一种四重刺激响应聚氨基酸纳米凝胶及其制备方法和应用

摘要

本发明属于智能型高分子材料技术领域，涉及一种四重刺激响应聚氨基酸纳米凝胶及其制备方法和应用。本发明仅利用乙烯基氨基酸功能单体，在大分子链转移剂和引发剂的存在下，采用水相可控自由基聚合的方法制备纳米凝胶。该方法采用聚合诱导的自组装方法制备纳米凝胶，在纳米凝胶制备及载药过程不使用小分子表面活性剂及有机溶剂；所得纳米凝胶具有良好的生物相容性和手性，且在降低外界温度和pH、通入CO2气体之后粒径增大、加入还原剂后溶解为水溶性大分子，因此可用于控制负载分子的智能释放。

权利要求

1.一种四重刺激响应聚氨基酸纳米凝胶，其特征在于：所述的聚氨基酸纳米凝胶由大分子链转移剂、N,N’-双(丙烯酰)胱胺、水溶性引发剂、氨基酸单体在水中聚合而成；其中，所述的大分子链转移剂为末端含有硫代碳酸酯结构的水溶性高分子；所述的氨基酸单体为乙烯基氨基酸；

所述的乙烯基氨基酸为下述氨基酸单体中的一种，单体A-1：N-丙烯酰-甘氨酸-L-亮氨酸-N,N-二甲氨基乙酰胺、单体A-2：N-甲基丙烯酰-甘氨酸-L-亮氨酸-N,N-二甲氨基乙酰胺、单体A-3：N-丙烯酰-甘氨酸-L-亮氨酸-N,N-二甲氨基丙酰胺、单体B-1：甲基丙烯酰-L-丙氨酸-N,N二乙基乙酰胺、单体B-2：甲基丙烯酰-L-丙氨酸-N,N二甲基丙酰胺、单体B-3：甲基丙烯酰-L-丙氨酸-N,N二乙基丙酰胺，其分子结构分别为：。

2.如权利要求1所述的一种四重刺激响应聚氨基酸纳米凝胶，所述的聚氨基酸纳米凝胶在降低外界温度、降低pH、通入CO2气体之后粒径增大，加入还原剂后溶解为水溶性大分子。

3.一种四重刺激响应聚氨基酸纳米凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、 将大分子链转移剂、N,N’-双(丙烯酰)胱胺、水溶性引发剂、氨基酸单体按照摩尔比为1︰1～6︰0.1～0.6︰20～500的比例加入反应器中，再加去离子水使固含量为8～30 wt%；

S2、 通入惰性气体除氧，除氧时间为10～30min，然后在温度为50～80℃条件下聚合，聚合时间为1～7 h；

S3、 透析除去溶液中的杂质，冷冻干燥，得到四重刺激响应聚氨基酸纳米凝胶；

其中，步骤S1中，所述的大分子链转移剂为末端含有硫代碳酸酯结构的水溶性高分子，所述的氨基酸单体为乙烯基氨基酸，所述的水溶性引发剂为水溶性偶氮类引发剂或过硫酸盐；所述的乙烯基氨基酸为下述氨基酸单体中的一种，单体A-1：N-丙烯酰-甘氨酸-L-亮氨酸-N,N-二甲氨基乙酰胺、单体A-2：N-甲基丙烯酰-甘氨酸-L-亮氨酸-N,N-二甲氨基乙酰胺、单体A-3：N-丙烯酰-甘氨酸-L-亮氨酸-N,N-二甲氨基丙酰胺、单体B-1：甲基丙烯酰-L-丙氨酸-N,N二乙基乙酰胺、单体B-2：甲基丙烯酰-L-丙氨酸-N,N二甲基丙酰胺、单体B-3：甲基丙烯酰-L-丙氨酸-N,N二乙基丙酰胺。

4.如权利要求3所述的一种四重刺激响应聚氨基酸纳米凝胶的制备方法，其特征在于：步骤S1中，将所述的大分子链转移剂、N,N’-双(丙烯酰)胱胺、水溶性引发剂、氨基酸单体按照摩尔比为1︰2～5︰0.2～0.5︰30～400的比例加入反应器中；所述的固含量为10～25 wt%。

