一种人类MTHFR和/或MTRR基因多态性检测试剂盒

摘要

本发明公开基于Taqman‑MGB探针检测MTHFR和/或MTRR基因多态性的试剂盒，其包括有引物组和探针，所述引物为选自以下三组中的至少一组：针对MTHFR基因的C677T位点的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4；针对MTHFR基因A1298C位点的如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.10；针对MTRR基因的A66G位点的SEQ ID NO.13，SEQ ID NO.14；所述探针为SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.19；针对如SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.15；针对SEQ ID NO.33，SEQ ID NO.30。本发明所述检测试剂具有同时检测三个突变位点，且灵敏度高，可以准确检出低至10copies质粒，对于保存时间过长或者浓度相对较低的口腔拭子都可以准确检出的优点。

权利要求

1.基于Taqman-MGB探针检测MTHFR和/或MTRR基因多态性的试剂盒，其特征在于，包括有以下引物组和探针：所述引物组为选自以下三组中的至少一组：针对MTHFR基因的C677T位点的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4；针对MTHFR基因A1298C位点的SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.10；针对MTRR基因的A66G位点的SEQ ID NO.13，SEQ ID NO.14；

所述探针为选自以下针对引物相应位点的突变型探针和野生型探针的至少一组：针对MTHFR基因的C677T位点的SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.19；针对MTHFR基因A1298C位点的SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.15；针对MTRR基因的A66G位点的SEQ ID NO.33，SEQ ID NO.30；所述探针的5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团；

所述试剂盒还包括有稳定剂，所述稳定剂各组分在扩增体系中的体积终浓度为：二甲基亚砜：0.5％-0.8％，去离子甲酰胺：0.1％-0.3％，甘油：0.5％-1％，BSA：0.3％-0.6％。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，包括有C677T位点、A1298C位点和A66G位点的引物和探针。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括有缓冲液、镁离子、dNTP、Taq酶。

4.根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述稳定剂各组分在扩增体系中的体积终浓度为：二甲基亚砜：0.7％，去离子甲酰胺：0.2％，甘油：0.75％，BSA：0.45％。

5.根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述探针5’端的荧光基团为FAM、VIC，3’端的淬灭基团为NFQ。

说明书

一种人类MTHFR和/或MTRR基因多态性检测试剂盒

技术领域

[0001] 本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种人类MTHFR和MTRR基因多态性检测试剂盒。

背景技术

[0002] 叶酸代谢密切相关的酶是5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)、甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR)。MTHFR和MTRR等基因变异(主要是MTHFR基因C677T、A1298C以及MTRR基因A66G的多态性)引起的相应的酶活性降低可阻抑同型半胱氨酸转化为甲硫氨酸，导致低叶酸血症和高同型半胱氨酸血症，从而增加新生儿出生缺陷风险或自发性流产等风险。

[0003] 叶酸缺乏是导致新生儿出生缺陷的主要原因。导致机体缺乏叶酸有两个方面的原因：一是叶酸摄入量不足，二是由于遗传(基因)缺陷导致机体对叶酸的利用能力低下(叶酸代谢通路障碍)。通过基因检测技术手段，检测人体MTHFR基因及MTRR基因型，可以及早发现个体对叶酸的吸收利用水平差异，从而筛查出容易引起叶酸缺乏的高危人群，实现个性化增补叶酸(因人而异地确切给出叶酸补充计划和补充量)，同时加强产前检查，以降低新生儿出生缺陷风险。

[0004] 目前MTHFR和MTRR基因多态性检测研究比较多，其检测方法主要有四类：测序法、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)、芯片法和荧光定量PCR法。

[0005] (1)测序法：先对样本进行PCR扩增,对目的产物进行纯化和测序，根据测序结果判读基因型。但该方法检测基因突变的灵敏度不高，并且还有操作复杂繁琐、试验周期长、容易污染、成本较高。

