喜树碱衍生物及其在制备抗肿瘤药物中的应用

摘要

本发明公开了喜树碱衍生物及其在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明的喜树碱衍生物在抑制胃癌、肝癌、乳腺癌和神经母细胞瘤表现出优良的体外生物活性，在小鼠体内肝癌生物活性测试中，表现得比市场用药拓扑替康疗效更好，毒性也低于拓扑替康，而且水溶性比拓扑替康更好。以上数据和分析证实了制备的喜树碱/拓扑替康类衍生物相较于上市的拓扑替康，降低了毒性，提高了生物活性，因此，本发明的喜树碱衍生物在作为一类低毒、高效的候选药应用具有广泛前景。

权利要求

1.喜树碱衍生物，其化学结构式如下：

或其可形成的药学上可接受的盐。

2.根据权利要求1所述的喜树碱衍生物，其特征在于：所述喜树碱衍生物药学上可接受的盐为其钠、钾、钙、铁、锌盐。

3.喜树碱衍生物在制备治疗肿瘤药物中的应用，其特征在于：喜树碱衍生物如权利要求1或2所述。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：肿瘤选自胃癌、肝癌、乳腺癌、神经母细胞瘤。

5.一种治疗肿瘤的组合物，由活性成分和药学上可接受的载体组成，其特征在于：活性成分为权利要求1或2所述的喜树碱衍生物中的至少一种。

6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于：肿瘤选自胃癌、肝癌、乳腺癌、神经母细胞瘤。

说明书

喜树碱衍生物及其在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种新型的喜树碱衍生物及其在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

[0002] 癌症是目前人类健康的头号杀手。2010年卫生部公布的统计数据显示，恶性肿瘤已成为中国人的首要死因，每年死于肿瘤的患者超过100万。而据世界卫生组织(WHO)统计，全世界平均每年死于恶性肿瘤的者近70万，新发病例约870万例，而且每年还在不断增长，死亡率居第二位，仅次于心脑血管疾病。因此，癌症的治疗刻不容缓。

[0003] 喜树碱(Camptothecin，CPT)是1966年从珙桐科植物喜树中提取的一种细胞毒性生物碱，其结构式如下：

[0004]

[0005] 喜树碱属于色氨酸-萜烯类生物碱，经肿瘤实验证明这种色氨酸-萜烯类生物碱具有明显的抗肿瘤活性，尤其对消化道肿瘤、白血病、膀胱癌等活性更强，但它易引起骨髓抑制、呕吐和血尿等副作用，且其不溶于水又难溶于脂，不便于制成适宜的剂型，进一步限制了它的应用。直到1985年的研究证实，CPT是拓扑异构酶Ⅰ的特异性抑制剂，使其又成为抗肿瘤药物研究的热点。

[0006] 目前，针对拓扑异构酶I(Topo I)开发的小分子抑制剂有多个临床在研药物。已经上市和在临床(前)研究的拓扑异构酶I代表性抑制剂信息列举在表1中。伊立替康和拓扑替康均已通过美国FDA上市，相比喜树碱溶解性更强，但毒性仍然很强，不良反应主要包括腹泻、血尿、呕吐、恶心等，这就限制了它们的疗效及用量。目前许多对喜树碱的结构改造主要从增强水溶性和生物利用度和减低毒性出发，主要在7、9、10、11位上，或在A环上进行变化，又或者把E环打开、扩环以及增加亲水基团以获得更好的水溶性。其中Enzon公司在SN-38(伊立替康CPT-11的代谢物)的20号位引入了聚乙二醇(Polyethylene Glycol,PEG)，增大了化合物的溶解度。PEG-SN38的抗肿瘤活性是伊立替康的10倍，在小鼠模型上的毒性是伊立替康的3-4倍，人体毒性似乎达到了伊立替康的10倍以上。伊立替康可以注射350mg/m2/3周的剂量，而PEG-SN38在注射30mg/m2/3周时即存在安全性问题，可能是PEG分子量太大。PEG-SN38已经由Enzon转让给中国海正药业继续IND申报和临床研究。