5.如权利要求3所述的一种四重刺激响应聚氨基酸纳米凝胶的制备方法，其特征在于：步骤S2中，所述的除氧时间为15～20min；所述的温度为55～75℃；所述的聚合时间为1～6 h；步骤S3中，所述的透析为在蒸馏水中透析，透析时间为12～36 h；所述的冷冻干燥的时间为36～72 h。

6.如权利要求3所述的一种四重刺激响应聚氨基酸纳米凝胶的制备方法，其特征在于：步骤S1中，所述的水溶性偶氮类引发剂为偶氮二氰基戊酸、偶氮二异丁基脒盐酸盐中的一种，所述的过硫酸盐为过硫酸钾、过硫酸铵中的一种。

7.如权利要求3所述的一种四重刺激响应聚氨基酸纳米凝胶的制备方法，其特征在于：步骤S1中，所述的大分子链转移剂为CTA-1、CTA-2和CTA-3中的一种，其分子结构式分别为：。

8.一种如权利要求1所述的四重刺激响应聚氨基酸纳米凝胶的用途，其特征在于：可用于控制负载分子的智能释放。

说明书

一种四重刺激响应聚氨基酸纳米凝胶及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明属于智能材料技术领域，涉及聚合物纳米凝胶的制备方法及应用，具体涉及一种四重刺激响应聚氨基酸纳米凝胶及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 智能材料泛指能够感知外界环境并做出响应的材料。智能材料能够根据环境光、磁场、温度、pH值、氧化还原剂等的变化，产生相应的物理性质或者结构的变化，因而在组织工程、药物传递和缓释、生物传感器以及纳米药物中有着广泛的应用。纳米凝胶通常是指粒径在200nm以内的三维交联的聚合物网络，由具有纳米尺寸空间的水凝胶颗粒实体组成。由于其内部具有空隙，可以加载多种有效组分。相对于其他凝胶，纳米凝胶具有尺寸小、载药效率高以及响应速度快的优势，易于实现靶向给药。特别是刺激响应性纳米凝胶能随外界环境温度，溶液pH，光照，磁场，特定的化学物质以及离子强度的变化，而发生相应的膨胀或收缩，因此可以实现加载组分的智能释放。

[0003] 目前，单重或双重刺激响应纳米凝胶的研究较多，例如He L, Li D等人利用胱氨酸所含双硫键设计了一种纳米凝胶，该智能载药体系在还原剂的作用下能够溶胀并促进药物释放(He L, Li D, Wang Z, et al. Polymers, 2016, 8(2):36.)。虽然该纳米凝胶制备方法简单，但其仅对还原剂响应，因而使其应用领域受限。

[0004] 为增加靶向特性和调控手段，已有研究人员开展了多重刺激响应纳米凝胶的研究，目前主要通过以下两种方式得到多重刺激响应纳米凝胶。一种方式是利用不同刺激响应特性的单体共聚从而赋予纳米凝胶多重刺激响应特性，得到传统的多重刺激响应纳米凝胶。例如，中国专利CN106883340A公开了一种对光、pH和还原物质(DTT)响应的聚合物纳米凝胶，发明人将光响应单体甲基丙烯酸螺吡喃酯、pH响应单体丙烯酸、含双硫键的交联剂N,N’-双(丙烯酰)胱胺、引发剂过硫酸钾以及乳化剂十二烷基硫酸钠加入水中反应得到了三重响应性聚丙烯酸-共-甲基丙烯酸螺吡喃酯纳米凝胶，但是该纳米凝胶制备方法复杂，成本较高，而且残余乳化剂对人体有不良影响。中国专利CN104072694B公开的聚合物胶束同时具备了温度响应，pH响应，还原响应和光响应，发明人利用具有光响应性的聚2-硝基苄酯和具有pH和温度双重响应的聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯通过具有还原响应性的二硫键连接得到聚合物在水中自组装得到胶束，制备步骤较多，且胶束制备及载药过程使用了有机溶剂四氢呋喃。另一种方式是利用具有多重刺激响应机理的单体均聚，得到多重刺激响应纳米凝胶。利用具有多重刺激响应机理的单体均聚能够克服传统的多重刺激响应纳米凝胶的缺陷，然而这类单体非常稀缺，且由这类单体得到的多重响应聚合物，其稳定性或生物相容性大多不能令人满意。例如，聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(PDMAEMA)是一种常见的具有pH、CO2以及温度三重响应的聚合物，然而PDMAEMA在碱性水溶液中容易水解、稳定性差，使其应用范围受到制约；Wang等(A New Family of Thermo-, pH-, and CO2-Responsive Homopolymers of Poly[Oligo(ethylene glycol) (N-dialkylamino) methacrylate]s，Macromolecules, 2017, 50(12), 4686-4698)报道的pH、温度以及CO2三重响应均聚物poly[oligo(ethylene glycol)(N-dialkylamino)-methacrylate]s，其结构与PDMAEMA类似，但由于含有酯键，该聚合物的稳定性和生物相容性也欠佳。

