采用高效合相色谱同时测定血浆中12种磺胺类药物的方法

摘要

本发明公开了一种同时分离测定血浆中12种磺胺类药物的高效合相色谱(Ultra Performance Convergence Chromatography，UPC2)方法。该方法是在血浆样品中加入乙腈，涡旋混合后离心，上清液过滤后采用UPC2方法测定，采用Acquity UPC2TM BEH色谱柱，CO2和甲醇作为流动相，梯度洗脱，柱温箱温度40℃，系统背压2100psi。该法在6min内实现了对12种磺胺类药物的基线分离，最低定量限为0.5μg/mL，回收率在80.53‑103.33％之间。该方法操作简便、准确、节省时间，并且更为环保，适用于血浆中多种磺胺类药物的同时检测。

权利要求

1.一种同时测定血浆中12种磺胺类药物的方法，是采用高效合相色谱进行测定，包括下述步骤：

1)对待测的血浆样品进行前处理：

取适量的待测血浆样品，加入等体积的乙腈，混匀，离心，取上清液，过0.22μm滤膜，收集滤液待检测；

2)采用高效合相色谱法进行测定：

所述高效合相色谱法采用的色谱条件为：

2

采用Acquity UPC BEH色谱柱；

柱温：35℃-45℃，系统背压：1800psi-2700psi；

流动相：超临界CO2和甲醇的混合液；

洗脱方式：梯度洗脱；

梯度洗脱程序为：

0-5min：超临界CO2的体积分数由95％降至85％，

5.0-5.5min：超临界CO2的体积分数由85％降至80％，

5.5-6.0min：超临界CO2的体积分数由80％增至95％，

6.0-7.0min：超临界CO2的体积分数维持95％不变；

柱流速为1.55-1.65mL/min；

所述高效合相色谱采用的检测器为PDA检测器；

其中，所述12种磺胺类药物选自下述物质：磺胺甲基异恶唑、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺醋酰、磺胺甲基嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶，N4-乙酰磺胺甲基恶唑、N4-乙酰磺胺甲基嘧啶、N4-乙酰磺胺嘧啶、N4-乙酰磺胺噻唑、N4-乙酰磺胺吡啶。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述混匀采用涡旋的方式，涡旋的时间均为0.5-1min；所述离心的条件为18～24℃下6000～10000rpm离心6～12min。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，所述Acquity UPC2 BEH色谱柱的规格为100mm×3mm，填料粒径1.7μm；所述柱温为：40℃；所述系统背压：2100psi；

所述色谱条件中样品温度为25℃，进样体积为2μL。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，所述PDA检测器的检测条件为：

3D扫描范围210-600nm，2D补偿吸光度265nm，补偿参比560-600nm。

5.一种同时测定血浆中12种磺胺类药物的含量的方法，是采用高效合相色谱进行测定，包括下述步骤：

1)标准曲线的制备

取一系列浓度的权利要求1中所述12种磺胺类药物的混合标准品溶液加入空白血浆样品中，按照权利要求1中步骤1)所述的方法对血浆样品进行处理，然后对得到的上清液按照权利要求1所述的高效合相色谱法进行检测，并分别记录所述12种磺胺类药物在每个浓度下对应的峰面积，以每个磺胺类药物对应的峰面积为纵坐标，以对应的磺胺类药物的质量浓度为横坐标，进行线性权重回归，分别制备12种磺胺类药物的回归方程；

2)待测的血浆样品中所述12种磺胺类药物的含量测定将待测血浆样品按照权利要求1中步骤1)所述的方法进行处理，然后对得到的上清液按照权利要求1所述的高效合相色谱法进行检测，并分别记录所述12种磺胺类药物对应的峰面积；将每种药物的峰面积值代入步骤1)制备的该药物对应的回归方程中，分别计算得到所述待测血浆样品中12种磺胺类药物的浓度。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述混匀采用涡旋的方式，涡旋的时间均为0.5-1min；所述离心的条件为18～24℃下6000～10000rpm离心6～12min。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，所述Acquity UPC2 BEH色谱柱的规格为100mm×3mm，填料粒径1.7μm；所述柱温为：40℃；所述系统背压：2100psi；

所述色谱条件中样品温度为25℃，进样体积为2μL。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，所述PDA检测器的检测条件为：

3D扫描范围210-600nm，2D补偿吸光度265nm，补偿参比560-600nm。

9.权利要求1-8中任一项所述的方法在研究磺胺类药物药代动力学中的应用；所述磺胺类药物选自下述至少一种：磺胺甲基异恶唑、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺醋酰、磺胺甲基嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶，N4-乙酰磺胺甲基恶唑、N4-乙酰磺胺甲基嘧啶、N4-乙酰磺胺嘧啶、N4-乙酰磺胺噻唑、N4-乙酰磺胺吡啶。

