一种嵌套纳米结构可控释放电纺纤维药物载体的制备方法

摘要

一种嵌套纳米结构可控释放电纺纤维药物载体的制备方法。本发明涉及一种可降解且释放可控的高分子载体的制备方法。该方法包括载体粒子的制备、静电纺丝液的配置、纺丝纤维膜的制备和纤维膜后处理四个步骤，所得到的纤维膜能体外敷用，也可植入体内使用，具有良好的生物活性，可降解性，抗菌性和优良的载药性能，且本发明制得的纺丝纤维中包裹的木质素纳米粒子可在纤维膜在降解过程中表现出一定的抗菌性，此外，本发明制备的纤维膜在体液碱性环境下长期服役都能够实现生物降解，这既能保证药物平稳释放，也能使得药物释放充分、彻底。

权利要求

1.一种嵌套纳米结构可控释放电纺纤维药物载体的制备方法，其特征在于，包括载体粒子的制备、静电纺丝液的配置、纺丝纤维膜的制备和纤维膜后处理四个步骤，所述的载体粒子的制备方法为：将硫酸盐木质素和脂溶性的药物按照质量比为20-5:1溶解在四氢呋喃中，制成的硫酸盐木质素浓度为1mg/ml-20mg/ml的有机溶液，将所得有机溶液通过0.22μm的滤膜，除去不溶物；将滤液缓慢加入到搅拌状态下的超纯水中，搅拌速度为300r/min，水与木质素溶液的体积比是1:10-8:1，搅拌10min，将液体以5000r/min离心

10min，取上清液将其放入12-14KDa的透析袋中透析2天，经冷冻干燥后得到载有药物的载体粒子；

所述的静电纺丝液的配置方法为：将制备好的载体粒子使用超声细胞粉碎机于去离子水中分散均匀，其浓度为1-20mg/ml，功率为400-600W，超声时间为0.5-2h,将聚合度为1700的聚乙烯醇加入其中，使其浓度为8%-12%在室温下搅拌4小时，使其充分溶胀，而后升温至

90℃继续搅拌4h，后将温度降至80℃，待温度稳定后将质量比为聚乙烯醇0.7%的聚乙烯吡咯烷酮粉末加入，在80℃下搅拌4h，之后将温度降至室温，而后将配置好的溶液使用超声细胞粉碎机超声0.5h，功率为400-600W；

所述的纺丝纤维膜的制备方法为：采用静电纺丝机，将制备好的静电纺丝液吸入注射器中，安装型号为20的针头，排空气泡，设定电压为10-20V；流速为0.03-0.08mm/min；纺丝距离为13-20cm；湿度为30%；温度为30℃，开始纺丝，12h时间后，得到黄白色纤维膜；

所述的纤维膜后处理方法为：将I型胶原蛋白溶解在3%的乙酸中，浓度配置成1mg/ml-

5mg/ml，在4℃下静置12小时后，搅拌均匀，将制备好的纺丝纤维膜浸泡在静置后的I型胶原溶液中，浸泡时间为5s-40s，而后于60℃下干燥12h。

2.根据权利要求1所述的嵌套纳米结构可控释放电纺纤维药物载体的制备方法，其特征在于，所述的脂溶性药物为紫杉醇、姜黄素、多西他赛、葫芦素中的一种。

3.根据权利要求1所述的嵌套纳米结构可控释放电纺纤维药物载体的制备方法，其特征在于，所述的I型胶原提取于牛跟腱。

4.根据权利要求1所述的嵌套纳米结构可控释放电纺纤维药物载体的制备方法，其特征在于，所述的I型胶原提取于猪皮或者鱼皮。

说明书

一种嵌套纳米结构可控释放电纺纤维药物载体的制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物材料领域，涉及发明一种能用于药物装载的高分子载体的制备方法，具体地涉及一种可降解且释放可控的高分子载体的制备方法。

背景技术

[0002] 纳米技术为许多生物医学应用提供了新的方法，特别是控制药物的运输。药物运输载体的应用可以提高治疗效率，减小毒副作用。目前已经有了纳米粒子和水凝胶等作为药物运输载体的相关报道。其中单独的纳米粒子作为运输载体存在一定的突释现象，并且药物释放时间短，一些载体材料的降解性成为问题；水凝胶作为药物载体需要一定的交联，而交联的过程降低了材料的生物相容性。

