一种集成显色和电化学检测的三维纸芯片及其制备方法

摘要

一种集成显色和电化学检测的三维纸芯片及其制备方法，本发明涉及一种三维纸芯片及其制备方法。本发明要解决现有三维纸芯片在与电化学检测结合时，实现2层分析检测需要复杂的折叠逻辑顺序，且为了保证流体可以在相邻两层之间稳定流动，需要使用纤维素粉末的问题。一种集成显色和电化学检测的三维纸芯片包括上固定板、引导层、显色反应检测层、电化学检测层、下固定板、分流层、隔离层、工作电极、参比电极及对比电极；方法：三维纸芯片的加工；三维纸芯片的组装。

权利要求

1.一种集成显色和电化学检测的三维纸芯片，其特征在于一种集成显色和电化学检测的三维纸芯片包括上固定板(1)、引导层(2)、显色反应检测层(3-1)、电化学检测层(3-2)、下固定板(4)、分流层(5)、隔离层(6)、工作电极(14-1)、参比电极(14-2)及对比电极(14-

3)；所述的显色反应检测层(3-1)及电化学检测层(3-2)为检测层，所述的引导层(2)、分流层(5)及隔离层(6)为非检测层；

上固定板(1)、引导层(2)、分流层(5)、显色反应检测层(3-1)、隔离层(6)、电化学检测层(3-2)及下固定板(4)按由上至下依次设置，且上固定板(1)上均布设置多个目标区域(7)，引导层(2)上对应上固定板(1)的目标区域(7)设置结构及位置相同的引导口(10)，分流层(5)上对应引导层(2)的引导口(10)设置结构及位置相同的分离口(11)，且分流层(5)上的分离口(11)通过通道与引导区域(9)相连通，显色反应检测层(3-1)上对应分流层(5)的分离口(11)设置结构及位置相同的第一检测区域(8-1)，显色反应检测层(3-1)上对应分流层(5)的引导区域(9)设置结构及位置相同的非检测区域(12)，隔离层(6)上对应显色反应检测层(3-1)的非检测区域(12)设置结构及位置相同的隔离口(13)，电化学检测层(3-2)上对应隔离层(6)的隔离口(13)设置结构及位置相同的第二次检测区域(8-2)；所述的第二次检测区域(8-2)内设置工作电极(14-1)、参比电极(14-2)及对比电极(14-3)。

2.根据权利要求1所述的一种集成显色和电化学检测的三维纸芯片，其特征在于所述的工作电极(14-1)及参比电极(14-2)设置于第二次检测区域(8-2)的端部宽为1.5mm。

3.根据权利要求1所述的一种集成显色和电化学检测的三维纸芯片，其特征在于所述的对比电极(14-3)设置于第二次检测区域(8-2)的端部宽为2mm。

4.根据权利要求1所述的一种集成显色和电化学检测的三维纸芯片，其特征在于所述的上固定板(1)及下固定板(4)为PMMA板。

5.如权利要求1所述的一种集成显色和电化学检测的三维纸芯片的制备方法，其特征在于一种集成显色和电化学检测的三维纸芯片的制备方法是按以下步骤进行的：一、三维纸芯片的加工：

①、首先选择层析纸作为检测层及非检测层，然后用CoreldrawX8软件按检测层和非检测层图案设计丝网印刷版的结构，并制备出相应结构的丝网印刷版；

所述的丝网印刷版为150目～300目；

②、将步骤一①制备的丝网印刷版置于层析纸上，并将固体蜡透过丝网印刷版，反复摩擦印刷3min～5min，得到印刷有固体蜡的层析纸；

③、将印刷有固体蜡的层析纸置于温度为100℃～130℃的热板上，加热至固体蜡完全溶解于层析纸中形成疏水区域，得到带有疏水区域的层析纸，将带有疏水区域的层析纸置于室温下冷却，得到检测层和非检测层；

二、三维纸芯片的组装：

①、对厚度为8μm～12μm的薄双面胶进行切割处理，得到切割后的薄双面胶；

②、将检测层、非检测层和固定板按设计进行叠放并设置工作电极(14-1)、参比电极(14-2)及对比电极(14-3)，然后利用切割后的薄双面胶进行粘贴，最后用螺栓和螺母进行固定拧紧，即完成一种集成显色和电化学检测的三维纸芯片的制备方法。