[0006] (2)PCR-RFLP技术：先进行PCR扩增，对得到产物进行酶切，根据电泳条带进行判读。该方法仅能检测还有酶切位点的突变、费时费力、试验周期长，并且还存在PCR产物污染导致假阳性的风险。

[0007] (3)芯片法：PCR产物需要后续处理，操作繁琐、价格昂贵，并且容易出现假阳性。

[0008] (4)qPCR：又包括HRM法、ARMS-PCR法和Taqman探针法。

[0009] ①HRM法：高分辨率溶解曲线分析技术，是在PCR体系中加入DNA双链结合染料，根据溶解曲线来对样本进行分型，因其荧光信号来自染料，特异性不高，并且仪器价格高，普及受到限制。

[0010] ②ARMS-PCR法：等位基因特异性引物PCR扩增法，根据SNP位点碱基特点设计一条突变引物、野生引物和公共引物，TaqDNA聚合酶缺少3’-5’外切酶活性，引物3’端错配会导致产物急剧减少，可以用凝胶电泳来检测扩增产物的有无。但此方法操作繁琐、特异性不高，容易出现假阳性结果。

[0011] ③Taqman探针法是在普通PCR基础上发展而来的，在PCR反应体系中引物一对特异性荧光探针，利用荧光信号实时检测PCR过程。Tqman探针5’端有报告荧光基团、3’端有淬灭荧光基团，当探针完整时没有荧光信号，如果探针能和模板配对，在引物延伸过程中，TaqDNA聚合酶5’-3’外切酶活性会将探针5’报告荧光基团切下，仪器便能检测到荧光信号，根据野生和突变探针的荧光信号强度就可以对SNP进行分型。

[0012] Taqman探针法目前也是应用比较多的生物技术，尽管如此，如上述各种检测方法，都有其优点以及缺点一样，而对于Taqman-MGB探针，由于SNP位点两侧可能只有7～8bp，一个碱基的不匹配足以让探针退火失败，而且MGB探针设计不好的话，分辨率会和普通的Taqman探针差不多，但是MGB探针又远贵于普通Taqman探针，因此，要真正实现基于Taqman-MGB探针的检测产品的应用性，特别是涉及到一种以上的基因的并列检测，更需要对其进行整个检测平台进行创造性的设计。

发明内容

[0013] 本发明的目的之一是提供一种基于Taqman-MGB探针的并列/单独检测人类MTHFR和/或MTRR基因多态性的特异性引物和试剂盒，不仅可以对C677T、A1298C和A66G三个SNP位点实现单独以及同时检测，具有体系稳定、、特异性强、灵敏度高等特点。

[0014] 实现上述目的的技术方案如下：

[0015] 基于Taqman-MGB探针检测MTHFR和/或MTRR基因多态性的试剂盒，包括有以下引物组和探针，

[0016] 所述引物为选自以下三组中的至少一组：针对MTHFR基因的C677T位点的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4；针对MTHFR基因A1298C位点的如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.10；针对MTRR基因的A66G位点的SEQ ID NO.13，SEQ ID NO.14；

[0017] 所述探针为选自以下针对引物相应位点的突变型探针和野生型探针的至少一组：针对MTHFR基因的C677T位点的SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.19；针对MTHFR基因A1298C位点的如SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.15；针对MTRR基因的A66G位点的SEQ ID NO.33，SEQ ID NO.30；所述探针的5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团。

[0018] 在其中一个实施例中，包括有三个位点的引物和探针。

[0019] 在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括有缓冲液、镁离子、dNTP、Taq酶。

[0020] 在其中一个实施例中，所述稳定剂各组分在扩增体系中的体积终浓度为：二甲基亚砜0.5％-5％；去离子甲酰胺：1％-5％，甘油：0.5％-2％，BSA：2％-5％。更优选地，为二甲基亚砜0.5％-0.8％；去离子甲酰胺：0.1％-0.3％，甘油：0.5％-1％，BSA：0.3％-0.6％。