[0003] 常见的载体材料包括介孔二氧化硅纳米粒子、明胶纳米粒子、聚乳酸纤维等。虽然这些载体材料的应用相对于直接给药的方式来说已经具有一定的功效，但是仍存在一些问题，例如，二氧化硅纳米粒子不可降解，易造成体内沉积，而明胶纳米粒子和聚乳酸纤维等由于其结构尺度单一，药物在释放过程中往往存在突释现象。

[0004] 近年，有报道在木材中发现的天然聚合物—木质素，这是继纤维素之后的第二多生物质的聚合物。目前商业木质素主要应于作为填充物、添加剂、粘合剂等。由于它的来源，木质素很多生物友好性质，如生物可降解性，生物相容性，抑菌性等，并且木质素本身具有一定的抗癌效果，这些性质引起了生物材料领域学者的关注。目前已有学者将其制备成纳米颗粒应用于药物运输领域，但是由于其降解速度过快，有一定突释现象，并且药物释放时间较短限制了其在药物运输领域的应用，如何简单高效地制备出粒径均一，可控大小的木质素纳米粒子也是一个问题。

发明内容

[0005] 基于背景技术存在的问题,本发明提供了一种可降解且释放可控的胶原基高分子载体的制备方法，该方法包括载体粒子的制备、静电纺丝液的配置、纺丝纤维膜的制备和纤维膜后处理，所得到的纤维膜具有良好的生物活性，可降解性，抗菌性和优良的载药性能。

[0006] 具体的包括以下步骤：

[0007] （1）载体粒子的制备：将硫酸盐木质素和脂溶性的药物按照质量比为20-5:1溶解在四氢呋喃中，制成的硫酸盐木质素浓度为1mg/ml-20mg/ml的有机溶液，将所得有机溶液通过0.22μm的滤膜，除去不溶物；将滤液缓慢加入到搅拌状态下的超纯水中，搅拌速度为300r/min，水与木质素溶液的体积比是1:10-8:1，搅拌10min，将液体以5000r/min离心
10min，取上清液将其放入12-14KDa的透析袋中透析2天，经冷冻干燥后得到载有药物的载体粒子。

[0008] （2）静电纺丝液体的配置：将步骤（1）制备的载体粒子使用超声细胞粉碎机于去离子水中分散均匀，其浓度为1-20mg/ml，功率为400-600W，超声时间为0.5-2h,将聚合度为1700的聚乙烯醇（PVA）加入其中，使其浓度为8%-12%在室温下搅拌4小时，使其充分溶胀，而后升温至90℃继续搅拌4h，后将温度降至80℃，待温度稳定后将质量比为PVA0.7%的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）粉末加入，在80℃下搅拌4h，之后将温度降至室温，而后将配置好的溶液使用超声细胞粉碎机超声0.5h，功率为400-600W。

[0009] （3）纺丝纤维膜的制备：

[0010] 采用静电纺丝机，将步骤（2）制备好的液体吸入注射器中，安装型号为20的针头，排空气泡，设定电压为10-20V；流速为0.03-0.08mm/min；纺丝距离为13-20cm；湿度为30%；温度为30℃，开始纺丝，12h时间后，得到黄白色纤维膜。

[0011] （4）纤维膜的后处理：将I型胶原蛋白溶解在3%的乙酸中，浓度配置成1mg/ml-5mg/ml，在4℃下静置12小时后，搅拌均匀，将步骤（3）中制备的纺丝纤维膜浸泡在静置后的I型胶原溶液中，浸泡时间为5s-40s，而后于60℃下干燥12h。

[0012] 上述药物是紫杉醇、姜黄素、多西他赛、葫芦素等中的一种。

[0013] 上述I型胶原蛋白是从牛跟腱中提取的I型胶原蛋白、从猪皮中提取的I型胶原蛋白、鱼皮中提取的I型胶原蛋白中的一种。

[0014] 与现有的技术相比，本发明的有益效果为：

[0015] （1）本发明纤维膜经后处理后，表面包裹了一层胶原膜，使得本发明所制备的纤维膜具有良好的生物活性，因此本发明所制得的纤维膜既能体外敷用，也可植入体内使用。