说明书

采用高效合相色谱同时测定血浆中12种磺胺类药物的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种采用高效合相色谱同时测定血浆中12种磺胺类药物的方法。

背景技术

[0002] 磺胺类药物(Sulfonamides，SAs)是含有对氨基苯磺酰胺结构的一类药物的总称。主要通过与对氨基苯甲酸(P-amino benzoic acid，PABA)竞争性结合二氢叶酸合成酶，影响细菌核蛋白合成而发挥抑菌作用，该药具有抗菌谱广、价格低廉、性质稳定等诸多优点。
截止目前，临床应用仍较为广泛。

[0003] 早期研究表明，服用相同剂量SAs药物，不同患者体内血药浓度有较大差异。常规经验治疗过程中血药浓度较多维持在50-100μg/mL。在该血药浓度范围中，药物抗菌作用较为明显，而面对严重感染，适当增高药物血药浓度较为适宜，临床通常将患者血药浓度维持在120-150μg/mL，以发挥更高的抗菌效果同时降低不良反应的发生率。为了充分研究SAs的药效学和药动学，建立一种快速、简便、高通量的测定血浆中SAs的方法是有必要的。

[0004] 目前，诸多学者分别建立了一系列针对生物样品中SAs的分析方法[Yu H,Tao Y,Chen D,et al.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2011,879(25):2653-2662.Zhao XT,Lin QB,Song H,et al.J Agric Food Chem,2011,59(18):9800-
9805.Zhang S,Hu Q,Sun J,et al.Chin.Traditional Patent Med.,2015,37(3):542-
548.]。国内外对于生物样品中SAs分析方法较多，其中HPLC(UHPLC)检测技术最为常用[Gao R,Zhang J,He X,et al.Anal Bioanal Chem.2010,398(1):451-461.Shaaban H,Górecki T.J Sep Sci,2012,35(2):216-224.]，SAs往往具有相似的结构，无论采取C18柱还是氨基柱，分离效能均有待提高。超高效合相色谱(UPC2)是Waters公司于2012年8月份新推出的一种分离技术，该技术采用超临界流体基本原理，不仅分离效能高，而且具有绿色、环保、经济等优势。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种同时测定血浆中12种磺胺类药物的方法。

[0006] 本发明所提供的同时测定血浆中12种磺胺类药物的方法，是采用高效合相色谱进行测定，包括下述步骤：

[0007] 1)对待测的血浆样品进行前处理：

[0008] 取适量的待测血浆样品，加入等体积的乙腈，混匀，离心，取上清液，过0.22μm滤膜，收集滤液待检测；

[0009] 2)采用高效合相色谱法进行测定：

[0010] 所述高效合相色谱法采用的色谱条件为：

[0011] 采用Acquity UPC2BEH色谱柱；

[0012] 柱温：35℃-45℃，系统背压：1800psi-2700psi；

[0013] 流动相：超临界CO2和甲醇的混合液；

[0014] 洗脱方式：梯度洗脱；

[0015] 梯度洗脱程序为：

[0016] 0-5min：超临界CO2的体积分数由95％降至85％，

[0017] 5.0-5.5min：超临界CO2的体积分数由85％降至80％，

[0018] 5.5-6.0min：超临界CO2的体积分数由80％增至95％，

[0019] 6.0-7.0min：超临界CO2的体积分数维持95％不变；

[0020] 柱流速为1.55-1.65mL/min(优选1.6mL/min)；

[0021] 所述高效合相色谱采用的检测器为PDA检测器(二极管阵列检测器)；

[0022] 其中，所述12种磺胺类药物选自下述物质：磺胺甲基异恶唑(Sulfamethazine，SMZ)、磺胺间二甲氧嘧啶(Sulfadimethoxypyrimidine，SMM)、磺胺醋酰(Sulfacetamide，STD)、磺胺甲基嘧啶(Sulfamerazine，SMR)、磺胺嘧啶(Sulfadiazine，SDZ)、磺胺噻唑(Sulfathiazole，ST)、磺胺吡啶(Sulfapyridine，SPD)，N4-乙酰磺胺甲基恶唑(N4-Ac SMZ)、N4-乙酰磺胺甲基嘧啶(N4-Ac SMR)、N4-乙酰磺胺嘧啶(N4-Ac SDZ)、N4-乙酰磺胺噻唑(N4-Ac ST)、N4-乙酰磺胺吡啶(N4-Ac SPD)。