[0021] 在其中一个实施例中，所述探针5’端的荧光基团为FAM、VIC种，3’端的淬灭基团为NFQ。

[0022] 本发明的另一个目的是提供一种MTHFR和/或MTRR基因的荧光定量PCR扩增方法。

[0023] 实现上述目的的技术方案如下。

[0024] 一种MTHFR和/或MTRR基因的荧光定量PCR扩增方法，包括，(1)设计得到引物和Taqman-MGB探针，所述引物为选自以下三组中的至少一组：针对MTHFR基因的C677T位点的SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4；针对MTHFR基因A1298C位点的如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.10；针对MTRR基因的A66G位点的SEQ ID NO.,13，SEQ ID NO.14；

[0025] 所述Taqman-MGB探针为选自以下针对引物相应位点的突变型探针和野生型探针的至少一组：针对MTHFR基因的C677T位点的SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.19；针对MTHFR基因A1298C位点的如SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.15；针对MTRR基因的A66G位点的SEQ ID NO.33，SEQ ID NO.30；所述探针的5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团。

[0026] (2)分别配置检测人MTHFR和/或MTRR基因C677T、A1298C和A66G位点多态性的PCR反应液，其中PCR反应液包含引物及其对应的Taqman-MGB探针、Taq酶、dNTP混合液、PCR缓冲液、稳定剂以及NFH2O(无核酸酶水Nuclease-Free Water)，

[0027] (3)反应程序为：预变性95℃4min；变性95℃15s；退火60℃35s；40个循环进行扩增。

[0028] 本发明的有益效果包括以下：

[0029] 一.本发明所述试剂盒操作简单，能显著降低污染，并且缩短反应时间，能在一个小时完成检测。

[0030] 二.本发明所述试剂盒选取适宜的区域并设计了高特异性的引物和探针探针。

[0031] 三.针对FAM和VIC通道本底信号干扰，实验结果难以判读，本发明所述试剂盒在反应体系中加入稳定剂，使实验得到“全或无”式结果。

[0032] 四.本发明所述试剂盒灵敏度高，可以准确检出低至10copies质粒，对于保存时间过长或者浓度相对较低的口腔拭子都可以准确检出。

附图说明

[0033] 附图1是MTHFR基因C677T突变A样品荧光定量PCR曲线图；

[0034] 附图2MTHFR基因A1298C突变B样品荧光定量PCR曲线图；

[0035] 附图3是MTRR基因A66G突变C样品荧光定量PCR曲线图；

[0036] 附图4是MTHFR基因C677T野生样品定量PCR曲线图；

[0037] 附图5纯野生样品MTHFR基因C677T位点测序图；

[0038] 附图6是MTHFR基因C677T突变A样品荧光定量PCR曲线图；

[0039] 附图7纯突变样品MTHFR基因C677T位点测序图；

[0040] 附图8是MTHFR基因C677T杂合样品荧光定量PCR曲线图；

[0041] 附图9杂合样品MTHFR基因C677T位点测序图；

[0042] 附图10MTHFR基因A1298C野生样品定量PCR曲线图；

[0043] 附图11野生样品MTHFR基因A1298C位点测序图；

[0044] 附图12MTHFR基因A1298C突变B样品荧光定量PCR曲线图；

[0045] 附图13突变样品MTHFR基因A1298C位点测序图；

[0046] 附图14MTHFR基因A1298C杂合样品荧光定量PCR曲线图；

[0047] 附图15杂合样品MTHFR基因A1298C位点测序图；

[0048] 附图16是MTRR基因A66G野生样品定量PCR曲线图；

[0049] 附图17纯野生样品MTRR基因A66G位点测序图；

[0050] 附图18是MTRR基因A66G突变C样品荧光定量PCR曲线图；

[0051] 附图19纯突变样品MTRR基因A66G位点测序图；

[0052] 附图20是MTRR基因A66G杂合样品荧光定量PCR曲线图；

[0053] 附图21杂合样品MTRR基因A66G位点测序图；

[0054] 附图22灵敏度荧光定量PCR曲线图；

[0055] 附图23引物筛选荧光定量PCR曲线图；

[0056] 附图24探针筛选荧光定量PCR曲线图。

具体实施方式

[0057] 为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例结合附图详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。本发明所用的以下试剂可通过常规途径购买得到。

