四氢喹喔啉衍生物及在检测C-kit G-四链体DNA和抑制胃肠道间质瘤中的应用转让专利
申请号 : CN201711256106.8
文献号 : CN108017652B
文献日 : 2020-06-12
发明人 : 郭媛 , 王少静 , 李锦
申请人 : 西北大学
摘要 :
四氢喹喔啉衍生物及在检测C‑kit G‑四链体DNA和抑制胃肠道间质瘤中的应用。本发明公开了结构式（I）所示化合物，其中，R’为氢或C1～C18的烷基，R’’为C1～C18的烷基。本发明化合物可实现比率型检测G4 DNA。比率型检测不受底物和探针浓度、外部环境和仪器条件变化等影响，可有效避免检测时的背景干扰和假阳性，从而实现对G4 DNA精准检测。化合物（I）具有良好的稳定C‑kit G4 DNA作用，可在基因水平靶向性抑制胃肠道间质瘤细胞株，有望发展成为有效的胃肠道间质瘤的预防和治疗药物。。
权利要求 :
1.结构式（I）所示化合物，
其中，R’为C1～C6的烷基，R’’为C1～C6的烷基。
2.权利要求1所示化合物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：化合物（A）与化合物（B）发生缩合反应，得到化合物（I），其中，R’为C1～C6的烷基，R’’为C1～C6的烷基。
3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于：步骤中所述的反应温度为60～115 °C，使用醇类、芳香烃类作溶剂，在有机碱类催化剂条件下，通过缩合反应得到荧光探针化合物（I）。
4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于：所述的醇类选自甲醇、乙醇、异丙醇；芳香烃类选自甲苯、苯；有机碱选自六氢吡啶、三乙胺、吡啶。
5.权利要求1所示化合物在制备检测 G-四链体 DNA探针中的应用。
6.权利要求1所示化合物在制备预防和/或抑制胃肠道间质瘤药物中的应用。
说明书 :
四氢喹喔啉衍生物及在检测C-kit G-四链体DNA和抑制胃肠
道间质瘤中的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及四氢喹喔啉衍生物及在检测C-kitG-四链体DNA和抑制胃肠道间质瘤中的应用，属于化学生物学传感器技术领域。
背景技术
[0002] G-四链体(G4) DNA是由富含串联重复鸟嘌呤（G）的DNA折叠形成的高级结构。2013年，剑桥大学科学家已证实G4 DNA可稳定存在于人体活细胞中（Biffi G, Tannahill D, McCafferty J, et al. Nature Chemistry, 2013, 5, 182）。2016年，该研究团队又通过对癌变前的人类细胞系进行研究，检测到了差不多一万个G4，最终得出G4主要位于调控基因开关的DNA区域，特别是与癌症有关基因的结论，因此，G4 DNA已成为最新的精准抗癌靶标（Hänsel-Hertsch R, Beraldi D, Lensing S V, et al. Nature Genetics, 2016, 48, 1267）。
[0003] C-kit基因位于人染色体4q12-13，属于原癌基因。胃肠道间质瘤（GIST）是消化道最常见的间叶源性肿瘤。绝大部分的GIST均表达C-kit基因编码的Kit蛋白（CD117）。在分子层面上，大部分的GIST均存在C-kit基因突变，从而导致Kit蛋白的活化不需要配体SCF参与就能刺激肿瘤细胞的持续增殖和抗凋亡信号的失控。GIST中C-kit基因突变率约为90%，且突变形式多样。因此准确检测C-kit相关基因，对胃肠道间质瘤的早期精准筛查和治疗具有非常重要的意义。
发明内容
[0004] 本发明的第一个目的是提供一种新型螺吡喃衍生物及其制备方法。
[0005] 本发明的第二个目的是将上述螺吡喃衍生物作为荧光探针应用于G4 DNA的比率型检测；
[0006] 本发明的第三个目的是将上述螺吡喃衍生物用于在基因水平上抑制胃肠道间质瘤的应用。
[0007] 本发明实现过程如下：结构式（I）所示化合物，
[0008]
[0009] 其中，R’为氢或C1～C18的烷基，R’’为C1～C18的烷基；R’ 优选为氢或C1～C6的烷基，R’’ 优选为C1～C6的烷基。
[0010] 结构式（I）所示化合物的制备方法：通过化合物（A）与化合物（B）发生缩合反应，得到化合物（I），
[0011] 。
[0012] 上述步骤中所述的反应温度为60～115 °C，使用醇类、芳香烃类作溶剂，在有机碱类催化剂条件下，通过缩合反应得到荧光探针化合物（I），其中R’为氢、C1-18的烷基，R’’为C1-18的烷基。