[0005] 生物相容性是指生命体组织对非活性材料产生反应的一种性能，一般是指材料与宿主之间的相容性。手性分子在生命科学、制药以及材料科学、催化、分离等领域有着非常重要的作用。因此，寻找并利用一种兼具手性和生物相容性的多重刺激响应的单体材料聚合得到稳定的多重响应纳米凝胶，意义重大。

[0006] 综上所述，现有技术存在的主要问题有：(1)现有单重或双重刺激响应纳米凝胶，仅对一种或两种刺激响应，使其应用领域受限；(2)传统多重刺激响应纳米凝胶通常采用具有不同刺激响应特性的单体共聚得到，由于单体之间聚合活性及竞聚率的差异，导致聚合物的实际组成与理论设计值存在偏差，加之不同单体及均聚物溶解性的不同，导致制备工艺复杂，成本颇高；(3)现有利用具有多重刺激响应机理的单体均聚得到的多重响应聚合物，其稳定性、生物相容性欠佳，使其应用范围受到制约。

[0007] 聚氨基酸材料具有手性和良好的生物相容性，并且在降解过程中生成的无毒氨基酸容易被机体吸收和代谢，因此在医学、组织工程等领域具有广泛的应用。因此有必要研究制备一种聚氨基酸纳米凝胶，以解决现有技术中存在的问题。

发明内容

[0008] 为克服现有技术的不足，针对现有多重响应纳米凝胶及制备技术存在的问题，本发明的目的之一是提供一种四重刺激响应聚氨基酸纳米凝胶，本发明提供的纳米凝胶具有良好的生物相容性和手性，且在降低外界温度和pH、通入CO2气体之后粒径增大、加入还原剂后溶解为水溶性大分子，因此可用于控制负载分子的智能释放。本发明的另一个目的是提供一种四重刺激响应聚氨基酸纳米凝胶的制备方法，仅利用乙烯基氨基酸功能单体，在链转移剂和引发剂的存在下，采用水相可控自由基聚合的方法制备纳米凝胶；采用聚合诱导的自组装方法制备纳米凝胶，纳米凝胶制备及载药过程不使用有机溶剂和小分子表面活性剂，制备方法更加绿色环保。本发明的第三个目的是提供一种四重刺激响应聚氨基酸纳米凝胶的用途，本发明的纳米凝胶可用于控制负载分子的智能释放。

[0009] 为实现上述目的，本发明提供了一种四重刺激响应聚氨基酸纳米凝胶，其特征在于：所述的聚氨基酸纳米凝胶由大分子链转移剂、N,N’-双(丙烯酰)胱胺、水溶性引发剂、氨基酸单体在水中聚合而成；其中，所述的大分子链转移剂为末端含有硫代碳酸酯结构的水溶性高分子；所述的氨基酸单体为乙烯基氨基酸。

[0010] 进一步，所述的乙烯基氨基酸为下述氨基酸单体中的一种，单体A-1：N-丙烯酰-甘氨酸-L-亮氨酸-N,N-二甲氨基乙酰胺、单体A-2：N-甲基丙烯酰-甘氨酸-L-亮氨酸-N,N-二甲氨基乙酰胺、单体A-3：N-丙烯酰-甘氨酸-L-亮氨酸-N,N-二甲氨基丙酰胺、单体B-1：甲基丙烯酰-L-丙氨-N,N二乙基乙酰胺、单体B-2：甲基丙烯酰-L-丙氨-N,N二甲基丙酰胺、单体B-3：甲基丙烯酰-L-丙氨-N,N二乙基丙酰胺，其分子结构式分别为：

[0011]。

[0012] 进一步，步骤S1中，所述的纳米凝胶在降低外界温度、降低pH、通入CO2气体之后粒径增大，加入还原剂后溶解为水溶性大分子，所述还原剂优选为DL-二硫苏糖醇(DTT)。

