黄酮类化合物CH625在制备抗神经胶质瘤药物中的应用

摘要

本发明公开了黄酮类化合物CH625在制备抗神经胶质瘤药物中的应用。属于医药领域。本发明在构建神经胶质瘤模型的基础上，通过免疫荧光、Western blot、流式细胞术等实验方法研究CH625体内抗肿瘤效果，结果表明，CH625通过抑制CYP4X1的活性抗神经胶质瘤血管生成，诱导血管正常化从而达到抗神经胶质瘤的效果。CH625的制备方法十分纯熟，经由天然提取或化工合成均能得到纯度较高且品质优良的CH625单体，对人体没有毒副作用，药效迅速，无刺激性、使用安全，效果良好。

权利要求

1.黄酮类化合物4, 4'-二羟基-2', 6'-二甲氧基查尔酮在制备抗神经胶质瘤药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的神经胶质瘤为CYP4X1高表达的肿瘤。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物抑制神经胶质瘤中CYP4X1的活性。

4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述的药物促使神经胶质瘤血管正常化。

说明书

黄酮类化合物CH625在制备抗神经胶质瘤药物中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于中药领域，具体涉及黄酮类化合物CH625在制备抑制肿瘤血管生成从而治疗神经胶质瘤的新用途。

背景技术

[0002] 胶质母细胞瘤(GBM)是最常见的原发性恶性脑肿瘤(Wick et al.,2017)。血管生成在胶质瘤发生发展过程中其重要作用(Turkowski et al.,2018)。血管内皮生长因子(VEGF)抑制剂常用于临床上阻断胶质瘤血管生成，但未能改善总生存期(Wick et al.,2016)；血管生成抑制剂索拉非尼，舒尼替尼或贝伐单抗在临床治疗中可增加PD-L1的表达，并促进免疫抑制微环境(Ramjiawan et al.,2017)。目前，我们面临的挑战是克服这些局限性，并提升抗血管生成治疗的优势。因此，在抗血管生成治疗过程中，促使肿瘤血管的正常化，同时增强T细胞浸润，提高化疗药的临床疗效，可能是人胶质瘤的潜在治疗策略。

[0003] 内源性大麻素系统包括内源性配体如花生四烯酸乙酰胺(anandamide，AEA)，大麻素受体(CB)1/2和负责它们合成和降解的酶(Snider et al.,2010)。AEA通过减少VEGF和TGF-β的产生显著抑制胶质瘤生长和血管生成(Ma et al.,2016；Picardi et al.,2014)。细胞色素P450(CYP)4X1是一种孤儿酶，在大脑中表达，并代谢AEA为14,15-环氧二十碳三烯酸乙醇酰胺(14,15-epoxyeicosatrienoic acid-ethanolamide，14,15-EET-EA)(Snider et al.,2010)。Cyp4x1基因表达的节律性调节和EETs在大鼠脑和血管系统中的产生可能有助于血流昼夜节律性变化(Carver et al.,2014)。CYP4X1在乳腺癌中高表达，并与肿瘤分级相关(Murray et al.,2010)。然而，CYP4X1在胶质瘤血管生成中的作用及其分子机制尚未阐明。

[0004] 黄酮类化合物4,4'-二羟基-2',6'-二甲氧基查尔酮(CH625，CAS:123316-64-3)是一种天然的查尔酮类化合物，发现于草本植物南姜(Alpinia galanga)的根茎部位。迄今为止，CH625对肿瘤的作用还未见报道。

发明内容

[0005] 为了克服现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供黄酮类化合物CH625在制备抗神经胶质瘤药物中的应用，由于黄酮类化合物CH625对人体无毒，无刺激性，因此使用安全，且效果良好。