[0013] 上述反应中，所述的醇类选自甲醇、乙醇、异丙醇；芳香烃类选自甲苯、苯；有机碱选自六氢吡啶、三乙胺、吡啶。
[0014] 本发明所示化合物可应用在检测 G-四链体 DNA，还可应用于在制备预防和/或抑制胃肠道间质瘤。
[0015] 本发明开发了一种可比率型检测C-kit G4 DNA（ C-kit G4 DNA效果最明显）的荧光探针化合物（I），并通过细胞增殖实验发现化合物（I）在不影响正常细胞的前提下，具有明显抑制胃肠道间质瘤细胞株的作用。
[0016] 本发明的优点：
[0017] （1）开发了可实现比率型检测 G4 DNA，尤其是C-kit G4 DNA，的四氢喹喔啉类荧光探针化合物（I）。比率型检测不受底物和探针浓度、外部环境和仪器条件变化等影响，可有效避免检测时的背景干扰和假阳性，从而实现对G4 DNA精准检测；
[0018] （2）化合物（I）具有良好的稳定C-kit G4 DNA作用，可在基因水平靶向性抑制胃肠道间质瘤细胞株，有望发展成为有效的胃肠道间质瘤的预防和治疗药物。
附图说明
[0019] 图1为荧光探针TANG-1在缓冲溶液中对C-kit G4 DNA不同浓度的荧光光谱；
[0020] 图2为荧光探针TANG-1在缓冲溶液中对C-kit G4 DNA不同浓度的工作曲线图；
[0021] 图3为荧光探针TANG-1在缓冲溶液中对G4 DNA、单链DNA和双链DNA的选择性柱状图；
[0022] 图4为荧光探针TANG-1在缓冲溶液中对C-kit G4 DNA不同浓度的紫外光谱；
[0023] 图5为荧光探针TANG-1在缓冲溶液中C-kit G4 DNA不同浓度的圆二色谱；
[0024] 图6为荧光探针TANG-1对CHO、GIST-48B和GIST-T1细胞体外增殖抑制实验。
具体实施方式
[0025] 下面实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所使用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0026] 实施例1荧光探针TANG-1的制备
[0027]
[0028] 在干燥的25 mL圆底烧瓶中，加入1,4-二乙基-6-甲酰基-7-羟基-1,2,3,4-四氢喹喔啉（0.0776 g, 0.33 mmol），1, 2, 3, 3-四甲基-3H-吲哚碘盐（0.0993 g, 0.33 mmol），50 μL哌啶和10 mL乙醇。加热回流2 h。冷却，旋干，溶剂，柱色谱分离，得到0.0451 g蓝黑色固体，即为荧光探针TANG-1，产率为70%。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 8.54 (d, J = 14.4 Hz, 1H), 7.33 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 7.20 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 7.03 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 6.88 (d, J = 14.4 Hz, 1H), 6.43 (s, 1H), 6.16 (d, J = 14.5 Hz, 1H),
3.57 (d, J = 8.3 Hz, 8H), 3.33 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 1.66 (s, 6H), 1.25 (t, J = 4.8 Hz, 6H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 173.2, 164.8, 150.6, 143.5, 142.9,
140.8, 131.1, 128.5, 124.7, 122.4, 116.2, 109.7, 103.4, 96.7, 96.5, 49.2,
48.5, 47.6, 45.2, 44.4, 29.8, 28.4, 11.3, 10.1, 1.1; HRMS (ESI) calcd. for C25H33N3O (M+H)+: 390.2540, Found: 390.2536; FT-IR (KBr, cm-1): 2927, 1719,
1609, 1571, 1505, 1265, 925, 834, 784, 756, 685, 481.
