芳香酯类化合物用于制备抗ADV-7病毒药物

摘要

本发明公开芳香酯类化合物用于制备抗ADV‑7病毒药物，芳香酯类化合物为有以下的化学结构式：的化合物；芳香酯化合物WY89,WY94，WY95，WY96，WY97和WY99通过抗ADV‑7活性研究实验，证实芳香酯化合物WY89,WY94，WY95，WY96，WY97和WY99能抑制ADV‑7在宿主细胞HeLa上产生的细胞病变效应(CPE)，增强细胞存活率，降低子代病毒产量，抑制ADV‑7感染引起的宿主细胞凋亡，可用于制备抗ADV‑7病毒药物。

权利要求

1.芳香酯类化合物在制备抗ADV-7病毒药物中的应用，其特征在于：芳香酯类化合物为化学结构式如下：的化合物；芳香酯化合物WY89,WY94，WY95，WY96，WY97和WY99浓度为40μg/mL时，对于ADV-7导致细胞病变效应的抑制率分别为3.61％，51.79％，9.11％，84.77％，81.39％，

80.36％，用于制备抗ADV-7病毒药物。

2.根据权利要求1所述的芳香酯类化合物在制备抗ADV-7病毒药物中的应用，其特征在于：芳香酯化合物WY89,WY94，WY95，WY96，WY97和WY99添加药剂学可接受的辅料和载体，通过常规方法制备抗ADV-7病毒药物。

3.根据权利要求1所述的芳香酯类化合物在制备抗ADV-7病毒药物中的应用，其特征在于：抗ADV-7病毒药剂物为颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂、悬浮剂或乳剂。

说明书

芳香酯类化合物用于制备抗ADV-7病毒药物

技术领域

[0001] 本发明涉及属于抗病毒药物技术领域，具体涉及一种芳香酯类化合物用于制备抗ADV-7病毒药物。

背景技术

[0002] 腺病毒(Adenovirus)是从手术切除的扁桃体组织分离培养得到的一种DNA病毒,主要在细胞核内繁殖,常引起人上呼吸道和眼部上皮细胞感染。腺病毒作为普通的机会性病原体长期存在于人群中,免疫功能低下的病人感染腺病毒的机率较大,在居住密集的人群,如军队人员中可引起急性发热性呼吸道疾病的暴发流行。随着免疫学、分子生物学、分子病毒学等各个学科的发展和相互渗透,腺病毒在分子水平上的应用越来越广泛,特别是有关腺病毒的感染、致病、抗腺病毒的治疗和腺病毒载体的应用已成为研究的热点，因此研发一种新的抗腺病毒药物势在必行。

[0003] 酯类化合物是一类重要的精细化工产品，广泛应用于药物、材料、食品、增塑剂、溶剂等化工行业。本申请人所在项目组自主合成了上述两种具有新型结构的含氮杂环酯类化合物，并于2015年在期刊Tetrahedron Letters公开了这几种芳香酯化合物的制备方法。未对其生物学活性进行评价。

发明内容

[0004] 本发明的目的是针对上述现状，旨在提供芳香酯类化合物用于制备抗ADV-7病毒药物。

[0005] 本发明目的的实现方式为，芳香酯类化合物用于制备抗ADV-7病毒药物，芳香酯类化合物为化学结构式如下：

[0006]

[0007] 的化合物；芳香酯化合物WY89,WY94，WY95，WY96，WY97和WY99浓度为40μg/mL时，对于ADV-7导致细胞病变效应的抑制率分别为3.61％，51.79％，9.11％，84.77％，81.39％，80.36％，用于制备抗ADV-7病毒药物。

[0008] 本申请人通过大量的生物学实验，发现芳香酯化合物WY89,WY94,WY95，WY96，WY97和WY99具有抗ADV-7病毒的活性。具体表现为可以强烈抑制ADV-7病毒引起的细胞病变效应，增强感染细胞的存活率。强烈抑制ADV-7病毒在细胞内的复制增殖，降低子代病毒产量，保护细胞免受ADV-7感染引发的凋亡。由此表明芳香酯化合物WY89,WY94,WY95，WY96，WY97和WY99有潜力制备抗ADV-7病毒感染的药物，具有大的临床应用前景。

[0009] 本发明具有以下优点：

[0010] 1、芳香酯化合物WY89,WY94，WY95，WY96，WY97和WY99合成工艺简单，经济快速，易于大规模生产推广。

[0011] 2、从与芳香酯化合物WY89,WY94，WY95，WY96，WY97和WY99结构相似的化合物中寻找抗ADV-7药物，易于通过构效关系研究寻找到其作用靶点，为进一步制备药物开发提供有价值的导向作用。