[0006] 为了实现以上目的本发明采用如下技术方案：

[0007] 本发明第一方面，提供黄酮类化合物CH625在制备抗神经胶质瘤药物中的应用。

[0008] 优选地，提供黄酮类化合物CH625在制备促使神经胶质瘤血管正常化的药物中的应用。

[0009] 优选地，提供黄酮类化合物CH625在制备治疗伴随CYP4X1高表达的神经胶质瘤的药物中的应用。

[0010] 本发明将胶质瘤细胞分别皮下、颅内接种到大、小鼠中，荷瘤大、小鼠随机分为对照组、CH625处理组(腹腔注射25和50mg/kg)、舒尼替尼(80mg/kg)处理组，记录生存率、检测14、15-EET-EA水平，测定瘤重，计算抑瘤率，激光多普勒成像仪检测肿瘤血管灌注。结果表明，与空白组和舒尼替尼组相比，CH625(20mg/kg)能显著提高荷瘤大、小鼠的生存率，降低瘤内14、15-EET-EA水平，降低荷瘤大、小鼠的瘤重。CH625(10，20mg/kg)在治疗2天后，荷C6大鼠的肿瘤灌注分别增加了17.1％和19.6％。到第4天，血流速度仍能稳定上升21.0％和
27.1％，第4到8天，肿瘤灌注量迅速下降了20.4％和17.3％。对照组肿瘤灌注在2天后仅增加7.5％，到第4天最多增加9.5％，到第8天下降6.5％。CH625可有效抑制神经胶质瘤的生长并延长荷神经胶质瘤大/小鼠的生存率，并降低瘤内CYP4X1代谢的14、15-EET-EA水平。

[0011] 本发明将GL261小鼠胶质瘤细胞(9×105)分别与BMDMs或CYP4X1high BMDMs(3×105)以3：1的比例接种于C57BL/6小鼠右后肢皮下。当肿瘤直径约0.5cm时，将荷瘤小鼠随机分为对照组、CH625(i.p.25,50mg/kg)组，每组8只。处理8天后处死小鼠，收集肿瘤并分析。
5 high 5
GL261细胞(9×10)与BMDMs或CYP4X1  BMDMs细胞(3×10)分别混合接种的小鼠肿瘤组织中。结果表明，CYP4X1high组肿瘤质量明显重于对照组；CH625处理组的肿瘤质量显著低于对照组，CYP4X1过表达后瘤重相对CH625处理组显著上升。CYP4X1high组CD31+α-SMA+显著低于对照组，CH625处理组的CD31+α-SMA+细胞数显著高于对照组，CYP4X1过表达后CD31+α-SMA+ high
细胞数相对CH625处理组显著下降。CYP4X1 组血管灌注显著低于对照组，CH625处理组的血管灌注显著高于对照组，CYP4X1过表达后血管灌注相对CH625处理组显著下降。
CYP4X1high组14,15-EET-EA、VEGF和TGF-β产出显著高于对照组，CH625处理组的14,15-EET-EA、VEGF和TGF-β产出显著低于对照组，CYP4X1过表达后14,15-EET-EA、VEGF和TGF-β产出相对CH625处理组显著上升。CYP4X1high组比对照组PD-L1水平明显增高；CH625处理组的PD-L1水平显著低于对照组，CYP4X1过表达后PD-L1表达相对CH625处理组显著上升。CYP4X1high组CD8+T细胞数明显低于对照组；CH625处理组的CD8+T细胞数显著高于对照组，CYP4X1过表达后CD8+T细胞数相对CH625处理组显著下降。CYP4X1high组CD8+T细胞中颗粒酶B、IFN-γ、IL-2产出明显低于对照组；CH625处理组CD8+T细胞中颗粒酶B、IFN-γ、IL-2产出显著高于对照组，CYP4X1过表达后CD8+T细胞中颗粒酶B、IFN-γ、IL-2产出相对CH625处理组显著下降。因此，CH625在体内可通过抑制BMDMs中CYP4X1的活性诱导血管正常化，增强抗肿瘤作用。

