小麦赤霉病抗性主效QTL的KASP分子标记及其应用

摘要

本发明公开了一种小麦赤霉病抗性主效QTL的KASP分子标记及其应用，所述主效QTL定位在小麦的第二染色体的长臂上，命名为Qfhb‑2DL；所述Qfhb‑2DL包括两个连锁的KASP分子标记为GBS12056和GBS10238，所述Qfhb‑2DL定位区间为GBS12056‑GBS10238之间的2.0cM区间内，可解释30.3％的表型变异，加性效应为‑14.1。本发明的小麦赤霉病抗性主效QTL的KASP分子标记及其应用，通过发掘小麦赤霉病主效抗性QTL紧密连锁标记开发得到，本发明的KASP分子标记定位的QTL遗传效应大且稳定，KASP分子标记与目标QTL连锁紧密，能够满足分子育种的需要。

权利要求

1.小麦赤霉病抗性主效QTL的分子标记引物组，所述引物组由GBS12056的KASP分子标记引物和GBS10238的KASP分子标记引物组成，所述GBS12056的KASP分子标记引物序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；

所述GBS10238的KASP分子标记引物序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

2.小麦赤霉病抗性主效QTL的基因分型方法，其特征在于，提取小麦基因组DNA，用序列SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的GBS12056的KASP标记引物和序列SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的GBS10238的KASP标记引物对提取的基因组DNA进行PCR扩增。

3.如权利要求2所述的小麦赤霉病抗性主效QTL的基因分型方法，其特征在于，所述PCR扩增方法为：PCR反应体系：DNA 3μl，KASP引物混合物0.0825μl，2×KASP Master Mix 3.0μl；

PCR反应程序：95℃预变性15min；94℃变性20s，62-57℃梯度PCR，每循环降低0.5℃，共

10个循环；复性20s，95℃变性10s，57℃复性及扩增60s，共26个循环；10℃保存；

KASP引物混合物包括：FAM正向引物、VIC正向引物、反向引物和纯化水；所述FMA正向引物浓度为12μmol/ml，所述VIC正向引物浓度为12μmol/ml，所述反向引物浓度为30μmol/ml。

4.如权利要求1所述的小麦赤霉病抗性主效QTL的分子标记引物组在小麦育种中的应用。

5.如权利要求1所述的小麦赤霉病抗性主效QTL的分子标记引物组在小麦赤霉病抗性鉴定中的应用。

6.一种小麦赤霉病抗性检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的小麦赤霉病抗性主效QTL的分子标记引物组。

说明书

小麦赤霉病抗性主效QTL的KASP分子标记及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及一种小麦赤霉病抗性主效QTL的KASP分子标记及其应用。

背景技术

[0002] 小麦是我国重要的粮食作物，其生产与国家粮食安全密切相关。小麦赤霉病是由禾谷镰刀菌（Fusarium grminearum）引起的重要病害，在全球普遍发生。与其他小麦病害不同，赤霉病的发生和流行不但严重影响小麦产量和品质，而且其病原菌感染的麦粒可产生多种霉菌毒素，如脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON，Deoxynivalenol）和玉米赤霉烯酮（zearalenon）等，可引起人、畜中毒，使得感病麦粒不能被食用，严重影响小麦的生产。因此，欧盟（Europen Union）和美国的FDA（Food and Drug Administration）在食物及进出口的小麦中均设置了严格的DON最高含量标准。

[0003] 在我国小麦生产史中，赤霉病主要发生在小麦抽穗期湿润多雨的长江中下游麦区和华南麦区。然而，自上世纪七八十年代以后，赤霉病的发生逐渐向黄淮等北方麦区蔓延，其中，1985年小麦赤霉病在河南省大流行，导致小麦大面积减产。目前，赤霉病在我国小麦主栽区的河南、山东、河北、陕西等省份时有发生，且近年其发病程度及流行频次则明显增加。据不完全统计，全国小麦赤霉病的平均年受害面积约1亿亩，每年因赤霉病危害损失产量达200～300万吨。综上，目前小麦赤霉病已成为限制我国小麦生产的重要因素，加速小麦赤霉病抗性育种的进程对保障我国粮食安全具有重要意义。

[0004] 由于赤霉病主要在小麦开花时通过穗部侵入发病，与其他叶部病害相比其侵入及发病周期短、速度快。目前，除尚无特效的杀菌剂外，化控的用药时期及流行年份发病期的多雨等不利自然条件也使得对该病的化控研究及应用远落后于其他病害。因此，发掘并利用抗病基因，通过培育抗赤霉病的小麦品种是防止小麦赤霉病最为经济、有效的途径。小麦赤霉病抗性是由多基因控制的数量性状（quantitative traits loci，QTL），目前鉴定的小麦赤霉病抗性QTL已有100多个，遍布于小麦的所有染色体。然而，所定位的大多QTL由于其遗传效应小（PVE<10%）且不稳定，标记与QTL遗传距离大且无简易高通量标记可用等原因，使得所定位的大多QTL尚不能满足分子育种的需要。因此，发掘小麦赤霉病抗性的主效QTL并开发与其紧密连锁的分子标记对赤霉病抗性品种分子标记辅助选择育种至关重要。