6.根据权利要求5所述的一种集成显色和电化学检测的三维纸芯片的制备方法，其特征在于步骤一①中所述的丝网印刷版为200目。

7.根据权利要求5所述的一种集成显色和电化学检测的三维纸芯片的制备方法，其特征在于步骤一②中将步骤一①制备的丝网印刷版置于层析纸上，并将固体蜡透过丝网印刷版，反复摩擦印刷5min，得到印刷有固体蜡的层析纸。

8.根据权利要求5所述的一种集成显色和电化学检测的三维纸芯片的制备方法，其特征在于步骤一③中将印刷有固体蜡的层析纸置于温度为120℃的热板上，加热至固体蜡完全溶解于层析纸中形成疏水区域，得到带有疏水区域的层析纸。

9.根据权利要求5所述的一种集成显色和电化学检测的三维纸芯片的制备方法，其特征在于步骤二①中对厚度为10μm的薄双面胶进行切割处理，得到切割后的薄双面胶。

说明书

一种集成显色和电化学检测的三维纸芯片及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种三维纸芯片及其制备方法。

背景技术

[0002] 纸基微流控芯片(Microfluidic paper based analytical devices,μPADs)在2007年由Whitesides课题组提出[A.W.Martinez,S.T.Phillips,M.J.Butte,G.M.Whitesides,Patterned Paper as a Platform for Inexpensive,Low-Volume,Portable Bioas-says,Angewandte Chemie 119(8)(2007)1340-1342]。近年来在各个领域中获得了越来越多的关注，比如医疗诊断、食品安全检测、环境分析以及细胞培养等等。纸芯片通常可以利用PDMS或者光刻胶等在纸表面加工出各种各样的疏水图案或者通道。基于光刻或者PDMS绘制等工艺加工纸芯片，往往需要光刻机、光刻胶以及昂贵的喷绘打印机等设备。同时光刻胶往往很难去除干净，残留在纸芯片上的光刻胶还会影响检测结果。然而普通的喷蜡打印工艺仍然需要喷蜡打印机，在资源有限的偏远地区不容易获得。Wijitar等人
2011年提出了基于丝网印刷工艺加工纸芯片的方法[W.Dungchai,O.Chailapakul,C.S.Henry,A low-cost,simple,and rapid fabrication method for paper-based microfluidics using wax screen-printing,Analyst 136(1)(2011)77-82]。该方法简单，加工材料容易获得，且不需要昂贵的设备。

[0003] 目前基于三维纸芯片进行的显色反应虽然可以实现简单的视觉或者定性分析，但是检测结果容易受到样品的背景颜色的影响，而且检测灵敏度比较低。而电化学检测为解决上述局限，提供了一种新的途径，这种方法具有较高的灵敏度，需要的设备简单，便捷，较低的检测极限等优点。Henry等人2009年首次提出了将电化学检测和纸芯片结合，并基于氧化酶反应用来检测葡萄糖、乳酸和尿酸[W.Dungchai,O.Chailapakul,C.S.Henry,Electrochemical detection for paper-based microfluidics,Anal Chem 81(14)(2009)5821-6]。基于纸芯片进行电化学检测得到了众多学者的研究，比如，Apilux等人在二维纸芯片上实现了金和铁离子的电化学和显色检测[A.Apilux,W.Dungchai,W.Siangproh,N.Praphairaksit,C.S.Hen-ry,O.Chailapakul,Lab-on-paper with dual electrochemi-cal/colorimetric detection for simultaneous determination of gold and iron,Anal Chem 82(5)(2010)1727-32]。然而三维纸芯片具有更加紧凑的结构，通过在三维的纸芯片设计相应微通道，可实现流体的纵向和横向流动，因而在较小的面积上可以完成多种分析和检测，同时具有消耗样品容量小和操作时间段等优点。但现有三维纸芯片在与电化学检测结合时，实现2层分析检测需要复杂的折叠逻辑顺序，且为了保证流体可以在相邻两层之间稳定流动，需要使用纤维素粉末的问题。