[0007] 已有的研究表明，喜树碱衍生物结构的细微差异对其活性有着重大的影响。现有的喜树碱衍生物普遍存在活性不足，或者毒副作用过大的问题。一般认为喜树碱衍生物的抗肿瘤活性与其生物毒性正相关，如何在有效保留其抗肿瘤活性的同时减少其毒副作用，是极具挑战性的工作。虽然有大量的文献报导了多种对喜树碱的修饰策略并取得了一定的结果，但是其具体的构效关系依然是不清楚的，人们很难根据衍生物的结构预知其生物特性，特别是其生物毒性。

[0008] 此外，现有喜树碱衍生物的水溶解性、稳定性较差，难以成药，限制了其应用。

发明内容

[0009] 本发明的目的在于一种新型的喜树碱衍生物及其在制备抗肿瘤药物中的应用。

[0010] 本发明所采取的技术方案是：

[0011] 发明人通过在喜树碱的9，10，20位上进行结构修饰，在保持喜树碱新衍生物的稳定性前提下，提高其生物活性，增加其水溶性，并降低毒性，最终实现提高其体内抗肿瘤的高效性和作为药物的应用。

[0012] 本发明的喜树碱衍生物，其化学结构通式(1)如下：

[0013]

[0014] 式中，R1选自H或HOOC-(CH2)2-CO-NH-CH2-CO-；

[0015] R2取代基团选自H、(CH3)2-CH-、CH3-(CH2)3-、(CH3)2-CH-CH2-、吡啶基；

[0016] 或其可形成的药学上可接受的酯、醚、盐、酰胺类衍生物。

[0017] 本发明的有益效果是：

[0018] 本发明的喜树碱衍生物在抑制胃癌、肝癌、乳腺癌和神经母细胞瘤有优良的体外生物活性，在小鼠体内肝癌生物活性测试中，表现得比市场用药拓扑替康疗效更好，而且毒性也低于拓扑替康。

附图说明

[0019] 图1是化合物7(YH-009)对荷瘤鼠肿瘤(HepG-2)体积(mm3)的影响；

[0020] 图2是荷瘤瘤重(HepG-2)情况图；

[0021] 图3是实验终点荷瘤动物解剖瘤子照片；

[0022] 图4和5分别是化合物1的核磁氢谱和碳谱；

[0023] 图6和7分别是化合物2的核磁氢谱和碳谱；

[0024] 图8和9分别是化合物3的核磁氢谱和碳谱；

[0025] 图10和11分别是化合物4的核磁氢谱和碳谱；

[0026] 图12分别是化合物5的核磁氢谱；

[0027] 图13和14分别是化合物6的核磁氢谱和碳谱；

[0028] 图15和16分别是化合物6的核磁氢谱和碳谱。

具体实施方式

[0029] 相关定义：

[0030] 1.药学中可接受的盐

[0031] 本文所述的“药学上可接受的”指在化合物如盐或赋形剂中缺少不能接受的毒性。碱性化合物能够与各种酸形成不同形式的盐，这些酸被用以制备药学上可接受的盐，这些盐的无机阴离子，包括但并不限于，硫酸根、硫酸氢根，亚硫酸根、硝酸根、亚硝酸根、氯离子、溴离子、碘离子、磷酸根、磷酸(一、二)氢根、异烟酸等；有机阴离子包括醋酸根、乳酸根、草酸根、马来酸根、枸橼酸根、水杨酸根、肉桂酸根、油酸根、富马酸根、酒石(氢)酸根、丙酮酸根、丹宁酸根、三氟醋酸盐、丙酸根、柠檬酸根、泛酸根、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、延胡索酸盐、葡糖酸盐、葡萄糖醛酸根、蔗糖盐、甲酸盐、苯酸盐、谷氨酸盐、甲基磺酸根、乙烷磺酸根、苯磺酸根、甲基苯磺酸根、双羟萘酸根等。

[0032] 所发明的酸式化合物在自然界也可以与药理学上可接受的阳离子形成碱式盐，这些盐包括但并不限于碱土金属、碱性金属，尤其钙离子、镁离子、钠离子、锂离子、锌离子、钾离子、铁离子等等。