发明内容

[0005] 为了解决现有技术的问题，本发明在发掘与小麦赤霉病主效抗性QTL紧密连锁标记的基础上，开发并提供了一种小麦赤霉病抗性主效QTL的KASP分子标记及其应用。所述技术方案如下：

[0006] 一方面，小麦赤霉病抗性主效QTL的KASP分子标记，所述主效QTL定位在小麦的第二染色体的长臂上，命名为Qfhb-2DL；所述Qfhb-2DL包括两个连锁的KASP分子标记为GBS12056和GBS10238，所述Qfhb-2DL定位区间为GBS12056-GBS10238之间的2.0cM区间内，平均可解释30.3%的表型变异，加性效应为-14.1。

[0007] 进一步的，所述GBS12056的KASP分子标记引物序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

[0008] 进一步的，所述GBS10238的KASP分子标记引物序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

[0009] 另一方面，小麦赤霉病抗性主效QTL的基因分型方法，提取小麦基因组DNA，用序列SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的GBS12056的KASP标记引物和序列SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的GBS10238的KASP标记引物对提取的基因组DNA进行PCR扩增。

[0010] 进一步的，所述PCR扩增方法为：

[0011] PCR反应体系：DNA 3μl，KASP引物混合物0.0825μl，2×KASP Master Mix 3.0μl；

[0012] PCR反应程序：95℃预变性15min；94℃变性20s，62-57℃梯度PCR，每循环降低0.5℃，共10个循环；复性20s，95℃变性10s，57℃复性及扩增60s，共26个循环；10℃保存；

[0013] KASP引物混合物包括：FAM正向引物、VIC正向引物、反向引物和纯化水；所述FMA正向引物浓度为12μmol/ml，所述VIC正向引物浓度为12μmol/ml，所述反向引物浓度为30μmol/ml。

[0014] 再一方面，上述的小麦赤霉病抗性主效QTL的分子标记引物组在小麦育种中的应用。

[0015] 再一方面，上述的小麦赤霉病抗性主效QTL的分子标记引物组在小麦赤霉病抗性鉴定中的应用。

[0016] 再一方面，一种小麦赤霉病抗性检测试剂盒，包括上述的小麦赤霉病抗性主效QTL的分子标记引物组。

[0017] 本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明的小麦赤霉病抗性主效QTL的KASP分子标记及其应用，通过发掘小麦赤霉病主效抗性QTL紧密连锁标记开发得到，本发明的KASP分子标记定位的QTL遗传效应明显稳定，KASP分子标记与QTL遗传距离适宜，能够满足分子育种的需要。

附图说明

[0018] 为了更清楚地说明本发明施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0019] 图1是本发明实施例中冀5265赤霉病抗性主效QTL（Qfhb-2DL）的定位图；

[0020] 图2是本发明实施例中KASP12056对RIL群体的基因型鉴定结果图。

具体实施方式

[0021] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。实施例

[0022] （1）赤霉病抗性亲本：冀5265是由河北省农林科学院培育的冬小麦品种，对赤霉病抗性反应可达高抗水平。

[0023] （2）QTL定位群体：利用冀5265与赤霉病高感小麦品种wheaton杂交产生F1，自交产生F2后通过单粒传的方法构建重组自交系（Recombinant Inbreed Lines，RIL）F6遗传群体。

[0024] （3）赤霉病抗性鉴定：在温室条件下，利用单花滴注的方法对亲本及其衍生RIL群体进行赤霉病抗性鉴定。所用赤霉病接种病原菌由江苏省农科院提供的赤霉病混合小种。在小麦开花后，选取中部开花的小穗，每小穗接种10μl菌液（约1000个孢子），并套袋保湿
48h。接种后14-18天调查发病情况，以每穗发病小穗占总小穗百分比来作为抗病评价指标。
包括亲本在内，每系设两次重复，各接种3-5穗。

[0025] （4）DNA提取及QTL定位：用CTAB法提取亲本及其RIL群体的DNA。利用GBS（Genotyping by Sequencing）及SSR的标记对“冀5265/wheaton”RIL群体进行基因型鉴定（Genotyping），利用QTL定位软件IciMapping3.3中的Kosambi mapping function进行遗传连锁图的构建，最小Lod值设定为8.0。用完备复合区间作图法（inclusive composite interval mapping of additive，ICIM-ADD)进行QTL定位研究。