发明内容

[0004] 本发明要解决现有三维纸芯片在与电化学检测结合时，实现2层分析检测需要复杂的折叠逻辑顺序，且为了保证流体可以在相邻两层之间稳定流动，需要使用纤维素粉末的问题，而提供一种集成显色和电化学检测的三维纸芯片及其制备方法。

[0005] 一种集成显色和电化学检测的三维纸芯片包括上固定板、引导层、显色反应检测层、电化学检测层、下固定板、分流层、隔离层、工作电极、参比电极及对比电极；所述的显色反应检测层及电化学检测层为检测层，所述的引导层、分流层及隔离层为非检测层；

[0006] 上固定板、引导层、分流层、显色反应检测层、隔离层、电化学检测层及下固定板按由上至下依次设置，且上固定板上均布设置多个目标区域，引导层上对应上固定板的目标区域设置结构及位置相同的引导口，分流层上对应引导层的引导口设置结构及位置相同的分离口，且分流层上的分离口通过通道与引导区域相连通，显色反应检测层上对应分流层的分离口设置结构及位置相同的第一检测区域，显色反应检测层上对应分流层的引导区域设置结构及位置相同的非检测区域，隔离层上对应显色反应检测层的非检测区域设置结构及位置相同的隔离口，电化学检测层上对应隔离层的隔离口设置结构及位置相同的第二次检测区域；所述的第二次检测区域内设置工作电极、参比电极及对比电极。

[0007] 一种集成显色和电化学检测的三维纸芯片的制备方法是按以下步骤进行的：

[0008] 一、三维纸芯片的加工：

[0009] ①、首先选择层析纸作为检测层及非检测层，然后用CoreldrawX8软件按检测层和非检测层图案设计丝网印刷版的结构，并制备出相应结构的丝网印刷版；

[0010] 所述的丝网印刷版为150目～300目；

[0011] ②、将步骤一①制备的丝网印刷版置于层析纸上，并将固体蜡透过丝网印刷版，反复摩擦印刷3min～5min，得到印刷有固体蜡的层析纸；

[0012] ③、将印刷有固体蜡的层析纸置于温度为100℃～130℃的热板上，加热至固体蜡完全溶解于层析纸中形成疏水区域，得到带有疏水区域的层析纸，将带有疏水区域的层析纸置于室温下冷却，得到检测层和非检测层；

[0013] 二、三维纸芯片的组装：

[0014] ①、对厚度为8μm～12μm的薄双面胶进行切割处理，得到切割后的薄双面胶；

[0015] ②、将检测层、非检测层和固定板按设计进行叠放并设置工作电极、参比电极及对比电极，然后利用切割后的薄双面胶进行粘贴，最后用螺栓和螺母进行固定拧紧，即完成一种集成显色和电化学检测的三维纸芯片的制备方法。

[0016] 本发明的有益效果是：

[0017] 本发明基于折叠技术和双面胶设计了三维芯片，实现2层分析检测时，无需要复杂的折叠逻辑顺序，并将电化学检测与三维纸芯片结合，仅需要小容量的样品即可同时实现显色和电化学检测(20微升～30微升)。不仅可以实现简易的显色反应进行初步分析，还可以同时实现电化学检测，进行高灵敏度的定量分析。最后通过蛋白质和葡萄糖的显色反应以及葡萄糖的电化学检测验证了该三维芯片平台的良好性能。解决了三维纸芯片在与电化学检测结合时，实现2层分析检测需要复杂的折叠逻辑顺序，且为了保证流体可以在相邻两层之间稳定流动，需要使用纤维素粉末的问题。

[0018] 本发明三维纸芯片首先利用固体蜡和丝网印刷技术在每一张纸上加工出各种疏水区域，进而在每张纸上构成亲水的微通道或者图案。其次，利用层叠技术和双面胶，可将多层布置有不同结构的纸组装成完整芯片。用薄双面胶将三维纸芯片中的非检测层永久粘连在一起，同时基于折纸技术，利用上下端的固定板将多个检测层和非检测层压紧，用螺栓固定在一起，进而完成芯片加工。将显色检测层和电化学检测层布置在设计好的不同检测层，进而仅需要小容量的样品(20微升～30微升)，即可同时完成显色和电化学检测，得到较高灵敏度的检测结果。