[0058] 除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

[0059] 以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

[0060] 实施例1

[0061] 基于Taqman-MGB探针的人类MTHFR和MTRR基因多态性检测试剂盒，试剂盒中包括表3中三对引物及其对应的探针序列：

[0062] 表3 MTHFR和MTRR基因引物与探针序列

[0063]

[0064] 所述MTHFR和/或MTRR基因遗传多态性检测试剂盒MTHFR和/或MTRR基因遗传多态性检测试剂盒还包括PCR反应缓冲液、dNTP、Taq酶、稳定剂和NFH2O。

[0065] 所述探针5’端的荧光基团为FAM或VIC，3’端的淬灭基团为NFQ。

[0066] 试剂盒中PCR反应液配置

[0067] 分别配置检测人MTHFR和MTRR基因C677T、A1298C和A66G位点多态性的PCR反应液，其中PCR反应液包含引物及其对应的Taqman-MGB探针、Taq酶、dNTP混合液、PCR缓冲液、稳定剂以及NFH2O。

[0068] 组装试剂盒：试剂盒中包含分别检测MHFR C677T、MHTFR A1298C和MTRR A66G基因多态性检测PCR反应液、阳性参考品以及阴性参考品，根据PCR反应体系各组分使用量，计算12人份、24人份和48人份三种使用规格个组分使用量，配制成试剂盒各管中组分并组装。

[0069] 稳定剂在扩增体系中的体积终浓度如下:

[0070]试剂 终浓度 本实施例所用终浓度
二甲基亚砜 0.5％-0.8％ 0.7％
去离子甲酰胺 0.1％-0.3％ 0.2％
甘油 0.5％-1％ 0.75％
BSA 0.3％-0.6％ 0.45％

[0071] 每个PCR扩增的反应体系为25μl，向反应管中加入待检测样品后得到的混合物中各组分终浓度及其含量如下：

[0072]

[0073] 所述荧光定量PCR反应程序为：预变性95℃4min；变性95℃15s；退火60℃35s；40个循环进行扩增。

[0074] 在上述程序结束后，所得结果按照下表进行结果判读：

[0075]

[0076] 实施例2：稳定剂的使用

[0077] (一)试剂盒不添加稳定剂实验结果

[0078] 1.血液样本基因组DNA提取

[0079] 人血液DNA提取，采用天根生化生物技术公司全血DNA抽提试剂盒，从血液中提取人类基因组DNA。

[0080] 2.PCR反应体系配制

[0081] 使用不加稳定剂配制PCR反应体系，一个样品，同时进行3管PCR检测。将步骤一中得到的DNA样品依次取5μl分别加入不放稳定剂的PCR反应混合液中，总体系为25μl。

[0082] 3.PCR荧光检测

[0083] 将配制好的PCR体系放入荧光PCR仪器中，进行荧光PCR扩增检测，反应条件为：95℃4min；95℃15s；60℃35s；40个循环，每个循环结束后收集FAM和VIC荧光信号。

[0084] 4.样本分析结果如下

[0085] MTHFR C677T纯合突变样本5例，其中A样品检测结果如图1；

[0086] MTHFR A1298C纯合突变样本5例，其中B样品检测结果如图2；

[0087] MTRR A66G纯合突变样本5例，其中C样品检测结果如图3。

[0088] 从3张结果图中可以看出：在不使用稳定剂的条件下，3个位点野生探针都有不同程度的凸起，已经干扰了结果判读；在使用稳定剂条件下，相同样本，3个位点结果如图6、12和18所示，野生探针没有凸起。可以看出，在使用稳定剂后，结果利于判读。