[0012] 本发明具有以下优点：

[0013] 1)CH625原料来源广泛且质量优良。

[0014] 2)CH625的制备方法十分纯熟，经由天然提取或化工合成均能得到纯度较高且品质优良的CH625单体。

[0015] 3)本发明采用的CH625能有效的使神经胶质瘤血管正常化，选择范围广。

[0016] 4)CH625对人体没有毒副作用，药效迅速，无刺激性、使用安全，效果良好。

[0017] 5)本发明采用常规口服给药剂型，技术成熟，生产工艺简单易行。

[0018] 6)本发明采用常规给药方式，给药方便，无痛苦。

附图说明

[0019] 图1生存率、14、15-EET-EA水平分析；*P<0.05，**P<0.01。

[0020] 图2大、小鼠肿瘤质量变化；*P<0.05，**P<0.01。

[0021] 图3血管生成的影响；

[0022] 图4混种小鼠肿瘤质量变化；*P<0.05，**P<0.01；^P<0.05，^^P<0.01。

[0023] 图5免疫荧光检测CD31+α-SMA+血管；*P<0.05，**P<0.01；^P<0.05，^^P<0.01。

[0024] 图6血管生成的影响；*P<0.05，**P<0.01；^P<0.05，^^P<0.01。

[0025] 图7LC-MS/MS检测14,15-EET-EA水平、ELISA检测TGF-β水平；*P<0.05，**P<0.01；^P<0.05，^^P<0.01。

[0026] 图8Western blot分析PD-L1水平；*P<0.05，**P<0.01；^P<0.05，^^P<0.01。

[0027] 图9流式细胞术检测CD8+T细胞数量；*P<0.05，**P<0.01；^P<0.05，^^P<0.01。

[0028] 图10CD8+T细胞中颗粒酶B、IFN-γ、IL-2的检测；*P<0.05，**P<0.01；^P<0.05，^^P<0.01。

具体实施方式

[0029] 通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

[0030] 以下实施例所用的CH625购于MOLBASE(上海,中国)，纯度>95％。

[0031] 【实施例1】CH625对荷神经胶质瘤大、小鼠的影响

[0032] (一)动物分组及处理

[0033] 将大鼠C6胶质瘤细胞(5×106)分别皮下、颅内接种到Wistar大鼠中。当皮下肿瘤直径约0.5cm时，将荷瘤大鼠随机分为对照组、CH625处理组(腹腔注射25和50mg/kg)、舒尼替尼(80mg/kg)处理组，每组8只。将小鼠GL261胶质瘤细胞(2×106)分别皮下、颅内接种到C57BL/6小鼠中，当皮下肿瘤直径约0.5cm时，分组及处理方式同大鼠，每组10只。末次给药24h后处死动物，称瘤重，计算抑瘤率。

[0034] (二)实验检测

[0035] 1.记录生存率、检测14、15-EET-EA水平：每天观察大、小鼠存活情况，并制作生存曲线；利用LC-MS/MS检测14、15-EET-EA水平。

[0036] 2.瘤重的测定和抑瘤率的计算：末次给药24h后处死动物，完整剥离肿瘤，观察肿瘤组织标体的色泽、质地，并用电子天平称取瘤重，计算抑瘤率。

[0037] 3激光多普勒成像仪检测肿瘤血管灌注：在第0、2、4、6、8天用0.6％戊巴比妥钠麻醉，并将大鼠置于37℃热板上。打开皮肤进行检测。以灌注虚拟单位记录数据。记录过程中注意大鼠的呼吸状况。避免呼吸对读数的影响。

[0038] (三)实验结果

[0039] 1.如图1A，与空白组和舒尼替尼组相比，CH625(20mg/kg)能显著增加荷C6大鼠的生存率，降低瘤内14、15-EET-EA水平。与CH625组相反，舒尼替尼组显著增高瘤内14、15-EET-EA水平；

[0040] 2.如图1B，与空白组相比，CH625(20mg/kg)能显著增加荷GL261小鼠的生存率，降低瘤内14、15-EET-EA水平。与CH625组相反，舒尼替尼组显著增高瘤内14、15-EET-EA水平；