[0019] 基于葡萄糖和蛋白质的显色反应，通过测量检测结果的灰度值，可得到不同浓度蛋白质和葡萄糖下的灰度变化曲线，进而可以用来检测溶液中的葡萄糖和蛋白质含量。。

[0020] 基于葡萄糖和葡萄糖氧化酶的反应，通过电流计时方法得到了电流大小随葡萄糖浓度变化的曲线，进而可以较高灵敏度的检测溶液中的葡萄糖含量。

[0021] 本发明用于一种集成显色和电化学检测的三维纸芯片及其制备方法。

附图说明

[0022] 图1为本发明集成显色和电化学检测的三维纸芯片的结构示意图；

[0023] 图2为实施例一的集成显色和电化学检测的三维纸芯片的结构示意图；

[0024] 图3为实施例一的电化学检测层的结构示意图；

[0025] 图4为实施例一的集成显色和电化学检测的三维纸芯片的实物图；

[0026] 图5为实施例一组装前显色反应检测层滴加葡萄糖检测试剂及蛋白质检测试剂，晾干后的效果图；

[0027] 图6为实施例一的三维纸芯片向对应的目标区域分别滴加水、浓度为10mmol/lL葡萄糖和浓度为10μmol/lL蛋白质溶液后显色反应检测层的实验结果图；

[0028] 图7为在不同扫描速率下，铁氰化钾与氯化钾的混合溶液CV循环伏安特性曲线，1为100mV/s，2为200mV/s，3为300mV/s，4为400mV/s，5为500mV/s；

[0029] 图8为阴极和阳极电流随扫描速率的平方根的变化关系，1为阳极反应电流，2为阴极反应电流；

[0030] 图9为通过电化学工作站检测不同浓度葡萄糖的电流计时图，1为0mmol/L，2为2mmol/L，3为5mmol/L，4为10mmol/L，5为30mmol/L，6为40mmol/L；

[0031] 图10为在电流计时100s处，阴极电流随葡萄糖浓度的变化曲线；

[0032] 图11为具体实施方式五一种集成显色和电化学检测的三维纸芯片的制备方法流程图，1为层析纸，2为丝网印刷版，3为固体蜡，4为热板，5为疏水区域。

具体实施方式

[0033] 本发明技术方案不局限于以下所列举的具体实施方式，还包括各具体实施方式之间的任意组合。

[0034] 具体实施方式一：结合图1具体说明本实施方式，本实施方式一种集成显色和电化学检测的三维纸芯片包括上固定板1、引导层2、显色反应检测层3-1、电化学检测层3-2、下固定板4、分流层5、隔离层6、工作电极14-1、参比电极14-2及对比电极14-3；所述的显色反应检测层3-1及电化学检测层3-2为检测层，所述的引导层2、分流层5及隔离层6为非检测层；

[0035] 上固定板1、引导层2、分流层5、显色反应检测层3-1、隔离层6、电化学检测层3-2及下固定板4按由上至下依次设置，且上固定板1上均布设置多个目标区域7，引导层2上对应上固定板1的目标区域7设置结构及位置相同的引导口10，分流层5上对应引导层2的引导口10设置结构及位置相同的分离口11，且分流层5上的分离口11通过通道与引导区域9相连通，显色反应检测层3-1上对应分流层5的分离口11设置结构及位置相同的第一检测区域8-
1，显色反应检测层3-1上对应分流层5的引导区域9设置结构及位置相同的非检测区域12，隔离层6上对应显色反应检测层3-1的非检测区域12设置结构及位置相同的隔离口13，电化学检测层3-2上对应隔离层6的隔离口13设置结构及位置相同的第二次检测区域8-2；所述的第二次检测区域8-2内设置工作电极14-1、参比电极14-2及对比电极14-3。

[0036] 本实施方式中采用隔离层可防止两个检测层中检测区域比较近，会影响检测效果，产生交叉污染。

[0037] 本实施方式中引导层为了让滴入的样品通过毛吸引力更加均匀的流入下一层，如果直接滴加在下一层的通道中溶液会流动不均匀。

[0038] 本实施方式的有益效果是：

[0039] 本实施方式基于折叠技术和双面胶设计了三维芯片，实现2层分析检测时，无需要复杂的折叠逻辑顺序，并将电化学检测与三维纸芯片结合，仅需要小容量的样品即可同时实现显色和电化学检测(20微升～30微升)。不仅可以实现简易的显色反应进行初步分析，还可以同时实现电化学检测，进行高灵敏度的定量分析。最后通过蛋白质和葡萄糖的显色反应以及葡萄糖的电化学检测验证了该三维芯片平台的良好性能。解决了三维纸芯片在与电化学检测结合时，实现2层分析检测需要复杂的折叠逻辑顺序，且为了保证流体可以在相邻两层之间稳定流动，需要使用纤维素粉末的问题。