[0023] 步骤1)中，所述混匀采用涡旋的方式，涡旋的时间均为0.5-1min；所述离心的条件为18～24℃下6000～10000rpm离心6～12min。

[0024] 步骤2)中，所述Acquity UPC2BEH色谱柱的规格为100mm×3mm，填料粒径1.7μm；所述柱温为：40℃；所述系统背压：2100psi；

[0025] 所述色谱条件中样品温度为25℃，进样体积为2μL。

[0026] 步骤2)中所述PDA检测器的检测条件为：

[0027] 3D扫描范围210-600nm，2D补偿吸光度265nm，补偿参比560-600nm。

[0028] 本发明的再一个目的是提供一种同时测定血浆中12种磺胺类药物的含量的方法，是采用高效合相色谱进行测定，包括下述步骤：

[0029] 1)标准曲线的制备

[0030] 取一系列浓度的所述12种磺胺类药物的混合标准品溶液加入空白血浆样品中，按照上述对血浆样品进行前处理的方法进行制备，然后对得到的上清液按照上述的高效合相色谱法进行检测，并分别记录所述12种磺胺类药物在每个浓度下对应的峰面积，[0031] 以每个磺胺类药物对应的峰面积为纵坐标，以对应的磺胺类药物的质量浓度为横坐标，进行线性权重回归，分别制备12种磺胺类药物的回归方程；

[0032] 2)待测的血浆样品中所述12种磺胺类药物的含量测定

[0033] 将待测血浆样品按照上述的样品制备方法进行制备，然后对得到的上清液按照上述的高效合相色谱法进行检测，并分别记录所述12种磺胺类药物对应的峰面积；将每种药物的峰面积值分别代入该药物对应的回归方程中，计算得到所述待测血浆样品中12种磺胺类药物的浓度。

[0034] 本发明所述方法可成功的用于磺胺类药物的药代动力学研究。

[0035] 截止目前，SAs的测定常规仍采用液相色谱(或串联质谱)，但该类方法分离时间较长、分离效能有待提高，且有机试剂消耗量大，对环境的友好度有待提高。鉴于此，本发明建立了一种快速、高效、环保的新型分离方法，用于生物样品中SAs的分析测定。所建立的方法主要具有以下几点优势：(1)分离时间短，6分钟之内即可实现12种SAs的分离；(2)分离效能高，全部物质均能达到基线分离；(3)清洁环保，有效降低了有机试剂的使用量。

附图说明

[0036] 图1为12种磺胺色谱图，(A)：空白血浆；(B)：空白血浆+12种磺胺类药物。

具体实施方式

[0037] 下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

[0038] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0039] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0040] 实施例1、

[0041] 1材料与方法

[0042] 1.1仪器与试剂

[0043] Acquity UPC2(美国Waters公司)，配有Waters PDA检测器；色谱柱(均购自2
Waters,Milford,MA)：(1)Waters ACQUITY UPCBEH(1.7μm,3×100mm I.D.),(2)Waters Acquity UPC2BEH 2-EP(1.7μm,3×100mm I.D.),(3)Acquity UPC2CSHFluoro-Phenyl(1.7μm,2.1×100mm I.D.)and(4)Acquity UPC2HSS C18SB(1.8μm,3×100mm I.D.)。TOLEDO AL204型电子天平(瑞士METTLER公司)。PURELAB Ultra MK2型超纯水仪购自英国ELGA公司。

[0044] SAs对照品：磺胺甲基异恶唑(Sulfamethazine，SMZ，＞99％，w/w)、磺胺间二甲氧嘧啶(Sulfadimethoxypyrimidine，SMM，＞99％，w/w)、磺胺醋酰(Sulfacetamide，STD，＞99％，w/w)、磺胺甲基嘧啶(Sulfamerazine，SMR，＞99％，w/w)、磺胺嘧啶(Sulfadiazine，SDZ，＞99％，w/w)、磺胺噻唑(Sulfathiazole，ST，＞99％，w/w)、磺胺吡啶(Sulfapyridine，SPD，＞99％，w/w)，均购自德国Dr.Ehrenstorfer公司。N4-乙酰磺胺甲基恶唑(N4-Ac SMZ，＞
95％，w/w)、N4-乙酰磺胺甲基嘧啶(N4-Ac SMR，＞95％，w/w)、N4-乙酰磺胺嘧啶(N4-Ac SDZ，＞95％，w/w)、N4-乙酰磺胺噻唑(N4-Ac ST，＞95％，w/w)、N4-乙酰磺胺吡啶(N4-Ac SPD，＞
95％，w/w)，均购自加拿大Toronto Research Chemicals公司。甲醇、乙醇和异丙醇(德国Merck公司，色谱纯)，甲酸铵和醋酸铵(美国Agilent公司，色谱纯)。CO2(食品级)购自北京绿氧天罡科技有限公司，实验室用水为超纯水。