[0026] 通过“冀5265/Wheaton”RIL群体，将冀5265中控制赤霉病抗性的主效QTL定位在小麦的第二染色体的长臂上（2DL），命名为Qfhb-2DL（图1）。该QTL在不同环境中均稳定存在，不同年份间该QTL可解析赤霉病抗性表型变异的18.9-28.5%，平均可达30.3%（表1）。根据赤霉病抗性的平均表型数据，Qfhb-2DL被定位于标记GBS12056-GBS10238的2.0cM区间内。标记GBS12056与GBS10238均与其紧密连锁。

[0027] 表1 Qfhb-2DL遗传效应及其侧翼标记

[0028] 环境 侧翼标记 QTL峰值位置 Lod值 表型贡献率（%） 加性效应2017年春季 GBS12038-Wmc797 37.0 11.6 18.9 -12.1
2016年秋季 GBS12056-GBS10238 36.0 16.2 28.5 -16.7
2016年春季 GBS12056-GBS10238 36.0 12.5 22.9 -14.7
平均 GBS12056-GBS10238 36.0 19.4 30.3 -14.1

[0029] （5）KASP标记的开发：将所定位的与2DL上控制赤霉病抗性的主效QTL紧密连锁的分子标记GBS12056，GBS10238分别开发成简易、高通量的KASP（Kompetitive allele specific PCR，http://www.lgcgroup.com/kasp）标记。具体过程及引物序列信息如下：

[0030] ①GBS12056的KASP标记：正向引物（Forward primer，5’-3’）SEQ ID NO.1（TCGCTGCAGCTTAACATATGT）和SEQ ID NO.2

[0031] （TCGCTGCAGCTTAACATATGC）分别在5’末端连上FAM和VIC接头（adaptor）序列，作为其KASP正向引物来分别检测主效Qfhb-2DL紧密连锁标记，GBS12056的单核苷酸标记（SNP）的多态性。共用反向引物（Reverse  primer，5’-3’）序列为SEQ  ID  NO.3（TGGAAGGCAGATCTGCCACG）。

[0032] ②GBS10238的KASP标记：正向引物（Forwardprimer，5’-3’）SEQ ID NO.4（GGTAGGACCTGCAGGAGCGA）和SEQ ID NO.5

[0033] （GGTAGGACCTGCAGGAGCGG）分别在5’末端连上FAM和VIC接头（adaptor）序列，作为其KASP正向引物来分别检测与主效Qfhb-2DL紧密连锁标记，GBS10238的单核苷酸（SNP）位点的多态性。共用反向引物（Reverseprimer，5’-3’）序列为SEQ  ID  NO.6（TCTCTCTGTTGGGCAACGGA）。

[0034] （6）KASP标记GBS12056，GBS10238的实施：

[0035] ①引物的准备：新合成的primer稀释成100μmol/ml的浓度后，按表2比例配置引物工作液：

[0036] 表2 KASP引物工作液成分、体积及浓度

[0037]成分 体积（μl） 终浓度（μmol/ml）
Forward primer-FAM 120 12
Forward primer-VIC 120 12
Commonreverse primer 300 30
Pure water 460  
Total 1000  

[0038] ②KASP标记PCR反体系（6μl）及基因型鉴定：

[0039] PCR反应体系：DNA 3μl（约100ng），KASP引物混合物0.0825μl，2×KASP Master Mix 3.0μl（英国LGC公司）。

[0040] PCR反应程序：95℃预变性15min；94℃变性20s，62-57℃梯度PCR，每循环降低0.5℃，共10个循环；复性20s，95℃变性10s，57℃复性及扩增60s，共26个循环；10℃保存。

[0041] KASP标记基因型鉴定：用ABI 7900 HT real-time PCR仪器进行KASP标记的基因型鉴定工作，具体操作程序参考LGC公司的ABI 7900 KASP基因分型操作指南（Guide to running KASP genotyping on the ABI 7900 instrument）。对“冀5265/Wheaton”亲本及其F6 RIL群体进行基因分型（genotyping）后，发现KASP-GBS12056与KASP-GBS10238均可清晰的将两亲本分成两个类群，并且对RIL群体的基因型鉴定结果与GBS完全相同（图2）。

[0042] 本发明的小麦赤霉病抗性主效QTL的KASP分子标记及其应用，通过发掘小麦赤霉病主效抗性QTL紧密连锁标记开发得到，本发明的KASP分子标记定位的QTL遗传效应大且稳定，KASP分子标记与QTL遗传距离适宜，能够满足分子育种的需要。

[0043] 上述本发明实施例序号仅仅为了描述，不代表实施例的优劣。

[0044] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。