[0033] 2.治疗方法和剂型：

[0034] 本发明提供了用于治疗或预防癌症的方法，包括制定病人的治疗有效量，化合物或组合物，化合物及其组成，药学上可接受的载体、赋形剂，或稀释剂。该发明的化合物及其组合成分可以治疗或预防癌症包括但不仅限于，如淋巴管肉瘤，结肠癌，胰腺癌，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，鳞状细胞癌，腺癌，肾细胞癌，肝癌，子宫颈癌，肺癌，小细胞肺癌，膀胱癌，恶性黑色素瘤，白血病，急性淋巴细胞白血病和急性髓细胞性白血病(粒细胞，早幼粒细胞，粒细胞，单核细胞和白血病)；慢性白血病(慢性粒细胞白血病(粒)和慢性淋巴细胞白血病)，淋巴癌(霍奇金疾病和非霍奇金疾病)，多发性骨髓瘤等等。

[0035] 本发明的化合物和组合物可以连续地或间断地任何与其他分子相容的方式给药，口服或不经肠道的方式吸收，包括肌肉注射、腹腔、静脉、皮下、鼻内、硬膜外、口服、舌下、脊柱内、心室内、鞘内、脑池内、囊内、阴道，透皮，直肠，通过吸入或外敷，特别是耳朵，鼻子，眼睛，或皮肤等。也可能是与另一种生物活性剂一起作用。其作用可以是全身或局部。不同的药物输送系统包括了，封装于脂质体、微粒子、微胶囊、胶囊等。

[0036] 本发明也可以通过使用吸入器或喷雾器，和制成气雾剂，或通过灌注在氟碳化合物或合成的肺表面活性剂。本发明的化合物还可作为栓剂，以传统的粘合剂和载体如甘油三酯。

[0037] “药学上可接受”普遍公认的药典所列在动物身上，更尤其是在人类身上载体是指稀释剂，助剂，辅料。这种载体可以诸如水和油。动物，蔬菜或合成来源，如花生油，大豆油，矿物油，香油之类的。载体亦可以为生理盐水，阿拉伯胶，明胶，淀粉糊，滑石粉，角质，胶体二氧化硅等等。此外。辅助剂，稳定剂，增稠剂，润滑剂，着色剂均可以使用。当给病人用药时，发明的化合物成分和药学上可接受载体，赋形剂或稀释剂，最好是无菌的。静脉给药时，水是本发明的化合物是首选的载体。盐、葡萄糖和甘油的溶液也可作为液态载体，特别是注射的方案中。合适的制药载体还包括诸如辅料淀粉，葡萄糖，乳糖，蔗糖，明胶，麦芽，大米，面粉，硅胶，硬脂酸钠，甘油单硬脂酸，滑石粉，氯化钠，脱脂牛奶，甘油，丙二醇，水，乙醇等。目前化合物和组成，如果有需要的话，也可以包含适量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。

[0038] 目前的化合物和组合物可以采取解决方案的形式包括，悬浮物。乳剂，片剂，丸剂，装有液体的颗粒，胶囊，粉末，长控释制剂，栓剂，乳剂。航空溶胶，喷雾剂，悬浮物，或任何其他形式适合使用。

[0039] 发明的化合物和组成物口服给药可能是在片剂，含片，水的形式或油性悬浮物，颗粒，粉末，乳液，胶囊剂，糖浆的。化合物和组成物口服给药方式也可以制定食品和食品混合。另外在药片或药丸形式的化合物成分可延迟解体和在胃肠道吸收，从而提供持续一个较长时期的效果。时间延迟材料包括如甘油单硬脂酸酯或甘油硬脂酸。口服成分可以包括标准医药级别的载体如甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，糖精钠，纤维素，碳酸镁等等。

[0040] 2.1联合治疗

[0041] 本发明的化合物可同时与一个或多个其他的治疗药物，用于哺乳动物，尤其人类。当结合使用其他治疗，如其他抗癌化合物，该化合物和治疗剂的加法可以充当或更好的协同作用。发明的化合物与其他治疗药物可以是同样的组成，或是分开的组合，之前或之后的用药方式。对于许多慢性疾病治疗，其体现就在于一个综合疗法与交互组合的用药方式，例如，以尽量减少特定的药物毒性。在某些情况，当发明的组成与另一种治疗剂或试剂使用可能产生的副作用，包括，但不仅限于毒性，可以降低治疗剂剂量以低于阈值达到降低所引起的不良副作用。