[0089] (二)检测试剂盒的使用

[0090] 用实施例2中配制的PCR反应液检测对20例抗凝全血样品进行检测。

[0091] 1.血液样本基因组DNA提取

[0092] 人血液DNA提取，采用天根生化生物技术公司全血DNA抽提试剂盒，从血液中提取人类基因组DNA。

[0093] 2.PCR反应体系配制

[0094] 使用实施例2中配置PCR反应液进行检测，一个样品，同时进行3管PCR检测。将步骤一中得到的DNA样品依次取5μl分别加入到实施例1中的试剂盒的MTHFR 677、MTHFR1298和MTRR 66检测反应体系汇总，使三种反应体系总体积均为25μl。

[0095] 3.荧光PCR检测

[0096] 将配制好的PCR体系放入荧光PCR仪器中，进行荧光PCR扩增检测，反应条件为：95℃4min；95℃15s；60℃35s；40个循环，每个循环结束后收集FAM和VIC荧光信号。

[0097] 4.样本检测结果分析

[0098] 20例样品的检测结果如下：

[0099] MTHFR C677T纯合野生样本10例，其中一个检测结果如图4，对应的测序结果如图5；

[0100] MTHFR C677T纯合突变样本5例，其中A样品检测结果如图6，对应的测序结果如图7；

[0101] MTHFR C677T杂合样本5例，其中一个检测结果如图8，对应的测序结果如图9；

[0102] MTHFR A1298C纯合野生样本8例，其中一个检测结果如图10，对应的测序结果如图11；

[0103] MTHFR A1298C纯合突变样本5例，其中B样品检测结果如图12，对应的测序结果如图13；

[0104] MTHFR A1298C杂合样本7例，其中一个检测结果如图14，对应的测序结果如图15；

[0105] MTRR A66G纯合野生样本8例，其中一个检测结果如图16,对应的测序结果如图17；

[0106] MTRR A66G纯合突变样本5例，其中C样品检测结果如图18,对应的测序结果如图19；

[0107] MTRR A66G杂合样本7例，其中一个检测结果如图20,对应的测序结果如图21。

[0108] 上述20例样本荧光定量PCR检测结果与测序结果一致，因为篇幅的原因，其它的实验结果图省略。以上结果表明本发明实例提供的检测试剂盒用于人类MTHFR和MTRR基因多态性检测结果可靠，与直接测序一致率达到100％，且本发明检测方法灵敏度高于传统测序方法。

[0109] 实施例3：试剂盒灵敏度实验分析

[0110] 分别以10-2～10-7ng/μl的MTHFR C677T突变质粒标准品为例进行实时荧光定量PCR扩增，结果如图22，从结果中可以看出荧光定量PCR在模板浓度为10-7ng/μl以下时未见有扩增，可得出荧光定量PCR的灵敏度为10copies的靶DNA。

[0111] 实施例4：MTHFR和MTRR基因多态性检查特异性引物和探针序列的选择[0112] 以MTHFR C677T位点为例，分别设计特异性的引物序列，以该突变位点所在的目标序列的正向或反向互补序列为模板，分别针对MTHFR C677T位点的野生型和突变型设计特异性探针序列，包括本发明实施例4中优选的特异性引物和探针序列以及2条(或大于2条)备选的特异性引物和探针序列，如表4、5所示。

[0113] 表4引物序列

[0114]

[0115] 表5特异性探针序列

[0116]

[0117]

[0118] 本发明在研发阶段先筛选到一系列引物及探针，然后经PCR条件及体系优化最终筛选到一组特异性最强，扩增效率最优的引物和探针。以MTHFR C677T为例，根据曲线是否有显著“S”型曲线、Ct值范围以及荧光值大小，筛选出引物(图23)和探针(图24)。

[0119] 以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

[0120] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。