[0040] 本实施方式三维纸芯片首先利用固体蜡和丝网印刷技术在每一张纸上加工出各种疏水区域，进而在每张纸上构成亲水的微通道或者图案。其次，利用层叠技术和双面胶，可将多层布置有不同结构的纸组装成完整芯片。用薄双面胶将三维纸芯片中的非检测层永久粘连在一起，同时基于折纸技术，利用上下端的固定板将多个检测层和非检测层压紧，用螺栓固定在一起，进而完成芯片加工。将显色检测层和电化学检测层布置在设计好的不同检测层，进而仅需要小容量的样品(20微升～30微升)，即可同时完成显色和电化学检测，得到较高灵敏度的检测结果。

[0041] 基于葡萄糖和蛋白质的显色反应，通过测量检测结果的灰度值，可得到不同浓度蛋白质和葡萄糖下的灰度变化曲线，进而可以用来检测溶液中的葡萄糖和蛋白质含量。

[0042] 基于葡萄糖和葡萄糖氧化酶的反应，通过电流计时方法得到了电流大小随葡萄糖浓度变化的曲线，进而可以较高灵敏度的检测溶液中的葡萄糖含量。

[0043] 具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：所述的工作电极14-1及参比电极14-2设置于第二次检测区域8-2的端部宽为1.5mm。其它与具体实施方式一或二相同。

[0044] 具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二之一不同的是：所述的对比电极14-3设置于第二次检测区域8-2的端部宽为2mm。其它与具体实施方式一或二相同。

[0045] 具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：所述的上固定板1及下固定板4为PMMA板。其它与具体实施方式一至三相同。

[0046] 具体实施方式五：结合图11具体说明本实施方式，本实施方式所述的一种集成显色和电化学检测的三维纸芯片的制备方法是按以下步骤进行的：

[0047] 一、三维纸芯片的加工：

[0048] ①、首先选择层析纸作为检测层及非检测层，然后用CoreldrawX8软件按检测层和非检测层图案设计丝网印刷版的结构，并制备出相应结构的丝网印刷版；

[0049] 所述的丝网印刷版为150目～300目；

[0050] ②、将步骤一①制备的丝网印刷版置于层析纸上，并将固体蜡透过丝网印刷版，反复摩擦印刷3min～5min，得到印刷有固体蜡的层析纸；

[0051] ③、将印刷有固体蜡的层析纸置于温度为100℃～130℃的热板上，加热至固体蜡完全溶解于层析纸中形成疏水区域，得到带有疏水区域的层析纸，将带有疏水区域的层析纸置于室温下冷却，得到检测层和非检测层；

[0052] 二、三维纸芯片的组装：

[0053] ①、对厚度为8μm～12μm的薄双面胶进行切割处理，得到切割后的薄双面胶；

[0054] ②、将检测层、非检测层和固定板按设计进行叠放并设置工作电极14-1、参比电极14-2及对比电极14-3，然后利用切割后的薄双面胶进行粘贴，最后用螺栓和螺母进行固定拧紧，即完成一种集成显色和电化学检测的三维纸芯片的制备方法。

[0055] 本实施方式中检测层可利用薄双面胶进行下表面的粘接，但不能利用薄双面胶粘接上表面，否则影响观察结果。

[0056] 本实施方式步骤一②中将固体蜡透过丝网印刷版，反复摩擦印刷3min～5min，以确保将固体蜡很好的印刷在纸上。

[0057] 本实施方式步骤一③中将使用后的丝网印刷版放在带有吸水纸的热板上加热10min，以便去除残留在印刷版上的固体蜡。

[0058] 本实施方式步骤二①中利用刀片或者专业切割设备对厚度为8μm～12μm的薄双面胶进行切割处理。

[0059] 本实施方式在实验完成后，可以很方便的取出各个检测层进行分析处理，上下端的固定板用螺栓和螺母进行固定拧紧。

[0060] 具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式五不同的是：步骤一①中所述的丝网印刷版为200目。其它与具体实施方式六相同。