[0041] 3.如图2A，与空白组相比，CH625(20mg/kg)能显著降低荷C6大鼠的瘤重，降低瘤内14、15-EET-EA水平。与CH625组相反，舒尼替尼组显著增高瘤内14、15-EET-EA水平；

[0042] 4.如图2B，与空白组相比，CH625(20mg/kg)能显著降低荷GL261小鼠的瘤重，降低瘤内14、15-EET-EA水平。与CH625组相反，舒尼替尼组显著增高瘤内14、15-EET-EA水平；

[0043] 5.如图3，CH625(10，20mg/kg)在治疗2天后，荷C6大鼠的肿瘤灌注分别增加了17.1％和19.6％。到第4天，血流速度仍能稳定上升21.0％和27.1％，第4到8天，肿瘤灌注量迅速下降了20.4％和17.3％。对照组肿瘤灌注在2天后仅增加7.5％，到第4天最多增加
9.5％，到第8天下降6.5％。

[0044] (四)结论

[0045] 上述实验结果表明，CH625可有效抑制神经胶质瘤的生长并延长荷神经胶质瘤大/小鼠的生存率，并降低瘤内CYP4X1代谢的14、15-EET-EA水平。

[0046] 综合以上实验的结果、结论，可以确信，CH625是治疗神经胶质瘤的有效药物。【实施例2】CH625通过抑制BMDMs中CYP4X1治疗神经胶质瘤的研究

[0047] (一)动物分组及处理

[0048] 小鼠骨髓来源的单核巨噬细胞(BMDMs)转染CYP4X1慢病毒颗粒(Santa Cruz,CA,highUSA)，构建CYP4X1过表达的CYP4X1  BMDMs细胞。

[0049] GL261细胞(9×105)分别与BMDMs或CYP4X1high BMDMs(3×105)以3：1的比例接种于C57BL/6小鼠右后肢皮下。当肿瘤直径约0.5cm时，将荷瘤小鼠随机分为对照组、GH625(i.p.25,50mg/kg)组，每组8只。处理8天后处死小鼠，收集肿瘤并分析。

[0050] (二)实验检测

[0051] 1.称取小鼠肿瘤，并记录小鼠肿瘤质量；

[0052] 2.Western blot检测PD-L1水平

[0053] 提取以上分组及处理的肿瘤组织中的巨噬细胞。采用Bradford法测定蛋白质浓度，等量蛋白质(20μg)经10％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离并转移到PVDF膜上(Millipore，美国)。封闭缓冲液(含5％脱脂牛奶和1‰吐温20的TBS)室温下封闭1h。随后，与抗PD-L1的特异性一抗4℃孵育过夜，然后用适量辣根过氧化物酶偶联的二抗(1:5000)室温孵育1h，最后加入ECL试剂，胶片曝光，显影，定影。图象处理系统扫描其灰度值，并采用Image J软件进行半定量分析。

[0054] 3.免疫荧光检测CD31+α-SMA+血管

[0055] 所有样品采用0.1M甘氨酸透明，含0.5％Triton X-100的PBS处理15分钟。10％血清封闭1h后，anti-CD31(1:100),anti-SMA(1:200)一抗4℃孵育过夜，PBS洗涤后，Alexa Fluor 488-和Alexa Fluor 594-共轭的二抗封闭1h。最后，样品经PBS洗涤后，用含DAPI的荧光封固剂封片。

[0056] 4.肿瘤血管灌注

[0057] 用3％or 0.6％戊巴比妥钠麻醉，并将大、小鼠置于37℃热板上。打开皮肤进行检测。以灌注虚拟单位记录数据。记录过程注意小鼠的呼吸状况。避免呼吸对读数的影响。

