备

[0049] 将clone 4E11的重链VH和轻链VK基因分别克隆到真核表达载体中，载体质粒中分别带有重链IgG2b和轻链κ链的恒定区基因。

[0050] 使用去内毒素质粒提取试剂盒提取载体质粒，经0.22μm过滤器过滤除菌，测定DNA浓度。将HEK-293F细胞按1x106cells/ml的密度接种到30ml培养基；按照1:1比例混合质粒DNA与线性PEI转染试剂，室温孵育5min，加入细胞中， 37℃，8％CO2摇床培养箱内培养，从转染后第5天开始，每天取样检测细胞密度和细胞活率，当细胞活率降至20％左右，收全部样品。使用protein A亲和柱纯化样品，上柱液和柱平衡液为1x PBS缓冲液，柱层析洗脱液为0.1M柠檬酸 (pH 2.7)，洗脱中和液为1M Tris-HCl(pH 8.0)，将收集到的纯化产物使用蛋白超滤离心管置换浓缩到1x PBS缓冲液，所得抗体进行分装冻存。将纯化后的抗体进行SDS-PAGE电泳鉴定，纯度在90％以上，抗体蛋白条带如图4所示。

[0051] 实施例5基于包埋细胞的ELISA方法比较不同抗体的亲和力

[0052] 使用含5％胎牛血清的Ham’s F12培养基培养人乳腺癌细胞SUM159，将细胞用胰酶消化后计数，1x104/孔铺于96孔板中，培养48小时后，待细胞覆盖率> 80％，弃去培养上清液，加入预冷的PBS缓冲液轻柔冲洗一次，弃去PBS，每孔加入50ul含0.05％戊二醛的PBS，静置10min固定细胞，使用预冷的PBS清洗两次后加入含20％胎牛血清的PBS进行封闭，4℃静置过夜。次日，使用预冷的PBS清洗96孔板，待用。

[0053] 选择已知的抗ER-α36鼠源单克隆抗体3C11(专利号WO 2014/146575A1) 和兔多克隆抗体pAb8586(文章出处Z.Wang,X.Zhang,P.Shen,B.W.Loggie,Y. Chang,T.F.Deuel,A variant of estrogen receptor-{alpha},hER-{alpha}36: transduction of estrogen-and antiestrogen-dependent membrane-initiated mitogenic signaling,Proc Natl Acad Sci U S A 103(24)(2006)9063-9068.外包公司制备： Alpha Diagnostic International(San Antonio,TX,USA))作为阳性对照，选择鼠源 IgG作为阴性对照；将4E11抗体和对照样品分别加入封闭液进行梯度稀释，作为一抗加入准备好的细胞板中，温育洗涤，加入辣根酶标记的二抗，温育洗涤，加入底物液，显色，450nm处读取OD值。

[0054] ELISA结果如图5所示，杂交瘤细胞株clone 4E11分泌的单克隆抗体能够特异性识别SUM159细胞表达的ER-α36蛋白，且结合能力强与已知的单克隆抗体和多克隆抗体。可开发成ER-α36特异性免疫诊断试剂，并为开发针对ER-α36 的抗体药物提供有力基础。

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