[0013] 本发明还提供了一种四重刺激响应聚氨基酸纳米凝胶的制备方法，其步骤包括：

[0014] S1、 将大分子链转移剂、N,N’-双(丙烯酰)胱胺、水溶性引发剂、氨基酸单体按照摩尔比为1︰1～6︰0.1～0.6︰20～500的比例加入反应器中，再加去离子水使固含量为8～30 wt%；

[0015] S2、 通入惰性气体除氧，除氧时间为10～30min，然后在温度为50～80℃条件下聚合，聚合时间为1～7 h；

[0016] S3、 透析除去溶液中的杂质，冷冻干燥，得到四重刺激响应聚氨基酸纳米凝胶；

[0017] 其中，步骤S1中：所述的大分子链转移剂为末端含有硫代碳酸酯结构的水溶性高分子；所述的氨基酸单体是乙烯基氨基酸，所述的水溶性引发剂为水溶性偶氮类引发剂或过硫酸盐。

[0018] 进一步，步骤S1中：将所述的大分子链转移剂、N,N’-双(丙烯酰)胱胺、水溶性引发剂、氨基酸单体按照摩尔比为1︰2～5︰0.2～0.5︰30～400的比例加入反应器中；所述的固含量为10～25 wt%。

[0019] 进一步，步骤S2中，所述的除氧时间为15～20min，所述的温度为55～75℃，所述的聚合时间为1～6 h。

[0020] 进一步，步骤S3中，所述的透析为在蒸馏水中透析，透析时间为12 36 h；所述的冷~冻干燥的时间为36 72 h。
~

[0021] 进一步，所述的乙烯基氨基酸优选为下述单体中的一种，单体A-1：N-丙烯酰-甘氨酸-L-亮氨酸-N,N-二甲氨基乙酰胺、单体A-2：N-甲基丙烯酰-甘氨酸-L-亮氨酸-N,N-二甲氨基乙酰胺、单体A-3：N-丙烯酰-甘氨酸-L-亮氨酸-N,N-二甲氨基丙酰胺、单体B-1：甲基丙烯酰-L-丙氨-N,N二乙基乙酰胺、单体B-2：甲基丙烯酰-L-丙氨-N,N二甲基丙酰胺、单体B-3：甲基丙烯酰-L-丙氨-N,N二乙基丙酰胺。

[0022] 进一步，所述的水溶性偶氮类引发剂优选为偶氮二氰基戊酸、偶氮二异丁基脒盐酸盐中的一种；所述的过硫酸盐优选为过硫酸钾、过硫酸铵中的一种。

[0023] 进一步，所述的大分子链转移剂优选为CTA-1：聚甲基丙烯酸聚乙二醇单甲醚酯、CTA-2：聚N,N-二甲基丙烯酰胺、CTA-3：聚乙二醇单甲醚酯中的一种，其分子结构式为：

[0024] 。

[0025] 进一步，所述的大分子链转移剂CTA-1：聚甲基丙烯酸聚乙二醇单甲醚酯，其制备方法为：

[0026] 将甲基丙烯酸聚乙二醇单甲醚酯、链转移剂二硫代苯甲酸氰基异丙酯、引发剂AIBN按照摩尔比为10︰0.2︰0.01的比例加入反应器中，再加有机溶剂10 mL溶解，通氮气除氧15 min后，加热至70℃反应2 h，用石油醚沉淀得到CTA-1：聚甲基丙烯酸聚乙二醇单甲醚酯。

[0027] 进一步，所述的大分子链转移剂CTA-2：聚N,N-二甲基丙烯酰胺，其制备方法为：

[0028] 将N,N-二甲基丙烯酰胺、链转移剂4-氰基-4-[[(十二烷硫基)硫酮甲基]硫基]戊酸、引发剂AIBN按照摩尔比为10︰0.2︰0.04的比例加入反应器中，再加有机溶剂10 mL溶解，通氮气除氧15 min后，加热至65℃反应3 h，用乙醚沉淀得到CTA-2：聚N,N-二甲基丙烯酰胺。

