一种高产酸性果胶酶的棘孢曲霉菌株及其应用

摘要

本发明属于微生物改造技术领域，具体内容涉及一株高产酸性果胶酶的棘孢曲霉突变菌株及其应用。所述突变菌株的保藏编号为CCTCCNO:M2017783，可广泛应用于发酵生产酸性果胶酶。所述突变菌株固体摇瓶发酵3.5d后，其酸性果胶酶酶活达到938u/g，较出发菌提高47.7％，取得了意料不到的技术效果。

权利要求

1.一种棘孢曲霉，其特征在于，所述的棘孢曲霉为棘孢曲霉（Aspergiulls aculeatus），其保藏编号为CCTCC NO:M2017783。

2.权利要求1所述的棘孢曲霉在生产酸性果胶酶中的应用。

3.一种生产酸性果胶酶的方法，其特征在于，所述的方法是以权利要求1所述的棘孢曲霉作为发酵菌株进行发酵生产酸性果胶酶。

说明书

一种高产酸性果胶酶的棘孢曲霉菌株及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于微生物改造技术领域，具体内容涉及一株高产酸性果胶酶的棘孢曲霉突变菌株及其应用。技术背景

[0002] 果胶是一种由不同酯化度的半乳糖醛酸以α-1，4糖苷键聚合而成的多糖链，常带有鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、海藻糖等组成的侧链，游离的羧基部分或全部可与钙、钾、钠离子，特别是与硼化物结合在一起。果胶存在于所有的高等植物中，沉积于初生细胞壁和细胞层，在初生壁中与不同含量的纤维素、半纤维素、木质素的微纤丝以及某些伸展蛋白相互交联，使各种细胞组织结构坚硬，从而表现出固有的形态。

[0003] 果胶酶(pectinase)是指能够分解果胶物质的多种酶的总称，大致可分为果胶水解酶(pectin hydrolases)、果胶裂解酶(pentinlyases)、果胶酯酶(pectin esterases)和原果胶酶等。按照作用最适pH的不同，果胶酶又可分为酸性果胶酶和碱性果胶酶。

[0004] 目前研究和应用较多的是酸性果胶酶，酸性果胶酶指内聚半乳糖醛酸酶，可无规则的水解果胶酸分子中的α-1,4糖苷键，其作用最适pH在偏酸性范围，主要应用于食品行业的水果榨汁和果汁澄清，降低葡萄酒粘度，并可以与其它水解酶共同应用于饲料行业。其主要来源于动植物及微生物，尤其是微生物，因为它的生长速度快、生长条件简单、代谢过程特殊等特征，成为果胶酶的重要来源，其中真菌来源的果胶酶大部分在酸性pH值下具有高活性。大多数商业化生产的果胶酶也是来源于真菌，尤其是来源于黑曲霉和青霉。一些果胶酶基因已被克隆，测序并进行了表达。

[0005] 目前采用天然菌株生产的果胶酶存在一些局限性，主要包括产酶性能较低、果胶酶的耐温性能较差以及作用pH范围较小等。因此，随着果胶酶应用越来越广泛，迫切需要对果胶酶生产菌种进行相应的改良，以提高果胶酶的产量。

发明内容

[0006] 本发明为解决现有技术问题，提供了一株高产酸性果胶酶的棘孢曲霉(Aspergiulls aculeatus)菌株及其应用。申请人以购自德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)、保藏号为DSM 2334的棘孢曲霉为出发菌株，通过紫外诱变的方法，筛选获得一株突变菌株，能大幅度提高酸性果胶酶的产量，有利于促进该酶的广泛应用。

[0007] 本发明一方面提供了一种突变株棘孢曲霉T18(Aspergiulls aculeatus T18)，已于2017年12月11日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2017783。