[0061] 具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式五或六之一不同的是：步骤一②中将步骤一①制备的丝网印刷版置于层析纸上，并将固体蜡透过丝网印刷版，反复摩擦印刷5min，得到印刷有固体蜡的层析纸。其它与具体实施方式五或六相同。

[0062] 具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式五至七之一不同的是：步骤一③中将印刷有固体蜡的层析纸置于温度为120℃的热板上，加热至固体蜡完全溶解于层析纸中形成疏水区域，得到带有疏水区域的层析纸。其它与具体实施方式五至七相同。

[0063] 具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式五至八之一不同的是：步骤二①中对厚度为10μm的薄双面胶进行切割处理，得到切割后的薄双面胶。其它与具体实施方式五至八相同。

[0064] 采用以下实施例验证本发明的有益效果：

[0065] 实施例一：结合图2及3具体说明本实施例。

[0066] 一种集成显色和电化学检测的三维纸芯片包括上固定板1、引导层2、显色反应检测层3-1、电化学检测层3-2、下固定板4、分流层5、隔离层6、工作电极14-1、参比电极14-2及对比电极14-3；所述的显色反应检测层3-1及电化学检测层3-2为检测层，所述的引导层2、分流层5及隔离层6为非检测层；

[0067] 上固定板1、引导层2、分流层5、显色反应检测层3-1、隔离层6、电化学检测层3-2及下固定板4按由上至下依次设置，且上固定板1上均布设置3个目标区域7，引导层2上对应上固定板1的目标区域7设置结构及位置相同的引导口10，分流层5上对应引导层2的引导口10设置结构及位置相同的分离口11，且分流层5上的分离口11通过通道与引导区域9相连通，显色反应检测层3-1上对应分流层5的分离口11设置结构及位置相同的第一检测区域8-1，显色反应检测层3-1上对应分流层5的引导区域9设置结构及位置相同的非检测区域12，隔离层6上对应显色反应检测层3-1的非检测区域12设置结构及位置相同的隔离口13，电化学检测层3-2上对应隔离层6的隔离口13设置结构及位置相同的第二次检测区域8-2；所述的第二次检测区域8-2内设置工作电极14-1、参比电极14-2及对比电极14-3；

[0068] 所述的工作电极14-1及参比电极14-2设置于第二次检测区域8-2的端部宽为1.5mm；

[0069] 所述的对比电极14-3设置于第二次检测区域8-2的端部宽为2mm；

[0070] 所述的目标区域7为正方形、三角形和圆形，上固定板1中的正方形目标区域7边长为4.5mm，上固定板1中的三角形目标区域7边长为5.5mm，上固定板1中的圆形目标区域7直径为5mm；

[0071] 所述的分流层5中通道长为3mm；

[0072] 所述的上固定板1及下固定板4为PMMA板；

[0073] 一种集成显色和电化学检测的三维纸芯片的制备方法是按以下步骤进行的：

[0074] 一、三维纸芯片的加工：

[0075] ①、首先选择层析纸作为检测层和非检测层，然后用CoreldrawX8软件按检测层和非检测层图案设计丝网印刷版的结构，并制备出相应结构的丝网印刷版；

[0076] 所述的丝网印刷版为200目；

[0077] ②、将步骤一①制备的丝网印刷版置于层析纸上，并将固体蜡透过丝网印刷版，反复摩擦印刷5min，得到印刷有固体蜡的层析纸；

[0078] ③、将印刷有固体蜡的层析纸置于温度为120℃的热板上，加热至固体蜡完全溶解于层析纸中形成疏水区域，得到带有疏水区域的层析纸，将带有疏水区域的层析纸置于室温下冷却，得到检测层和非检测层；

[0079] 二、三维纸芯片的组装：

[0080] ①、对厚度为10μm的薄双面胶进行切割处理，得到切割后的薄双面胶；

[0081] ②、将检测层、非检测层和固定板按设计进行叠放并设置工作电极14-1、参比电极14-2及对比电极14-3，然后利用切割后的薄双面胶进行粘贴，最后用螺栓和螺母进行固定拧紧，即完成一种集成显色和电化学检测的三维纸芯片的制备方法。