[0045] 1.2标准溶液的配制

[0046] 精密称取12种磺胺及代谢物对照品各0.01g(精确至0.0001g)，用甲醇溶解并定容至100mL容量瓶中，制得各对照100μg/mL混合标准贮备液。在-20℃避光冷冻储存，根据需要，用甲醇稀释成不同质量浓度的标准工作液，4℃避光贮存。

[0047] 1.3色谱条件

[0048] 色谱条件：采用Acquity UPC2BEH色谱柱(100mm×3mm,1.7μm)，柱温：40℃，系统背压：2100psi，样品温度25℃，进样体积2μL。流动相分别为甲醇(B相)和超临界CO2(A相)，柱流速为1.6mL/min，流动相梯度洗脱程序见表1。

[0049] 表1 梯度洗脱程序

[0050]

[0051] 1.4PDA条件

[0052] 3D扫描范围210-600nm，2D补偿吸光度265nm，补偿参比560-600nm。

[0053] 1.5样品前处理

[0054] 精密量取0.5mL血浆样品，置2mL离心管中，加入0.5mL乙腈，涡旋混匀30s，20℃下10000rpm离心10min，取上清液，过0.22μm滤膜，上机检测。

[0055] 2结果

[0056] 2.1专属性

[0057] 取空白血浆，按照“1.5样品前处理”项制备样品溶液，按照“1.3色谱条件”进样，空白血浆色谱图在2-6min时间内无内源性杂质峰出现，不影响SAs测定，该方法专属性高。色谱图见图1。

[0058] 2.2标准曲线和线性范围

[0059] 配制2、4、10、20、40、100μg/mL混合标准溶液，分别精密量取上述各质量浓度的对照品贮备液0.5mL，分别置2mL离心管中，加入空白血浆0.5mL，混匀，使成1、2、5、10、20、50μg/mL的系列样品血浆，按“1.5样品前处理”项下的方法处理，取2μL进样。按照S/N≥3计算得到该方法的检出限(LOD)，S/N≥10计算得到该方法的定量限(LOQ)，以各磺胺峰面积为纵坐标，以各磺胺物质的质量浓度c(μg/mL)为横坐标进行线性权重回归，得回归方程。具体见表2。

[0060] 表2 12种磺胺药物的回归方程、线性范围和定量下限

[0061]

[0062] 2.3精密度与准确度

[0063] 取空白血浆，按“标准曲线和线性范围”项下，配制低、中、高3个质量浓度血浆样品(5、50、100μg/mL)各6份，按“1.5样品前处理”项下方法操作，与标准曲线同批测定，重复测定4d，测定结果经方差分析，求得本法的精密度(RSD)。结果提示，本法的日内精密度RSD为1.5％～4.1％，日间精密度RSD为1.3％～5.2％，准确度为95％～99％，均满足生物样品测定要求。

[0064] 2.4稳定性试验

[0065] 取空白血浆0.5mL置2mL样品管中，分别精密加入0.5mL 10、80、160μg/mL磺胺类对照品贮备液，混匀，制成5、40、80μg/mL低、中、高3个质量浓度的系列血浆样品，按照“1.5样品前处理”项下的方法进行处理，取2μL进样。另按相同方法配3个质量浓度的样品各6份，其中2份在室温下放置5h后，2份反复冻融5次，2份于冰冻条件下保存20d，按相同方法处理上述样品，取上清液2μL进样。由标准曲线求出各样品的质量浓度，与0h的相应质量浓度的样品比较。结果表明：血浆样品在室温放置5h，冻融5次以及-20℃保存20d均稳定性良好。

[0066] 2.5提取回收率

[0067] 取空白血浆0.5mL置2mL样品管中，分别精密加入10、80、160μg/mL磺胺类对照品储备液0.5mL，混匀，制成5、40、80μg/mL低、中、高3个质量浓度的血浆样品，按“1.5样品前处理”项下处理样品，分别取各溶液2μL进样，连续测定5次。不同SAs低、中、高3种质量浓度的提取回收率(n＝5)分别见表3。

[0068] 表3 提取回收率

[0069]