[0029] 进一步，所述的大分子链转移剂CTA-3：聚乙二醇单甲醚酯，其制备方法为：

[0030] 将链转移剂4-氰基-4-[[(十二烷硫基)硫酮甲基]硫基]戊酸、聚乙二醇单甲醚、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐按照摩尔比为5︰2︰2.5的比例加入反应器中，再加有机溶剂10 mL溶解，氮气保护下室温反应24h；反应结束后加入相同的有机溶剂90 mL，萃取分层，取有机相依次用0.1 M HCl水溶液80 mL、饱和碳酸氢钠水溶液80 mL以及饱和食盐水80 mL洗涤；然后将有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，取滤液悬蒸除去溶剂，得到CTA-3：4-氰基-4-[[(十二烷硫基)硫酮甲基]硫基]戊酸聚乙二醇单甲醚酯。

[0031] 优选地，所述的有机溶剂为甲苯、苯、四氢呋喃、二氯甲烷、二氧六环、异丙醇、甲醇、N，N-二甲基甲酰胺，N-甲基吡咯烷酮中的一种。

[0032] 一种四重刺激响应聚氨基酸纳米凝胶的用途，其特征在于：可用于控制负载分子的智能释放。

[0033] 本发明与现有技术相比具有如下有益效果：

[0034] (1) 本发明仅采用乙烯基氨基酸单体均聚来制备纳米凝胶，聚合物化学结构明确；现有技术中采用多种单体共聚时，由于每个单体聚合活性不一样，最终有多少单体转化成聚合物，取决于两种单体的相对活性和转化率，活性高的单体先聚合，活性低的后聚合，聚合物的实际组成与设计值存在偏差，而本发明仅采用一种单体均聚，不存在这种问题；

[0035] (2) 本发明的纳米凝胶含有氨基酸片段，具有良好的生物相容性和手性等优点；

[0036] (3) 本发明采用水相聚合诱导的自组装方法制备纳米凝胶，在纳米凝胶合成及载药过程不使用有机溶剂，更绿色环保；

[0037] (4) 本发明制备工艺简单，步骤少；

[0038] (5) 该纳米凝胶在降低外界温度和pH、通入CO2气体后粒径增大，加入还原剂后溶解为水溶性大分子，可用于控制负载分子的智能释放，在药物控制释放领域具有很高的应用价值。

附图说明

[0039] 图1为本发明一种四重刺激响应聚氨基酸纳米凝胶制备方法示意图。

[0040] 图2为由本发明实施例1所得大分子链转移剂CTA-1的氢核磁谱图。

[0041] 图3为由本发明实施例2所得大分子链转移剂CTA-2的氢核磁谱图。

[0042] 图4为由本发明实施例3所得大分子链转移剂CTA-3的氢核磁谱图。

[0043] 图5为由本发明实施例2所得纳米凝胶的透射电镜照片。

[0044] 图6为由本发明实施例2所得纳米凝胶的动态光散射图。

[0045] 图7为由本发明实施例2所得纳米凝胶粒径随温度(a)、pH值(b)、CO2气体(c)及DTT(d)的变化图。

[0046] 图8为由本发明实施例2所得纳米凝胶在不同条件下罗丹明b的释放量曲线。

具体实施方式

[0047] 下面结合附图对本发明的技术方案进行详细说明，但本发明的实施并不局限于此。

[0048] 实施例1：

[0049] 称取甲基丙烯酸聚乙二醇单甲醚酯9.5 g(相当于10 mmol)，链转移剂二硫代苯甲酸氰基异丙酯44.2 mg(相当于0.2 mmol)，引发剂AIBN1.64 mg(相当于0.01 mmol)置 50 ml 单口瓶中，加甲苯10 mL溶解，通氮气除氧15 min后加热至70℃反应2 h，用石油醚沉淀，得到聚甲基丙烯酸聚乙二醇单甲醚酯(大分子链转移剂CTA-1) 4.7 g。所得聚甲基丙烯酸聚乙二醇单甲醚酯的重均分子量Mw= 24940 g/mol，数均分子量Mn= 23750 g/mol，聚合度n=25。