[0008] 本发明一方面提供了所述棘孢曲霉在生产酸性果胶酶中的应用。

[0009] 本发明还提供了一种生产酸性果胶酶的方法，是以所述棘孢曲霉为发酵菌株。

[0010] 本发明还提供了一种酸性果胶酶，是由所述棘孢曲霉发酵获得的。

[0011] 本发明以棘孢曲霉(Aspergiulls aculeatus)DSM2344为出发菌株，通过紫外诱变方法筛选获得突变菌株棘孢曲霉T18。所述突变菌株固体摇瓶发酵3.5d后，其酸性果胶酶酶活达到938u/g，较出发菌提高47.7％，取得了意料不到的技术效果。本发明提供的棘孢曲霉突变菌株可广泛应用于酸性果胶酶的发酵生产，有利于降低该酶的生产成本，促进酸性果胶酶的推广与应用。

具体实施方式

[0012] 本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,3nd Ed.(Sambrook,2001)和CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Ausubel,2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。

[0013] 下面结合具体实施方式对本发明进行详细描述。

[0014] 实施例1棘孢曲霉DSM2344固体摇瓶发酵及酶活检测

[0015] 棘孢曲霉(Aspergiulls aculeatus)DSM2344购自德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)，保藏号为DSM No.2334。该菌株能发酵生产酸性果胶酶。

[0016] 申请人首先将棘孢曲霉DSM2344接种到新鲜的PDA平板(马铃薯200g/L，煮沸20-30min后过滤除渣；葡萄糖2％；琼脂粉1.5％)，30℃培养5d。

[0017] 吸取5ml无菌水洗脱，获得孢子液，接种50ml液体CSL-果糖种子培养基(麦芽糖10％；果糖5％；葡萄糖1％；玉米浆10％；硫酸镁0.05％；磷酸二氢钠0.1％；pH 5.8)，30℃培养2d。培养2d后，吸取2ml菌丝体接种5g固体摇瓶培养基，30℃培养3.5d，每天翻曲。培养结束后加40ml无菌水，搅拌2h洗脱，离心获得上清液即为粗酶液。将粗酶液进行酸性果胶酶酶活力测定，结果显示，所述粗酶液中酸性果胶酶酶活达到635u/g，从而说明棘孢曲霉DSM2344确实能够高产酸性果胶酶。

[0018] 1、酸性果胶酶酶活力检测

[0019] (1)酸性果胶酶酶活单位的定义

[0020] 在50℃，pH为3.5条件下，反应1h，1g酶粉或1ml酶液分解果胶产生1mg半乳糖醛酸定义为一个活力单位(IU)。

[0021] (2)酶活测定方法

[0022] (2.1)试剂和溶液：

[0023] 1％果胶粉水溶液：秤取果胶粉(Sigma P9135)1g，加水溶解，煮沸冷却，如有不溶物则需进行过滤，调pH 3.5，用水定容至100ml，在冰箱中储存备用，使用时间不超过3d；

[0024] 碳酸钠溶液1mol/L：秤取无水碳酸钠106g，加水溶解，定容至1L；

[0025] 碘标准溶液：0.1mol/L；

[0026] 硫酸溶液2mol/L：取浓硫酸5.6ml，缓慢加入适量水中，冷却后用水定容至100ml；

[0027] 可溶性淀粉指示液：10g/L；

[0028] 0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 3.5)：秤取柠檬酸(C6H8O7·H2O)14.7098g和柠檬酸三钠(C6H5Na3O7·2H2O)8.823g，用水溶解并定容至1L；

[0029] 0.05mol/L硫代硫酸钠溶液：将定量分析用的0.1mol/L硫代硫酸钠母液500ml用煮沸过的冷却水稀释，所得溶液的总体积为1000ml。配制好后，应进行标定，求出浓度校正系数f值；

[0030] (2.2)样品溶液的制备：

[0031] 准确吸取酶液1ml于一定体积的容量瓶中，用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液稀释并定容。酶液需要稀释至一定倍数，酶液浓度应控制在消耗0.05mol/L硫代硫酸钠标准溶液(A-B)之差在0.5～0.7ml范围内。

[0032] (2.3)酶活力测定：

[0033] 在空白管中，分别加入10g/L果胶溶液5ml和柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液5ml，在样品管中加入10g/L果胶溶液5ml和柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液4ml，在50℃水浴中预热5～10min。