附图说明

[0012] 图1是化合物WY89,WY94,WY95，WY96，WY97和WY99对于ADV-7作用的HeLa细胞存活率的影响图。

[0013] 图2a、b、c、d分别是HeLa、ADV-7、WY96+ADV-7、WY99+ADV-7对于ADV-7引起的HeLa细胞CPE的抑制效应图。

[0014] 图3a、b、c分别是HeLa、ADV-7及WY96+ADV-7对于ADV-7引起的HeLa细胞凋亡的抑制作用图。

[0015] 图4是化合物WY96对于ADV-7子代病毒产量的抑制作用图。

具体实施方式

[0016] 本申请人自主合成了芳香酯化合物WY89,WY94,WY95，WY96，WY97和WY99，并于2015年在期刊Tetrahedron Letters公开了这几种芳香酯化合物的制备方法，但未对其生物学活性进行评价。

[0017] 本发明的芳香酯化合物WY89,WY94,WY95，WY96，WY97和WY99的制备，参照文献Tetrahedron Letters 2015，56，6136–6141的方法，具体是以过渡金属钯为催化剂，在吡啶的邻位诱导作用下，在芳环的邻位用高价碘苯作用，进行芳酰氧基化，得到最终芳香酯化合物。

[0018] 芳香酯化合物WY89,WY94，WY95，WY96，WY97和WY99添加药剂学可接受的辅料和载体，通过常规方法制备抗ADV-7病毒药物。

[0019] 抗ADV-7病毒药剂物为颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂、悬浮剂或乳剂。

[0020] 本发明具有新型结构的芳香酯化合物WY89,WY94,WY95，WY96，WY97和WY99有以下的化学结构式：

[0021]

[0022] 本发明芳香酯化合物WY89,WY94,WY95，WY96，WY97和WY99作为抗ADV-7病毒的应用，包括芳香酯化合物WY89,WY94,WY95，WY96，WY97和WY99强烈抑制ADV-7在宿主细胞HeLa产生的细胞病变效应(CPE)，增强细胞存活率。强烈抑制ADV-7病毒在细胞内的复制增殖，降低子代病毒产量，保护细胞免受ADV-7感染引发的凋亡。这些研究表明芳香酯化合物WY89,WY94,WY95，WY96，WY97和WY99有潜力发展成为有效治疗ADV-7感染药物。

[0023] 本申请人对芳香酯化合物WY89,WY94,WY95，WY96，WY97和WY99进行了抗ADV-7活性研究实验，实验情况如下：在下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。

[0024] 1、试验内容：

[0025] 芳香酯化合物WY89,WY94,WY95，WY96，WY97和WY99抗ADV-7活性分析：本发明将结合细胞病变效应分析和MTT测定细胞存活率检测方法，对具有新型结构的芳香酯化合物WY89,WY94,WY95，WY96，WY97和WY99的抗ADV-7活性进行评估。

[0026] 2、试验方法：

[0027] 2.1.1芳香酯化合物WY89,WY94,WY95，WY96，WY97和WY99对于宿主HeLa细胞的毒性[0028] 将HeLa细胞铺板96孔板，在37℃，5％CO2培养箱培养长满单层后，弃去细胞培养液，分别加含不同浓度芳香酯化合物WY89,WY94,WY95，WY96，WY97和WY99的细胞维持液继续培养，48h后显微镜目测并分别记录其细胞毒性，MTT法测定细胞存活率。SPSS 11.5软件计算芳香酯化合物WY89,WY94,WY95，WY96，WY97和WY99对于细胞的半数中毒浓度(Median cyctoxic concentration，CC50)。细胞存活率＝(药物组平均OD492值/细胞对照组平均OD492值)×100％。

[0029] 2.1.2芳香酯化合物WY89,WY94,WY95，WY96，WY97和WY99对于ADV-7的抑制活性[0030] 将HeLa细胞铺板96孔板，在37℃，5％CO2培养箱培养长满单层后，弃去培养液，100TCID50的ADV-7病毒液感染细胞1h，加入不同浓度的芳香酯化合物WY89,WY94,WY95，WY96，WY97和WY99(利巴韦林作为阳性对照药物)孵育细胞。待继续培养约48h，病毒对照孔出现90％左右的CPE病变时，显微镜下观察细胞病变效应(CPE)。CPE的观察记录方法：无细胞病变记做-，25％以下细胞病变记做+，25％-50％细胞病变记做++，50％-75％细胞病变记做+++，75％以上细胞病变记为++++。