[0050] 称取N-丙烯酰-甘氨酸-L-亮氨酸-N,N-二甲氨基乙酰胺(单体A-1) 3.8 g(相当于12 mmol)，聚甲基丙烯酸聚乙二醇单甲醚酯(大分子链转移剂CTA-1) 0.96 g (相当于0.04 mmol), 偶氮二氰基戊酸2.8 mg (相当于0.01 mmol)，N,N’-双(丙烯酰)胱胺32 mg(相当于
0.12 mmol)置 100 ml 单口瓶中，加去离子水40 mL，通氩气除氧15 min后加热至60℃反应
4 h，去离子水透析24h，冷冻干燥48 h，得到四重刺激响应聚氨基酸纳米凝胶。

[0051] 由本发明实施例1所得大分子链转移剂CTA-1的氢核磁谱图，见图2。

[0052]  实施例2：

[0053] 1. 四重刺激响应聚氨基酸纳米凝胶的制备

[0054] 称取N,N-二甲基丙烯酰胺9.9 g(相当于100 mmol)， 4-氰基-4-[[(十二烷硫基)硫酮甲基]硫基]戊酸808 mg (相当于2 mmol), AIBN 66 mg (相当于0.4 mmol)置 50 ml 单口瓶中，加四氢呋喃10 mL溶解，通氮气除氧15 min后加热至65℃反应3 h，用乙醚沉淀，得到聚N,N-二甲基丙烯酰胺(大分子链转移剂CTA-2)7.8 g。所得聚N,N-二甲基丙烯酰胺的重均分子量Mw= 4320 g/mol，数均分子量Mn= 4000 g/mol，聚合度n=39。

[0055] 称取甲基丙烯酰-L-丙氨-N,N二乙基乙酰胺(单体B-1) 3.83 g(相当于15 mmol)，聚N,N-二甲基丙烯酰胺(大分子链转移剂CTA-2)1.2 g (相当于0.3 mmol), 偶氮二氰基戊酸28 mg (相当于0.1 mmol)，N,N’-双(丙烯酰)胱胺200 mg(相当于0.75mmol)置 50 ml 单口瓶中，加去离子水21 mL，通氮气除氧15 min后加热至70℃反应2 h，去离子水透析16 h，冷冻干燥48 h，得到四重刺激响应聚氨基酸纳米凝胶。

[0056] 2. 载药及释放实验：

[0057] 2.1 pH诱导的客体分子释放

[0058] 将50 mg 罗丹明b（RhB）、1.0 g 由实施例2所得纳米凝胶以及99 g去离子水混合，在室温下搅拌24 h后，将其分为两等份分别在1000 mL水中透析24 h。测试透析袋外水溶液在554 nm波长下的紫外吸收 (RhB分子在水溶液中的特征吸收峰) 来确定未负载入纳米凝胶的RhB的量。用加入的RhB质量减去未负载入纳米凝胶的RhB质量可以得到其负载量（24%）。然后再将两个透析袋分别放入100 mL水中（室温，t=25℃）并在pH=9.5以及pH=4.0的条件下进行释放实验。间隔4h取出2 mL透析袋外水溶液测试其在554 nm波长的吸收并补入2 mL相同pH值的水溶液以保证透析袋外水溶液体积恒定。测定取出溶液中RhB的浓度，计算药物释放率。实验结果如图8所示：在pH=9.5时，24 h时药物的累积释放率只有26.2 %（见图
8-e）；而pH降低至4.0时RhB在24h的释放率达到了72.8 %（见附图8-b）。这是因为聚（甲基丙烯酰-L-丙氨-N,N二乙基乙酰胺）侧链上叔胺在酸性水溶液里质子化，RhB在酸性条件下也带正电，静电斥力导致释放率增加。

[0059] 2.2温度诱导的客体分子释放

[0060] 将50 mg 罗丹明b（RhB）、1.0 g 由实施例2所得纳米凝胶以及99 g去离子水混合，在室温下搅拌24 h后，将其分为两等份分别在1000 mL水中透析24 h。测试透析袋外水溶液在554 nm波长下的紫外吸收 (RhB分子在水溶液中的特征吸收峰) 来确定未负载入纳米凝胶的RhB的量。用加入的RhB质量减去未负载入纳米凝胶的RhB质量可以得到其负载量（24%）。然后再将两个透析袋分别放入100 mL且pH=9.5的水中，在t= 25ºC（低于相变温度）以及t= 60℃（高于相变温度）下进行释放实验。间隔4h取出2 mL透析袋外水溶液测试其在554 nm波长的吸收并补入2 mL pH=9.5的水溶液以保证透析袋外水溶液体积恒定。测定取出溶液中RhB的浓度，计算药物释放率。实验结果如图8所示：可以看出，在温度为25℃，累积释放率为26.2 %（见图8-e）；而温度为60℃时，累积释放率为42.8%（见图8-d）。这是因为温度升高到相变温度以上时，聚（甲基丙烯酰-L-丙氨-N,N二乙基乙酰胺）由亲水变为疏水导致纳米凝胶粒径急剧收缩（见附图7-a），包裹在凝胶内的RhB被挤出，因此释放率增大。