[0042] 下面结合实施例和实验数据，进一步说明本发明的技术方案。

[0043] 化合物1：

[0044] 在10-羟基喜树碱(180mg，0.5mmol)的醋酸溶液(1ml)中加入65％的HNO3(0.5ml)，此反应混合物在室温条件下反应过夜，待反应完全，将反应混合液用H2O(2.5ml)稀释，过滤，水洗滤饼，所得固体过滤物经快速柱层析分离获得化合物A(甲醇/二氯甲烷1:50作为洗脱体系)；取化合物A(50mg,0.12mmol)以及10％Pd/C(20mg)的甲醇悬浊液在氢气气体环境下50℃搅拌2小时，待反应完全后，将溶剂移除，剩余物溶于四氢呋喃溶剂，加入甲醛，反应混合物在50℃条件下搅拌6小时，再加入DDQ(55mg,0.24mmol)，反应混合物在50℃条件下继续反应10小时，待反应完全后，将溶剂移除，剩余物经快速柱层析分离获得化合物1(甲醇/二氯甲烷1:50作为洗脱体系)。

[0045] 化合物1结构由核磁氢谱和碳谱数据确定，其核磁氢谱、碳谱图分别见图4和图5，表征数据如下：

[0046] 1H NMR(500MHz,DMSO)δ9.10(s,1H),9.03(s,1H),8.31(d,J＝9.2Hz,1H),8.21(d,J＝9.2Hz,1H),7.35(s,1H),6.52(s,1H),5.43(s,2H),5.33(s,2H),1.87(m,2H),0.88(t,J＝7.3Hz,3H)。

[0047] 13C NMR(75MHz,DMSO)δ172.90,156.94,155.17,151.74,150.27,147.50,146.23,145.42,135.07,130.70,127.65,125.75,121.10,119.27,115.64,96.84,72.79,65.67,
50.67,30.81,8.25。

[0048] 化合物2：

[0049] 上述化合物A(50mg,0.12mmol)以及10％Pd/C(20mg)的甲醇悬浊液在氢气气体环境下50℃搅拌2小时，待反应完全后，将溶剂移除，剩余物溶于四氢呋喃溶剂，加入异丁醛(17mg,0.24mmol)，反应混合物在50℃条件下搅拌6小时，再加入DDQ(55mg,0.24mmol)，反应混合物在50℃条件下继续反应10小时，待反应完全后，将溶剂移除，剩余物经快速柱层析分离获得化合物2(甲醇/二氯甲烷1:50作为洗脱体系)。

[0050] 化合物2结构由核磁氢谱和碳谱数据确定，其核磁氢谱、碳谱图分别见图6和图7，表征数据如下：

[0051] 1H NMR(300MHz,DMSO)δ9.08(s,1H),8.25(d,J＝9.2Hz,1H),8.14(d,J＝9.2Hz,1H),7.35(s,1H),6.55(s,1H),5.43(s,2H),5.32(s,2H),3.43(d,J＝6.9Hz,1H),1.87(dd,J＝11.5,4.5Hz,2H),1.46(d,J＝6.9Hz,6H),0.88(s,3H)。

[0052] 13C NMR(75MHz,DMSO)δ172.93,171.85,156.95,151.43,150.32,147.93,145.94,145.50,135.89,130.32,126.62,125.67,120.71,119.13,115.17,96.85,72.82,65.63,
50.64,30.76,28.75,20.52,8.23。

[0053] 化合物3：

[0054] 上述化合物A(50mg,0.12mmol)以及10％Pd/C(20mg)的甲醇悬浊液在氢气气体环境下50℃搅拌2小时，待反应完全后，将溶剂移除，剩余物溶于四氢呋喃溶剂，加入正戊醛(21mg,0.24mmol)，反应混合物在50℃条件下搅拌6小时，再加入DDQ(55mg,0.24mmol)，反应混合物在50℃条件下继续反应10小时，待反应完全后，将溶剂移除，剩余物经快速柱层析分离获得化合物3(甲醇/二氯甲烷1:50作为洗脱体系)。

[0055] 化合物3结构由核磁氢谱和碳谱数据确定，其核磁氢谱、碳谱图分别见图8和图9，表征数据如下：

[0056] 1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.93(s,1H),8.13(d,J＝9.1Hz,1H),8.03(d,J＝9.1Hz,1H),7.27(s,1H),6.52(s,1H),5.40(s,2H),5.20(s,2H),3.04(t,J＝7.4Hz,2H),1.85(dd,J＝15.3,7.7Hz,4H),1.44(dd,J＝14.7,7.3Hz,2H),0.95(t,J＝7.3Hz,3H),0.89(t,J＝
7.1Hz,3H)。