[0031] CPE观察完毕后，利用MTT方法检测芳香酯化合物WY89,WY94,WY95，WY96，WY97和WY99对ADV的抑制率。具体步骤为：每孔加入MTT 50μL(5mg·mL-1)，孵育3-4h后去掉上清液，加入等体积的DMSO溶解沉淀。用酶标仪在492nm处读取所对应的吸光度(OD492值)。利用如下公式计算芳香酯化合物WY89,WY94,WY95，WY96，WY97和WY99对ADV的抑制率。用SPSS 11.5软件计算芳香酯化合物WY89,WY94,WY95，WY96，WY97和WY99的半数有效浓度(Concentration for 50％of maximal effect，EC50)。

[0032]

[0033] 2.1.3药物的治疗指数(SI)

[0034] SI＝CC50/EC50。治疗指数越高，说明抗病毒潜力越大。

[0035] 3、试验结果

[0036] 表1具有新型结构的芳香酯类化合物细胞毒性及抗ADV活性

[0037]

[0038] 化合物细胞毒性及抗ADV活性测试结果如表1所示。浓度依赖的芳香酯化合物WY89,WY94,WY95，WY96，WY97和WY99对于ADV作用的HeLa细胞存活率的影响如图1所示。本发明检测到芳香酯化合物WY95化合物对ADV确认无效。芳香酯化合物WY89,WY94,WY96,WY97和WY99对于ADV有较强的抑制活性。芳香酯化合物WY97和WY99的治疗指数较低,芳香酯化合物WY96治疗指数较高。芳香酯化合物WY96抑制ADV引起的HeLa细胞CPE效应如图2所示。ADV感染的HeLa细胞变圆，从细胞板壁脱离，芳香酯化合物WY96(40μg/mL)处理对于其病变效应有一定的抑制作用，芳香酯化合物WY96有较好的抑制效果，能抑制大部分ADV引起的HeLa细胞病变效应，抑制率达80％

[0039] 本申请人进一步实施了芳香酯化合物WY96于ADV-7引起的HeLa细胞凋亡的抑制作用试验，试验情况如下：

[0040] 1、试验内容

[0041] ADV感染HeLa细胞后，在细胞内增殖破坏细胞正常的生命活动，最终导致细胞凋亡。因此本申请人进一步检测在ADV感染HeLa细胞后，芳香酯化合物WY96对于ADV引起的HeLa细胞凋亡的抑制作用。

[0042] 2、试验方法

[0043] 对数生长期的HeLa细胞铺板24孔板，长满单层后100TCID50ADV感染细胞，37℃孵育1.5h后移去病毒液，加入含40μg/mL WY96的细胞维持液。大约48h后，收集细胞，运用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒在流式细胞仪上进行细胞凋亡的检测。

[0044] 3、试验结果

[0045] 实验结果表明，40μg/mL芳香酯化合物WY96可以有效抑制ADV-7导致的细胞凋亡。在病毒对照组细胞凋亡率为99.49％(图3-b)，正常未处理细胞凋亡率13.92％的情况下(图
3-a)，40μg/mL WY96处理的细胞凋亡率有31.86％。可见芳香酯化合物WY96可以有效保护ADV-7导致的细胞凋亡。

[0046] 本申请人对芳香酯化合物WY96进行了抗ADV-7活性的深入研究，实施了芳香酯化合物WY96对于ADV-7子代病毒产量的抑制作用试验，试验情况如下：

[0047] 1、试验内容

[0048] 检测在ADV-7感染HeLa细胞后，芳香酯化合物WY96对于ADV-7子代病毒产量的抑制作用。

[0049] 2、试验方法

[0050] 对数生长期的HeLa细胞铺板24孔板，长满单层后100TCID50ADV-7感染细胞，37℃孵育1.5h后移去病毒液，PBS洗涤三次，分别加入含40μg/mL芳香酯化合物WY96的细胞维持液。48h后收集细胞和上清培养液，-20℃和37℃三次冻融裂解后，TCID50方法测定ADV-7病毒滴度。

[0051] 3、试验结果

[0052] 试验结果见图4，如图4所示，芳香酯化合物WY96处理的HeLa细胞相对于病毒对照组，其病毒滴度显著下降，说明了芳香酯化合物WY96对于ADV-7子代病毒产量强烈的抑制作用。

[0053] 综上所述，具有新型结构的芳香酯化合物WY96WY96具有较强的抑制ADV-7病毒活性的功能，可以强烈抑制ADV-7病毒在HeLa细胞中的复制，有潜力制备一种临床上有效对抗ADV-7感染的药物。