[0061] 2.3 CO2诱导的客体分子释放

[0062] 在实施例2的“2.2温度诱导的客体分子释放”实验中所述pH=9.5、t=25℃的纳米凝胶包RhB的水溶液中，通入CO2气体5min，放置24 h时罗丹明b的累积释放率增加至63.6%（见图8-c），这是因为通入的CO2气体后溶液变成酸性，与聚（甲基丙烯酰-L-丙氨-N,N二乙基乙酰胺）侧链的叔胺反应质子化，RhB在酸性条件下也带正电，静电斥力导致释放率增加。

[0063] 2.4 DTT诱导的客体分子释放

[0064] 在实施例2的“2.2温度诱导的客体分子释放”实验中所述pH=9.5、t=25℃的纳米凝胶包覆RhB水溶液中，加入10 mM DTT，放置24 h时RhB的累积释放率增加至87.8%（见附图8-a）。这是因为DTT是还原性物质，它可以破坏二硫键使纳米凝胶分解为线性高分子（见附图7-d），使RhB释放率增大。

[0065] 由本发明实施例2所得大分子链转移剂CTA-2的氢核磁谱图，见图3。

[0066] 由本发明实施例2所得纳米凝胶的透射电镜照片，见图5。

[0067] 由本发明实施例2所得纳米凝胶的动态光散射图，见图6。

[0068] 由本发明实施例2所得纳米凝胶粒径随温度(a)、pH值(b)、CO2气体(c)及DTT(d)的变化图，见图7。

[0069] 由本发明实施例2所得纳米凝胶在不同条件下罗丹明b的释放量曲线，见图8。

[0070] 实施例3：

[0071] 称取4-氰基-4-[[(十二烷硫基)硫酮甲基]硫基]戊酸 2.0 g(相当于5 mmol), 聚乙二醇单甲醚(平均分子量2000 g/mol)4.0 g (相当于2 mmol)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐0.48 g (相当于2.5 mmol)置 50 ml 单口瓶中，加无水二氯甲烷10 mL溶解，氮气保护下室温反应24h。反应结束后，加二氯甲烷90 mL，萃取分层，取有机相依次用0.1 M HCl水溶液、饱和碳酸氢钠水溶液以及饱和食盐水各80 mL洗涤。用无水硫酸镁干燥有机相，过滤，取滤液悬蒸除去有机溶剂，得到4-氰基-4-[[(十二烷硫基)硫酮甲基]硫基]戊酸聚乙二醇单甲醚酯(大分子链转移剂CTA-3)5.6 g。

[0072] 称取N-甲基丙烯酰-甘氨酸-L-亮氨酸-N,N-二甲氨基乙酰胺(单体A-2)4.83 g(相当于15 mmol)，4-氰基-4-[[(十二烷硫基)硫酮甲基]硫基]戊酸聚乙二醇单甲醚酯(大分子链转移剂CTA-3) 0.3 g  (相当于0.15 mmol), 偶氮二氰基戊酸12 mg (相当于0.04 mmol)，N,N’-双(丙烯酰)胱胺106 mg(相当于0.4 mmol)置 50 ml 单口瓶中，加去离子水30 mL，通氮气除氧15 min后加热至65℃反应3 h，去离子水透析20 h，冷冻干燥70 h，得到四重刺激响应聚氨基酸纳米凝胶。

[0073] 由本发明实施例3所得大分子链转移剂CTA-3的氢核磁谱图，见图4。

[0074] 以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非用以限制本发明的权利范围。采用本领域已有技术，改变单体与链转移剂的摩尔比可以方便调控聚合物的分子量及分子量分布。任何以本申请专利范围所涵盖的权利范围实施的技术方案，或者任何熟悉本领域的技术人员，利用上述揭示的方法内容做出许多可能的变动和修饰的方案，均属于本发明的保护范围。