[0057] 13C NMR(101MHz,DMSO)δ172.95,168.26,157.18,151.91,150.43,148.20,146.24,145.82,136.31,130.86,126.74,126.01,120.99,119.31,115.42,96.94,72.85,65.71,
50.90,30.78,28.78,28.06,22.12,14.06,8.24。

[0058] 化合物4：

[0059] 上述化合物A(50mg,0.12mmol)以及10％Pd/C(20mg)的甲醇悬浊液在氢气气体环境下50℃搅拌2小时，待反应完全后，将溶剂移除，剩余物溶于四氢呋喃溶剂，加入异戊醛(21mg,0.24mmol)，反应混合物在50℃条件下搅拌6小时，再加入DDQ(55mg,0.24mmol)，反应混合物在50℃条件下继续反应10小时，待反应完全后，将溶剂移除，剩余物经快速柱层析分离获得化合物4(甲醇/二氯甲烷1:50作为洗脱体系)。

[0060] 化合物4结构由核磁氢谱和碳谱数据确定，其核磁氢谱、碳谱图分别见图10和图11，表征数据如下：

[0061] 1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.98(s,1H),8.16(d,J＝9.1Hz,1H),8.06(d,J＝9.2Hz,1H),7.29(s,1H),6.52(s,1H),5.41(s,2H),5.24(s,2H),2.94(d,J＝7.1Hz,2H),2.27(dt,J＝13.5,6.7Hz,1H),1.92–1.82(m,2H),1.03(d,J＝6.6Hz,6H),0.89(t,J＝7.2Hz,3H)。

[0062] 13C NMR(101MHz,DMSO)δ172.95,167.51,157.21,152.00,150.45,148.25,146.31,145.87,136.36,130.97,126.80,126.10,121.07,119.35,115.48,96.97,72.86,65.71,
50.95,37.19,30.78,27.51,22.63,8.25。

[0063] 化合物5：

[0064] 上述化合物A(50mg,0.12mmol)以及10％Pd/C(20mg)的甲醇悬浊液在氢气气体环境下50℃搅拌2小时，待反应完全后，将溶剂移除，剩余物溶于四氢呋喃溶剂，加入2-吡啶甲醛(26mg,0.24mmol)，反应混合物在50℃条件下搅拌6小时，再加入DDQ(55mg,0.24mmol)，反应混合物在50℃条件下继续反应10小时，待反应完全后，将溶剂移除，剩余物经快速柱层析分离获得化合物5(甲醇/二氯甲烷1:50作为洗脱体系)。

[0065] 化合物5结构由核磁氢谱确定，其核磁氢谱见图12，表征数据如下：

[0066] 1H NMR(300MHz,DMSO)δ9.16(s,1H),8.83(s,1H),8.44–8.32(m,2H),8.23(d,J＝9.3Hz,1H),8.10(s,1H),7.66(s,1H),7.35(s,1H),6.54(s,1H),5.42(s,2H),5.35(s,2H),
1.86(dd,J＝12.0,6.6Hz,2H),0.89(t,J＝7.0Hz,3H)。

[0067] 化合物6：

[0068] 化合物1(101mg,0.26mmol),Sc(OTf)3(78mg,0.16mmol)以及DMAP(94mg,0.78mmol)溶于干燥的二氯甲烷溶剂中，反应混合物常温条件下搅拌30分钟，再加入Boc-甘氨酸(136mg,0.78mmol)，反应混合物再搅拌30分钟，然后再加入DCC(272mg,1.3mmol)，反应混合物再在室温条件下搅拌过夜，然后硅藻土过滤，滤液浓缩后经快速柱层析分离获得化合物B(甲醇/二氯甲烷1:100作为洗脱体系)。化合物B(82mg,0.15mmol)的二氯甲烷溶液中加入TFA(1ml)，反应混合物再室温条件下搅拌30分钟后，移除反应溶剂，剩余物溶于DMF(2ml)，向反应溶液中加入丁二酸酐(97mg,0.97mmol)以及4-甲基吡啶(73mg,0.81mmol)，反应混合物在室温条件下搅拌过夜，移除反应溶剂，剩余物经快速柱层析分离获得化合物6(甲醇/二氯甲烷1:50作为洗脱体系)。