[0070] 截止目前，SAs的测定常规仍采用液相色谱(或串联质谱)，但该类方法分离时间较长、分离效能有待提高，且有机试剂消耗量大，对环境的友好度有待提高。鉴于此，本研究建立了一种快速、高效、环保的新型分离方法，拟用于生物样品中SAs的分析测定。所建立的方法主要具有以下几点优势：(1)分离时间短，6分钟之内即可实现12种SAs的分离；(2)分离效能高，全部物质均能达到基线分离；(3)清洁环保，有效降低了有机试剂的使用量。在该方法的研究过程中，本实验着重考察了不同分离因素对分离效果的影响，具体如下：

[0071] 3.1色谱柱对不同SAs分离效果的影响：

[0072] 本实验中12种SAs，具有结构高度相似，较难分离的特点。实验分别考察了BEH、BEH 2-EP、CSH Fluoro-Phenyl、HSS C18SB色谱柱，结果显示，在相同实验条件下，BEH色谱柱获得了最好的分离效果(各药物对均达到基线分离，R＞1.5)，而其余色谱柱均未能达到对全部物质的基线分离。洗脱顺序为：(1)SMZ,(2)SMM,(3)N4-Ac SMZ,(4)STD,(5)SMR,(6)SPD,(7)SDZ,(8)N4-Ac SMR,(9)N4-Ac SDZ,(10)N4-Ac SPD,(11)ST,(12)N4-Ac ST(见图1)。

[0073] 3.2改性剂对不同SAs分离效果的影响：

[0074] UPC2系统最常用的流动相为CO2，同时加入少量有机试剂作为改性剂以促进分离，不同类别的改性剂对目标物的分离会产生不同的影响，本实验分别考察了甲醇、乙醇和乙腈作为改性剂的分离效果。3种试剂对12种SAs的选择性也有较大差异，其中甲醇分离时间最短且分离效果最优，全部化合物分离度均可达到1.5以上，乙醇和乙腈作为流动相时，对部分磺胺分离度有待提高且分离时间较长。

[0075] 3.3色谱柱温度和系统背压对不同SAs分离效果的影响：

[0076] 在UPC2系统开发过程中，色谱柱温度和系统背压是进行分离优化的两个重要参数，从分离机理上看，改变背压值或色谱柱温度，会显著改变超临界CO2的密度和性能，从而改变其洗脱能力和选择性。本实验分别考察了柱温(30、35、40、45、50、55℃)和系统压力(1500、1800、2100、2400、2700、3000psi)对待测物分离的影响。

[0077] 自30℃开始，随着温度的升高，化合物出峰时间逐渐延长，考虑是因为温度上升会降低超临界流体的密度，降低流动相的洗脱能力，致使化合物的保留时间延长。在35℃以下，化合物SMM和N4-Ac SMZ无法基线分离，随着温度的升高，两化合物的分离程度增大。在45℃以上，N4-Ac SMZ和STD无法基线分离，且随着温度的升高，两者的分离程度降低。

[0078] 自1500psi开始，随着背压的升高，化合物出峰时间逐渐缩短。考虑是因为背压升高会增大超临界流体的密度，增加流动相的洗脱能力，降低化合物的保留时间。背压值在1800psi及以下，SMM和N4-Ac SMZ未能基线分离，且随着背压的增加，两化合物的分离度呈上升趋势；2700psi及以上时，N4-Ac SMZ和STD无法基线分离，且随着背压的增加，两化合物的分离度呈下降趋势。

[0079] 综合温度和系统背压对分离度的影响考虑，选取柱温40℃，系统背压为2100psi为最优条件。

[0080] 3.4洗脱程序对不同SAs分离效果的影响：

[0081] 本研究分别考察了80％、85％、90％、95％CO2四种条件下等度洗脱，发现80％CO2等度洗脱会造成全部色谱峰在1.8分钟内洗脱，无法达到基线分离，85％CO2等度洗脱全部物质会在3.2min内出峰，分离效果也不满意，90％CO2等度洗脱，全部物质会于9min内出峰，但对磺胺间二甲氧嘧啶和N4-乙酰磺胺甲基恶唑未能分离，95％CO2等度洗脱，分离时间超过10min，且峰型扁宽，无法令人满意，综合以上结果采用梯度洗脱。

[0082] 实验中分别考察了5种梯度程序，最终发现洗脱程序：0min：95％CO2；5min：85％CO2；5.5min：80％CO2；6min：95％CO2；7min：95％CO2，能够取得对全部待测物质的基线分离(分离度＞1.5)。

[0083] 3.5色谱流速对不同SAs分离效果的影响：

[0084] 本研究分别考察了1.2-2.2mL/min流速对分离的影响。结果显示，随着流速的增加，化合物出峰时间显著缩短。综合分离效果和分离速率考虑，选用1.6mL/min流速效果最优。