[0058] 5.14,15-EET-EA、VEGF和TGF-β检测

[0059] 采用液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)测定肿瘤组织中14,15-EET-EA浓度。主要步骤简述如下：样品经乙酸乙酯抽提2次后,有机膜过滤，氮气吹干后再溶于50％的乙腈，上样到Hypersil ODS柱分离洗脱，最后经Agilent LSD负离子质谱检测系统进行检测。柱温35℃。流动相采用乙腈∶水∶乙酸梯度洗脱，流速为0.3mL/min。根据14,15-EET-EA标准品绘制的标准曲线，计算14,15-EET-EA的含量。

[0060] 取上述各组肿瘤组织，按照ELISA试剂盒说明书操作步骤，测定小鼠GL261胶质瘤组织中的VEGF和TGF-β浓度。

[0061] 6.流式细胞术检测CD8+T细胞数

[0062] 收集到的细胞用带有APC标记的anti-CD3和FITC标记的anti-CD8抗体标记。FACS Aria III流式细胞分析仪得到FACS数据后，采用FlowJo软件分析数据。

[0063] 7.CD8+T细胞中颗粒酶B、IFN-γ、IL-2的检测

[0064] 取上述各组肿瘤组织，按照ELISA试剂盒说明书操作步骤，测定小鼠GL261胶质瘤组织中的颗粒酶B、IFN-γ、IL-2的水平；

[0065] (三)结果

[0066] 1.如图4，GL261细胞(9×105)与BMDMs或CYP4X1high BMDMs细胞(3×105)分别混合接种的小鼠肿瘤组织中，CYP4X1high组肿瘤质量明显重于对照组；CH625处理组的肿瘤质量显著低于对照组，CYP4X1过表达后瘤重相对CH625处理组显著上升。

[0067] 2.如图5，CYP4X1high组CD31+α-SMA+显著低于对照组，CH625处理组的CD31+α-SMA+细胞数显著高于对照组，CYP4X1过表达后CD31+α-SMA+细胞数相对CH625处理组显著下降。

[0068] 3.如图6，CYP4X1high组血管灌注显著低于对照组，CH625处理组的血管灌注显著高于对照组，CYP4X1过表达后血管灌注相对CH625处理组显著下降。

[0069] 4.如图7，CYP4X1high组14,15-EET-EA、VEGF和TGF-β产出显著高于对照组，CH625处理组的14,15-EET-EA、VEGF和TGF-β产出显著低于对照组，CYP4X1过表达后14,15-EET-EA、VEGF和TGF-β产出相对CH625处理组显著上升。5.如图8，CYP4X1high组比对照组PD-L1水平明显增高；CH625处理组的PD-L1水平显著低于对照组，CYP4X1过表达后PD-L1表达相对CH625处理组显著上升。

[0070] 6.如图9，CYP4X1high组CD8+T细胞数明显低于对照组；CH625处理组的CD8+T细胞数显著高于对照组，CYP4X1过表达后CD8+T细胞数相对CH625处理组显著下降。

[0071] 7.如图10，CYP4X1high组CD8+T细胞中颗粒酶B、IFN-γ、IL-2产出明显低于对照组；CH625处理组CD8+T细胞中颗粒酶B、IFN-γ、IL-2产出显著高于对照组，CYP4X1过表达后CD8+T细胞中颗粒酶B、IFN-γ、IL-2产出相对CH625处理组显著下降

[0072] (四)结论

[0073] 上述实验结果表明，CH625在体内可通过抑制BMDMs中CYP4X1的活性诱导血管正常化增强抗肿瘤免疫抗肿瘤。

[0074] 综合以上实验的结果、结论，可以确信，CH625是抗肿瘤的有效药物。

[0075] 应当理解的是，本说明书未详细阐述的部分均属于现有技术。

[0076] 应当理解的是，上述针对较佳实施例的描述较为详细，并不能因此而认为是对本发明专利保护范围的限制，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明权利要求所保护的范围情况下，还可以做出替换或变形，均落入本发明的保护范围之内，本发明的请求保护范围应以所附权利要求为准。