[0069] 化合物6结构由核磁氢谱和碳谱数据确定，其核磁氢谱、碳谱图分别见图13和图14，表征数据如下：

[0070] 1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.08(s,1H),9.02(s,1H),8.98(s,1H),8.43(t,J＝5.7Hz,1H),8.23(d,J＝9.2Hz,1H),8.15(d,J＝9.2Hz,1H),7.13(s,1H),5.50(s,2H),5.35–
5.21(m,2H),4.10(ddd,J＝67.9,18.0,5.8Hz,2H),2.41(dd,J＝11.5,5.7Hz,4H),2.22–
2.13(m,2H),0.94(t,J＝7.3Hz,3H)。

[0071] 13C NMR(101MHz,DMSO)δ174.14,174.05,172.06,169.58,167.51,156.92,155.34,152.02,147.77,146.52,146.32,145.58,135.33,131.22,127.86,126.11,121.53,119.36,
115.90,95.59,76.66,66.80,50.95,30.92,30.16,29.39,29.26,7.98。

[0072] 化合物7：

[0073] 化合物2(120mg,026mmol),Sc(OTf)3(78mg,0.16mmol)以及DMAP(94mg,0.78mmol)溶于干燥的二氯甲烷溶剂中，反应混合物常温条件下搅拌30分钟，再加入Boc-甘氨酸(136mg,0.78mmol)，反应混合物再搅拌30分钟，然后再加入DCC(272mg,1.3mmol)，反应混合物再在室温条件下搅拌过夜，然后硅藻土过滤，滤液浓缩后经快速柱层析分离获得化合物C(甲醇/二氯甲烷1:100作为洗脱体系)。化合物C(88mg,0.15mmol)的二氯甲烷溶液中加入TFA(1ml)，反应混合物再室温条件下搅拌30分钟后，移除反应溶剂，剩余物溶于DMF(2ml)，向反应溶液中加入丁二酸酐(97mg,0.97mmol)以及4-甲基吡啶(73mg,0.81mmol)，反应混合物在室温条件下搅拌过夜，移除反应溶剂，剩余物经快速柱层析分离获得化合物7(甲醇/二氯甲烷1:50作为洗脱体系)。

[0074] 化合物7结构由核磁氢谱和碳谱数据确定，其核磁氢谱、碳谱图分别见图15和图16，表征数据如下：

[0075] 1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.07(s,1H),9.06(s,1H),8.44(s,1H),8.21(d,J＝9.0Hz,1H),8.13(d,J＝8.9Hz,1H),7.15(s,1H),5.50(s,2H),5.30(s,2H),4.22–4.14(m,
1H),4.00(dd,J＝17.8,4.9Hz,1H),3.43–3.38(m,1H),2.43(d,J＝5.5Hz,2H),2.38(s,2H),
2.16(d,J＝6.5Hz,2H),1.46(d,J＝6.8Hz,6H),0.93(d,J＝6.7Hz,3H)。

[0076] 13C NMR(400MHz；DMSO-d6)δ7.96,20.66,28.84,29.38,30.14,30.86,50.97,66.80,76.65,95.57,115.65,119.29,121.29,126.20,126.83,131.05,136.29,145.53,
146.35,146.43,148.31,151.92,156.97,167.56,169.57,172.03,172.22,174.16。

[0077] 本发明喜树碱衍生物/拓扑替康衍生物的体外抗肿瘤活性实验

[0078] 实验原理：MTT分析法以活细胞代谢物还原剂MTT噻唑蓝为基础，利用酶标仪测定490nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目，从而测定化合物对肿瘤细胞的杀伤效果。

[0079] 实验步骤：收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100μL，铺板使待测细胞密度为1000-10000个/孔(边缘孔用无菌PBS填充)；将96孔板放在5％CO2，37℃培养箱中孵育，至细胞单层铺满孔底，加入浓度梯度的药物。原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天晚上铺板，次日上午加药。一般5-7个梯度，每孔5μL，设3-5个平行孔；5％CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察；每孔加入20μLMTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液；终止培养，小心吸去孔内培养液；每孔加入150μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解，酶联免疫检测仪在490nm处测量各孔的吸光值。