3.57 (d, J = 8.3 Hz, 8H), 3.33 (d, J = 6.9 Hz, 3H), 1.66 (s, 6H), 1.25 (t, J = 4.8 Hz, 6H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ: 173.2, 164.8, 150.6, 143.5, 142.9,
140.8, 131.1, 128.5, 124.7, 122.4, 116.2, 109.7, 103.4, 96.7, 96.5, 49.2,
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1609, 1571, 1505, 1265, 925, 834, 784, 756, 685, 481.
[0029] 荧光探针TANG-1对C-kit G4 DNA不同浓度的荧光光谱测试：在5 mL的比色管中加-3入50 μL 10 M的TANG-1母液，1 mL Tris-HCl缓冲溶液（pH = 7.6, 20 mM KCl），再用超纯水稀释至5 mL，即可得10-5 M的TANG-1的溶液。取250 μL 10-5 M的TANG-1加入微量比色皿中，向其中分别加入体积为0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20,
25 μL的10-3 M C-kit G4 DNA溶液，测定各组的荧光光谱，如图1所示。由图1可知，随着C-kit G4 DNA浓度增大，TANG-1在长波长570 nm处的荧光强度逐渐增强，说明TANG-1在C-kit G4 DNA的作用下发生了开环。
25 μL的10-3 M C-kit G4 DNA溶液，测定各组的荧光光谱，如图1所示。由图1可知，随着C-kit G4 DNA浓度增大，TANG-1在长波长570 nm处的荧光强度逐渐增强，说明TANG-1在C-kit G4 DNA的作用下发生了开环。
[0030] 荧光探针TANG-1对C-kit G4 DNA不同浓度的工作曲线测定：由TANG-1对C-kit G4 DNA不同浓度的荧光光谱得到在570 nm处荧光响应强度随C-kit G4 DNA浓度工作曲线图，如图2所示。由图2可知，当C-kit G4 DNA的浓度在0-2.8 μM的范围内时，570 nm处的荧光强度与C-kit G4 DNA浓度呈现良好的线性关系，线性方程为y = 32.280 x - 4.326，相关系数为0.9870。
[0031] 荧光探针TANG-1在G4 DNA、单链DNA和双链DNA中选择性荧光光谱测试：在5 mL的比色管中加入50 μL 10-3 M的TANG-1母液，1 mL Tris-HCl缓冲溶液（pH = 7.6, 20 mM KCl），再用超纯水稀释至5 mL，即可得浓度为10-5 M的TANG-1溶液。取250 μL 10-5 M的TANG-1加入微量比色皿中，再向其中分别加入25 μL的10-5 M G4 DNA (C-myc DNA、C-kit DNA、bcl2、22AG和HIV-PRO-1)、单链DNA (ss-DNA1、ss-DNA2、ss-DNA3和ss-DNA4)、双链DNA (ds-DNA1、ds-DNA2和ct-DNA)，测定各组的荧光光谱，如图3所示。由图3可知，TANG-1与G4 DNA作用后，在570 nm处均出现发射峰，荧光强度均有较明显地增加，而与单、双链DNA作用后并无明显变化。当加入C-kit G4 DNA时，该波长处的强度变化最大，说明TANG-1对C-kit G4 DNA的检测具有良好的选择性。
