人体基因组DNA样本的常温保存方法

摘要

一种人体基因组DNA样本的常温保存方法，将制备提取的人体基因组DNA溶液与处于融化状态的低熔点琼脂糖溶液混匀，经干燥后制备得到可常温保存的人体基因组DNA粉末状样本，将该粉末状样本装入容器中并封口，再置于避光容器或环境中。本发明适用于人体基组DNA样本的常温保存。

权利要求

1.人体基因组DNA样本的常温保存方法，其特征在于，包括将人体基因组DNA溶液与处于融化状态的低熔点琼脂糖溶液混匀，经干燥后制备得到可常温保存的人体基因组DNA粉末状样本，将该粉末状样本装入容器中并封口；

所述人体基因组DNA溶液为人体基因组溶于双蒸水或TE缓冲液形成的溶液；

所述低熔点琼脂糖溶液的配置方法为：将低熔点琼脂糖用双蒸水或TE缓冲液悬浮，加热至65℃使低熔点琼脂糖熔化成为质量分数为0.8-2%的低熔点琼脂糖溶液；

所述干燥为烘干、真空干燥；

所述的粉末状样本装入容器中并封口是指将粉末状样本装入容器经除氧充氮后封口。

2.如权利要求1所述的常温保存方法，其特征在于，将基因组DNA溶液直接分散在处于融化状态的低熔点琼脂糖溶液中。

3.如权利要求1所述的常温保存方法，其特征在于，将该粉末状样本装入容器中并封口，再置于避光容器或环境中。

说明书

人体基因组DNA样本的常温保存方法

技术领域

[0001] 本发明涉及基因样本的常温保存方法，特别是人体基因组DNA样本的常温保存方法。

背景技术

[0002] 人体基因组DNA是组成人体基因组的所有DNA，是指能从一代传递给下一代的全部遗传信息。人体基因组DNA蕴藏人体全部的遗传信息，是遗传和物种延续的物质基础，它使后代出现与亲代相似的性状。保存人体基因组DNA样本即保存人体的全部生命遗传信息。随着基因组测序等分子生物学技术的不断进步，科学家已能对基因组DNA的遗传信息和生命密码进行分析和解读，人体基因组DNA样本已被并将被更广泛地应用于各种基因克隆、疾病诊断、用药指导、个体识别、亲权鉴定、遗传病解析、基因家谱构建及保存等。

[0003] 一种DNA分子长期保存且可视化的保存方法及其装置（申请号200810017680.2）所用方法存在一些不足，如：（1）DNA分子与EB等核酸染料结合，而EB等染料往往存在致癌等生物毒性；（2）需在紫外线下对目的DNA分子进行割胶，由于紫外线会引起DNA分子的损伤，能诱导胸腺嘧啶二聚体的形成和DNA链的交联，导致DNA分子信息的失真，失去DNA分子保存的价值和意义；（3）需要通过电泳对DNA分子进行分离，电泳过程潜在会对DNA分子产生损伤。为保持人体基因组DNA基因结构的完整性、理化性质及生物学活性的稳定性，国内外开展基因样本保存服务的公司或机构通常将制备得到的基因组DNA样本存贮在超低温条件下，避免物理、化学和生物因素对人体基因组DNA样本产生不利影响。然而，这种超低温保存策略也带来了诸多弊端，如费用甚为昂贵、需要专业设备、个人难以实施等问题。

发明内容

[0004] 本发明要解决常规人体基因组DNA样本保存过程中存在的实施条件苛刻、费用昂贵、需要专业设备、需定点储存、个人难以保存等问题，为此而提供本发明的人体基因组DNA样本的常温保存方法，本方法操作比较简单，费用省，样本保存简便，且能在室温下长期保存。

[0005] 本发明所述人体基因组DNA样本的常温保存方法，包括将人体基因组DNA溶液与处于融化状态的低熔点琼脂糖溶液混匀，经干燥后制备得到可常温保存的人体基因组DNA粉末状样本，将该粉末状样本装入容器中并封口，再置于避光容器或环境中。

[0006] 将所述的粉末状DNA样本装入容器并封口可以是指将粉末状DNA样本装入玻璃瓶经充氮除氧后封口，以更有利于人类基因组DNA样本在常温环境下的长期保存。

[0007] 所述的低熔点琼脂糖溶液是将低熔点琼脂糖悬浮在水或TE等缓冲液中，由于低熔点琼脂糖的熔点不高于65℃，因此，在不高于65℃时即可形成低熔点琼脂糖溶液。融化的低熔点琼脂糖溶液其凝胶点约26-30℃，在不影响人体基因组DNA结构和生物活性的温度下，将人体基因组DNA样本加至低熔点琼脂糖溶液中，充分混匀使DNA样本均匀分散在低熔点琼脂糖中。