[0080] 8种药物分别用于检测4种肿瘤细胞的抗癌细胞活性，8种药物分别为上表所列化合物1-7以及拓扑替康。4种肿瘤细胞为：1)MGC80-3，人胃癌细胞；2)HepG-2，人肝癌细胞；3)MDA-MB-231，人乳腺癌细胞；4)SK-N-SH，人神经母细胞瘤。实验结果如下表。

[0081] 表1.喜树碱/拓扑替康衍生物的体外抗肿瘤活性

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[0083] 本发明喜树碱衍生物/拓扑替康衍生物的体内抗肿瘤活性实验

[0084] 体内抗肿瘤活性实验研究了拓扑替康和化合物7(Rngn-YH-009)对人肝癌裸鼠的治疗作用，采用人肝癌细胞株HepG2接种裸鼠建立荷人肝癌裸鼠模型。待荷瘤裸鼠瘤体积长至50mm3左右时，基于瘤体积随机化分组。按照以下不同方法给药治疗，检测动物体重、瘤径等指标，待给药结束后约1周将动物处以安乐死，称量瘤重并进行大体病理解剖检查。

[0085] 化合物7(YH-009)对荷瘤鼠肿瘤(HepG-2)体积(mm3)的影响如图1所示，

[0086] 荷瘤瘤重(HepG-2)情况如图2所示，实验终点荷瘤动物解剖瘤子照片如图3所示。

[0087] 从实验结果可以看出，化合物7各剂量组均表现出良好的抑瘤效果，化合物7(静脉8mg/kg T/C％＝7％，口服1.3mg/kg T/C％＝7％)和化合物7(静脉30mg/kg,T/C％＝10％)抗肿瘤作用显著优于阳性对照Topotecan组(T/C％＝26％，P＜0.01)。此外，模型组动物在实验期间体重基本呈现上升趋势，在第32日开始体重下降，是由于荷瘤体积的增大，导致动物生长状态下降，在实验结束时动物体重较初次给药前增长9.17％。阳性对照TPT组动物在给药结束后，有时会出现体重下降，尤其是在实验结束时，动物平均体重较给药前下降
1.47％，这可能是由于其毒性作用所导致。Rngn-YH-009(15mg/kg和30mg/kg)静脉注射给药组动物体重变化趋势基本一致，在实验结束时体重均高于给药前，其中15mg/kg组实验结束时动物体重较给药前升高6.65％；30mg/kg组实验结束时动物体重较给药前升高8.31％。说明给药结束后荷瘤动物状态恢复良好。

[0088] 表2.拓扑替康和化合物7的体内抗肿瘤(HepG-2)活性

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[0090] 备注：T/C％表示相对肿瘤增殖率。计算公式为TRTV/CRTV×100％，其中T为治疗组，C为模型组。T/C％＜40％，且P＜0.05，为有效。

[0091] 急性毒性评价

[0092] 对化合物7进行了急性毒性评价。单次尾静脉给药实验结果显示，化合物7自60mg/kg开始出现后退肌肉无力，精神萎靡，竖毛，步态不稳；逐渐加重剂量至90mg/kg至120mg/kg后死亡。确定化合物7单次静脉给药的MTD在50mg/kg～60mg/kg附近。化合物7一周重复给药的MTD在20mg/kg左右。

[0093] 以上数据和分析证实了新制备的新型喜树碱/拓扑替康类衍生物相较于上市的拓扑替康，降低了毒性，提高了生物活性，因此，本发明的喜树碱衍生物在作为一类低毒、高效的候选新药应用具有广泛前景。

[0094] 水溶性及剂型

[0095] 用乙醇钠与候选化合物反应获得其钠盐，测量细胞活性最优的化合物7的水溶性。先用蒸馏水配成饱和溶液后用HPLC测浓度，再往这个水溶液中加样品，过滤后再测浓度。如下表所示候选化合物7的水溶性明显优于拓扑替康，而且候选药物水溶液的pH为7～8，接近人体生理pH，而拓扑替康(Topotecan)需在pH2～3时才有比较好的溶解度。

[0096] 表3.化合物7和拓扑替康的水溶性

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