[0032] 荧光探针TANG-1对C-kit G4 DNA不同浓度的紫外光谱测试：在5 mL的比色管中加入50 μL 10-3 M的TANG-1母液，1 mL Tris-HCl缓冲溶液（pH = 7.6, 20 mM KCl），再用超纯水稀释至5 mL，即可得浓度为10-5 M的TANG-1溶液。取250 μL 10-5 M的TANG-1加入微量比色皿中，向其中依次加入体积为0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 μL的10-3 M C-kit G4 DNA溶液，测定相应的紫外-可见吸收光谱，如图4所示。由图4可知461 nm和578 nm处有吸收峰，随着C-kit G4 DNA浓度的增加，TANG-1在578 nm处的吸收峰出现了明显的减色效应，并且红移了8 nm。
[0033] 荧光探针TANG-1与C-kit G4 DNA的圆二色谱测试：配制总体积为400 μL的C-kit G4 DNA和TANG-1溶液，其中固定待测样品中C-kit G4 DNA的终浓度为5 μM，用TANG-1进行滴定测试，即TANG-1的浓度分别为0、5、10、15 μM，如图5所示。由图5可知，TANG-1在该条件下不改变C-kit G4 DNA的平行结构，当TANG-1的浓度逐渐增加时，210 nm和265 nm处的峰越来越正，而240 nm处的峰越来越负。
[0034] 荧光探针TANG-1对CHO细胞（中国仓鼠卵巢正常细胞）、GIST-48B细胞（人胃肠道间质瘤细胞48B）和GIST-T1细胞（人胃肠道间质瘤细胞T1）体外增殖抑制实验：细胞株CHO采用DEME + 10%胎牛血清进行培养，细胞株GIST-48B和GIST-T1采用89% McCoy’s 5a + 10%FBS + 1%双抗进行培养，细胞复苏后培养两代，待测试。待测化合物溶于DMSO中配成10 mM的母液，按照3倍稀释制备成5 mM、1.667 mM、0.556 mM、0.185 mM、0.062 mM、0.021 mM、0.007 mM储存于24×16的384孔透明药板(Corning, USA)，同时采用同等体积的DMSO溶剂作为空白对照，共8个浓度梯度，药板-20°C真空保存。取对数生长期细胞(1000-1500个/孔)接种于24×16的384孔白色不透明细胞培养板(Corning 3570, NY, USA)，每孔体积为50 μL，在
37°C含5% CO2 培养箱中培养过夜。采用JANUS@ automated workstation给细胞板加药(0.1 μL/孔)，化合物最终浓度为10 μM、3.3 μM、1.1 μM、0.37 μM、0.12 μM、0.04 μM、0.014 μM、0 μM，在培养箱中孵育72小时后，加入10 μL CellTiter-Glo细胞增殖荧光检测试剂，静置10分钟，Envision Plate-Reader 读数。细胞体外增殖抑制实验结果如图6所示，可以明显看出荧光探针TANG- 1对正常细胞没有影响（GI50: 12.38，该值大于10即没有抑制效果），对GIST-T1细胞有明显的抑制效果（GI50: 5.976，小于10并且数值越小抑制效果越明显）。
37°C含5% CO2 培养箱中培养过夜。采用JANUS@ automated workstation给细胞板加药(0.1 μL/孔)，化合物最终浓度为10 μM、3.3 μM、1.1 μM、0.37 μM、0.12 μM、0.04 μM、0.014 μM、0 μM，在培养箱中孵育72小时后，加入10 μL CellTiter-Glo细胞增殖荧光检测试剂，静置10分钟，Envision Plate-Reader 读数。细胞体外增殖抑制实验结果如图6所示，可以明显看出荧光探针TANG- 1对正常细胞没有影响（GI50: 12.38，该值大于10即没有抑制效果），对GIST-T1细胞有明显的抑制效果（GI50: 5.976，小于10并且数值越小抑制效果越明显）。
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