[0008] 本发明所述的干燥可以是室温空气中自然干燥或低温真空干燥。

[0009] 在低熔点琼脂糖粉末中载有基因组DNA，只需复水并将之恢复至溶液状态即可释放基因组DNA，回收基因组DNA后可直接用于基因分析等分子生物学检测。

[0010] 本发明由于将DNA溶液与处于融化状态的低熔点琼脂糖溶液混匀，使DNA被包裹进低熔点琼脂糖中，经干燥后制得荷载DNA的粉末状样本，故本发明制作简便，费用低，所制样本保存方便，并容易对基因组DNA样本作后续分析。低熔点琼脂糖是安全、稳定的惰性成份，亦是DNA的良好载体，经干燥后形成的粉末状形态具有多种优点，如（1）基因组DNA样本包裹在低熔点琼脂糖粉末中，避免DNA样本之间的直接碰撞，保护DNA样本结构的稳定性和完整性。（2）粉末状形态可大幅降低粉末间的剧烈碰撞，保障DNA样本结构的稳定性和完整性。（3）可对人体基因组DNA样本进行按需求分装，按需取用。（4）从低熔点琼脂糖粉末中重新提取人体基因组DNA时，只需复水并将之恢复至溶液状态即可释放基因组DNA。

[0011] 本发明由于将所述的包含DNA的粉末状样本装入容器并封口，样本封存较为方便，且可在室温下长期保存，特别是容器除氧充氮后封口，对DNA在室温下的长期保存更为有利。

具体实施方式

[0012] 实施例1.人体口腔粘膜上皮细胞制备基因组DNA样本及封存

[0013] 1、人体口腔粘膜上皮细胞的采集

[0014] 取样前先用清水漱口数次，再用口腔拭子在口腔内壁反复刮擦多次，使得口腔拭子上携带有口腔粘膜上皮细胞。

[0015] 2、裂解细胞

[0016] 将携带有口腔粘膜上皮细胞的材料剪下，置于Eppendorf（EP）管 中，往EP管中加入400μL的细胞裂解液, 充分混匀至无明显的细胞团。细胞裂解液配方为：10 mmol/L Tris-HCl (pH8.0)，30 mmol/L EDTA (pH8.0)，0.5% SDS，RNase A (20 μg/mL)。

[0017] 3、离液剂处理释放基因组DNA

[0018] 往EP管中加入终浓度为1 mol/L的离液剂溴酸钠，充分混匀。

[0019] 4、去除蛋白质

[0020] 向步骤(3)的EP管中加入等体积苯酚/氯仿/异戊醇 (25:24:1)，振荡混匀，离心至溶液分层，将上层液体转移至另一洁净的EP管中。可重复本步骤一次，并用氯仿抽提一次上清，将含基因组DNA的上清液转移至另一洁净EP管中。

[0021] 5、沉淀DNA

[0022] 向步骤(4)的EP管中加入2.5倍体积的无水乙醇，离心收集基因组DNA，往沉淀中加入1 mL的70％乙醇洗涤DNA，去上清，敞口晾干基因组，即为沉淀的人体基因组DNA样本。

[0023] 6、DNA的溶解

[0024] 向步骤(5)的EP管中加入100 µL 的双蒸水或TE缓冲液，溶解基因组DNA沉淀。利用光密度测定法测定基因组DNA的浓度，利用琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性。

[0025] 7、低熔点琼脂糖溶液的配置

[0026] 将低熔点琼脂糖用双蒸水或TE缓冲液悬浮，加热至65℃左右使低熔点琼脂糖熔化成为质量分数为0.8-2%的琼脂糖溶液。

[0027] 8、基因组DNA样品分散在低熔点琼脂糖溶液中

[0028] 将步骤（6）得到的人体基因组DNA样本加到步骤（7）制备的，还处于熔化状态的低熔点琼脂糖溶液中，颠倒混匀，静置后形成凝胶，将凝胶干燥、真空干燥或低温真空干燥后得到白色粉末状固型物，即为可常温保存的人体基因组DNA样本。

[0029] 9、封存

[0030] 将步骤（8）所制样本转移至玻璃容器中，充氮去氧，在一个大气压下的氮气环境下进行封口，再置于避光容器或环境中。

[0031] 实施例2. 用人体血液制备基因组DNA样本及其封存

[0032] 1、人体血液样品采集

[0033] 采集抗凝血0.5-2ml或制备血斑。此血样在-80℃冰冻保存，至少可维持2年而不 变质。

[0034] 2、裂解红细胞

[0035] 往200 μL的抗凝血中加入400 μL的红细胞裂解液，混匀后 2000g离心10 min，弃上清。若仍有较多的红细胞残留，也可重复裂解一次。

[0036] 后续操作与实施例1的步骤（2）-（9）一致。

[0037] 实施例3.用人体头发毛囊制备基因组DNA样本及其封存

[0038] 用清洁的镊子拔取头发3根，用蒸馏水清洗头发及根部毛囊的附着物，然后从头发根部剪取1cm，将发根毛囊部分浸入含有 400μl细胞裂解液的离心管中，细胞裂解充分后去除毛发及其它杂质，后续操作与实施例1的步骤（2）-（9）一致。

[0039] 实施例4.用唾液制备基因组DNA样本及其封存

[0040] 将唾液2000 g离心10 min，弃上清，用1 mL的生理盐水悬浮口腔 粘膜上皮细胞，再2000 g离心10 min，弃上清，沉淀即为口腔粘膜上皮细胞。后续操作与实施例1的步骤（2）-（9）一致。