[0082] 所述的层析纸为Whatman chromatography paper#1；所述的参比电极14-2由银浆制备而成，所述的工作电极14-1及对比电极14-3由碳浆制备而成；

[0083] 本实施例中引导层2和分流层5之间、显色反应检测层3-1和隔离层6之间设置薄双面胶；其他层面之间仅仅利用上下两端PMMA板，进行物理压紧的方式进行贴合，从而在实验完成后，可以很方便的取出各个检测层进行分析处理，上下端的PMMA板用螺栓和螺母进行固定拧紧。

[0084] 图4为实施例一的集成显色和电化学检测的三维纸芯片的实物图；

[0085] 在本实施例制备的集成显色和电化学检测的三维纸芯片组装之前，需要在检测层提前滴加相应物质的检测试剂。

[0086] 本实施例所述的显色反应检测层3-1上的三角形第一检测区域8-1为葡萄糖的显色检测区域；

[0087] 本实施例所述的显色反应检测层3-1上的正方形第一检测区域8-1为蛋白质的显色检测区域；

[0088] 本实施例所述的显色反应检测层3-1上的圆形第一检测区域8-1为滴加水的对比区域；

[0089] 本实施例所述的电化学检测层3-2上的三角形第二检测区域8-2为葡萄糖的电化学检测区域；

[0090] 检测试剂的配置：

[0091] (1)葡萄糖的显色检测试剂：葡萄糖的显色反应是基于酶的氧化反应将碘化物氧化成碘。当有葡萄糖存在时，颜色将由无色变为棕褐色。在葡萄糖的显色检测区域中，先滴加3微升的浓度为0.6mol/L的碘化钾，然后滴加3微升的含辣根过氧化酶和葡萄糖氧化酶的混合液，在空气中晾干10min后，备用或者进行三维芯片组装；

[0092] 所述的含辣根过氧化酶和葡萄糖氧化酶的混合液是按以下步骤进行的：将辣根过氧化酶和葡萄糖氧化酶加入到pH为6的海藻糖磷酸缓冲液中，得到含辣根过氧化酶和葡萄糖氧化酶的混合液；所述的海藻糖磷酸缓冲液浓度为0.3mol/L；

[0093] 所述的含辣根过氧化酶和葡萄糖氧化酶的混合液中辣根过氧化酶的活力浓度为30U/mL；

[0094] 所述的含辣根过氧化酶和葡萄糖氧化酶的混合液中葡萄糖氧化酶的活力浓度为120U/mL；

[0095] (2)蛋白质的显色检测试剂：对于蛋白质的显色反应则是通过溴酚蓝(TBPB)的显色变化，当TBPB结合到蛋白质时，颜色将从黄色变为绿色。在蛋白质的显色检测区域中，首先滴加3微升浓度为250mmol/L的柠檬酸盐缓冲液，室温下晾干10min，再滴加3微升浓度为9mmol/L的TBPB溶液，最后在室温下晾干10分钟后，备用或者进行三维芯片组装；

[0096] 所述的浓度为250mmol/L的柠檬酸盐缓冲液pH为1.8；所述的浓度为250mmol/L的柠檬酸盐缓冲液中溶剂为水与无水酒精的混合溶液，所述的水与无水酒精的体积比为92:8；所述的浓度为9mmol/L的TBPB溶液的溶剂为体积百分数为95％的酒精。

[0097] (3)电化学检测试剂：首先在电化学检测层3-2中葡萄糖的电化学检测区域内滴加2微升铁氰化钾与葡萄糖氧化酶的混合溶液，在空气中晾干30min后，备用或者进行三维芯片组装；