[0034] 向样品管中加入1ml稀释好的酶液，立刻摇匀计时，在此温度下准确反应0.5h，立即取出，煮沸5min，终止反应，冷却。

[0035] 取上述空白管和样品管反应液各5ml，放入碘量瓶中，准确加入1mol/L碳酸钠溶液1ml、0.1mol/L碘液5ml，摇匀，于暗处放置20min。

[0036] 取出，加入2mol/L硫酸溶液2ml，用0.05mol/L硫代硫酸钠溶液滴定至浅黄色，加淀粉指示液3滴，继续滴定至蓝色刚好消失为终点，记录空白管、样品管反应液消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积。

[0037] 酶活计算公式：

[0038] X＝(A-B)×c×0.51×194.14×n×10/(5×1×0.5)＝(A-B)×c×n×396.05

[0039] 式中：X――样品的酶活力，U/ml；

[0040] A――空白溶液滴定消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积，ml；

[0041] B――样品溶液滴定消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积，ml；

[0042] c――硫代硫酸钠标准溶液的浓度，mol/L；

[0043] 0.51――1mol硫代硫酸钠相当于0.51mol的游离半乳糖醛酸；

[0044] 194.14――半乳糖醛酸的毫摩尔质量，mg；

[0045] n――酶液稀释倍数；

[0046] 10――反应液总体积，ml；

[0047] 5――滴定时取反应液的体积，ml；

[0048] 1――反应时加入稀释酶液的体积，ml；

[0049] 0.5――反应时间，h；

[0050] 酶活(U/g)Y＝8X，8为5g固体料加40ml水洗脱的折算倍数。

[0051] 实施例2诱变筛选

[0052] 申请人以棘孢曲霉(Aspergiulls aculeatus)DSM2344为出发菌株，进一步通过紫外诱变的方法筛选酸性果胶酶产量提高的突变菌株。

[0053] 确定致死率：将上述棘孢曲霉菌株DSM2344接种于PDA平板，30℃培养5d。待菌落表面产生大量孢子时，吸取5ml无菌水洗脱，获得孢子液，离心后用无菌水重悬，用血球计数板计数。取一个90mm培养皿，加入5ml稀释好的孢子悬液(浓度约为1×107个/mL)，加入转子并在磁力搅拌器上搅拌使孢子液处于均匀状态。在无菌超净工作台中，用功率为9w的紫外灯于垂直距离20cm的上方照射，分别照射30s、60s、90s、120s、150s、180s，取照射后的孢子液稀释10、100、1000倍，取100ul涂布PDA平板，30℃培养2-3d后计数，以未照射的孢子液为对照，计算致死率。其中照射150s时，致死率为98％，选取该照射时间进行后续诱变实验。

[0054] 诱变筛选：取一个90mm培养皿，加入5ml稀释好的孢子悬液(浓度为1×107)，加入转子并在磁力搅拌器上搅拌使孢子液处于均匀状态。在无菌超净工作台中，用功率为9w的紫外灯于垂直距离20cm的上方照射，照射150s后稀释1000倍，取100ul涂布PDA平板，30℃培养2-3d。

[0055] 共涂布100块PDA平板，30℃培养2-3d后，每个平板长出10-20个菌落，先通过观察菌落形态，筛选出菌落形态发生显著变化的突变菌共51个，分别接种到PDA平板，30℃培养5d；每个突变菌菌落用5ml无菌水进行洗脱，获得孢子液；分别接种至50ml液体CSL-果糖种子培养基，30℃培养2d；然后分别吸取2ml菌丝体接种至5g固体摇瓶培养基(麸皮2g；木质纤维素2g；阿拉伯树胶粉1g)，30℃培养3.5d，每天翻曲；培养结束后加40ml无菌水，搅拌2h洗脱，离心获得上清液即为粗酶液。

[0056] 通过对上述获得的粗酶液进行酸性果胶酶酶活力检测，申请人最终筛选出一株酸性果胶酶产量最高的突变菌株，命名为棘孢曲霉T18(Aspergiulls aculeatus T18)，该菌株发酵获得的粗酶液中酸性果胶酶的酶活达到938u/g，较出发菌提高47.7％，取得了意料不到的技术效果。

[0057] 申请人已于2017年12月11日将上述突变菌株棘孢曲霉T18(Aspergiulls aculeatus T18)保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2017783。