[0098] 所述的铁氰化钾与葡萄糖氧化酶的混合溶液为将葡萄糖氧化酶加入到浓度为600mmol/L的铁氰化钾中；

[0099] 所述的铁氰化钾与葡萄糖氧化酶的混合溶液中葡萄糖氧化酶的活力浓度为250U/mL；

[0100] 实验操作：

[0101] (1)在三维芯片组装之前，在电化学检测层3-2的第二检测区域8-2内滴加铁氰化钾与氯化钾的混合溶液，铁氰化钾与氯化钾的混合溶液中铁氰化钾的浓度为10mmol/L，铁氰化钾与氯化钾溶液的混合溶液中氯化钾浓度为0.6mol/L，组装后进行电化学测试，图7为在不同扫描速率下，铁氰化钾与氯化钾的混合溶液CV循环伏安特性曲线，1为100mV/s，2为200mV/s，3为300mV/s，4为400mV/s，5为500mV/s；图8为阴极和阳极电流随扫描速率的平方根的变化关系，1为阳极反应电流，2为阴极反应电流；为了验证电化学检测结构的电化学性能，利用CV图对扫描速率的影响进行了分析，结果显示，阴极和阳极电流与扫描速率的平方根呈线性关系，从而揭示了在当且电化学体现中物质传输主要依靠扩散。

[0102] (2)对于蛋白质和葡萄糖的显色反应实验及葡萄糖的电化学检测中：在三维纸芯片组装之前，需要在检测层提前滴加相应物质的检测试剂，显色反应检测层3-1上的三角形第一检测区域8-1滴加葡萄糖的显色检测试剂，显色反应检测层3-1上的正方形第一检测区域8-1滴加蛋白质的显色检测试剂；电化学检测层3-2上的三角形第二检测区域8-2滴加葡萄糖的电化学检测试剂，组装后进行测试；

[0103] ①、分别将25微升葡萄糖、25微升蛋白质和25微升水溶液加在上固定板1的三个目标区域7，所述的正方形的目标区域7滴加25微升蛋白质，所述的三角形的目标区域7滴加25微升的葡萄糖，所述的圆形的目标区域7滴加25微升水溶液；待流体流入芯片3分钟，利用电化学工作站QJ2000对电化学检测层3-2进行电化学检测，基于电流计时方法得到电流随葡萄糖浓度变化的曲线。等显色反应完成后，打开三维芯片，对发生显色反应的检测层进行结果图像的定性或者定量的分析。

[0104] ②、显色反应完成后，对显色图像进行后续处理：首先可以通过肉眼观察显色反应层，通过颜色的变化可以得到定性的分析。其次可以通过照片的简单处理得到显色反应的定量结果。具体步骤如下：用手机进行显色区域的拍照，将照片导入图像处理软件Adobe Photoshop CS6得到检测区域的平均灰度值。对于葡萄糖的显色图像，可将其转化为8位的灰度图像，而对于蛋白质的显色图像，可以将其转化为CMYK颜色模式，来测量青色的平均灰度值。

[0105] ③、观察实验现象并记录。

[0106] ④、实验数据的处理和分析。

[0107] 不断调整葡萄糖和蛋白质的浓度，按实验操作(2)重复进行。

[0108] 图5为实施例一组装前显色反应检测层滴加葡萄糖检测试剂及蛋白质检测试剂，晾干后的效果图；图6为实施例一的三维纸芯片向对应的目标区域分别滴加水、浓度为10mmol/lL葡萄糖和浓度为10μmol/lL蛋白质溶液后显色反应检测层的实验结果图；验证了该结构可以对溶液的有效导向流动，而且减少了交叉污染，验证实施例一的三维纸芯片可以实现灰度分析。基于葡萄糖和蛋白质的显色反应，通过测量检测结果的灰度值，可得到不同浓度蛋白质和葡萄糖下的灰度变化曲线，进而可以用来检测溶液中的葡萄糖和蛋白质含量。

[0109] 在三维纸芯片上，通过电化学工作站对不同浓度的葡萄糖检测得到电流计时图，施加电压为300mV，参比电极14-2为Ag，工作电极14-1及对比电极14-3为C，图9为通过电化学工作站检测不同浓度葡萄糖的电流计时图，1为0mmol/L，2为2mmol/L，3为5mmol/L，4为10mmol/L，5为30mmol/L，6为40mmol/L；图10为在电流计时100s处，阴极电流随葡萄糖浓度的变化曲线。由图可知，基于葡萄糖和葡萄糖氧化酶的反应，通过电流计时方法得到了电流大小随葡萄糖浓度变化的曲线，进而可以较高灵敏度的检测溶液中的葡萄糖含量。