[0016] （2）本发明所采用的原料有胶原、木质素、PVP和低分子量的PVA，在体液碱性环境下长期服役都能够实现生物降解，这既能保证药物平稳释放，也能使得药物释放充分、彻底。

[0017] （3）本发明制得的纺丝纤维中包裹的木质素纳米粒子可在纤维膜在降解过程中表现出一定的抗菌性。

附图说明

[0018] 图1 实施例1载体粒子的电镜扫描图。

[0019] 图2 实施例1负载载体粒子的静电纺丝电镜扫描图。

[0020] 图3 实施例1后处理之后纺丝纤维膜的电镜扫描图。

[0021] 图4 实施例1-5的紫杉醇释放曲线。

[0022] 图5 实施例1-5纺丝纤维膜抑菌效果图。

[0023] 图6 实施例1的后处理之后纺丝纤维膜的降解电镜扫描图。

具体实施方式

[0024] 实施例1

[0025] （1）将硫酸盐木质素和紫杉醇按照质量比为10:1溶解在四氢呋喃中，制成的硫酸盐木质素浓度为10mg/ml的有机溶液，将所得有机溶液通过0.22μm的滤膜，除去不溶物；将滤液缓慢加入到搅拌状态下的超纯水中，搅拌速度为300r/min，水与木质素溶液的体积比是4:1，搅拌10min，将液体以5000r/min离心10min，取上清液将其放入12-14KDa的透析袋中透析2天，经冷冻干燥后得到载有药物的载体粒子，图1为所得载体粒子的电镜扫描图，可以看出所得载体粒子大小均匀，形状统一。

[0026] （2）将步骤（1）制备的载体粒子使用超声细胞粉碎机于去离子水中分散均匀，其浓度为10mg/ml，在600W功率下，超声1h,将聚合度为1700的聚乙烯醇（PVA）加入其中，使其质量体积比10%，在室温下搅拌4小时，使其充分溶胀，而后升温至90℃继续搅拌4h，再将温度降至80℃，待温度稳定后将质量比为PVA0.7%的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）粉末加入，在80℃下搅拌4h，之后将温度降至室温；将配置好的溶液使用超声细胞粉碎机超声0.5h，功率为600W。

[0027] （3）将上述配置好的液体吸入注射器内，安装型号为20的针头，排空气泡，设定电压为12KV，流速为0.04mm/min，距离为17cm，纺丝12h后，将纤维膜放在真空干燥箱中60℃干燥12h，即可得到图2中所示的纺丝纤维膜，图中黑色方框中为嵌套的载体粒子。

[0028] （4）将牛跟腱中提取的I型胶原蛋白溶解在3%的乙酸中，浓度配置成2mg/ml，在4℃下静置12小时后，搅拌均匀，将步骤（3）中制备的纺丝纤维膜浸泡在静置后的I型胶原溶液中，浸泡时间为40s，而后于60℃下干燥12h。

[0029] 将步骤（4）得到的纺丝纤维膜按照如下步骤进行药物释放检测：在进行体外药物释放前首先对药物紫杉醇进行标准曲线的绘制，用四氢呋喃配制出浓度分别为100mg/L,50mg/L,25mg/L,10mg/L,5mg/L,2mg/L,1mg/L的紫杉醇溶液，用高效液相色谱仪对其进行检测，其中参数设置为：流动相：V乙腈：V水=50:50；波长：紫外检测器波长227nm；色谱柱：C18；
流速：1ml/min；进样量：5μl。根据测得的峰面积绘制不同浓度下的峰面积和浓度的标准曲线图。接着进行载药木质素纳米粒子的载药量测定：用四氢呋喃将载药木质素进行破乳，制成溶液浓度为0.2mg/ml，将溶液按上述参数用高效液相色谱仪进行检测，再根据提前建好的紫杉醇的标准曲线，算出该载药胶束浓度下紫杉醇的浓度，按照下面公式计算出载药量；
载药量%=  ，然后进行静电纺丝纤维膜的药
物释放实验。取步骤（4）所述的纤维膜10mg，放入15ml的PBS缓冲液中，其中缓冲液中加入
0.5%的吐温-80，密封好放入摇床中，37℃，100rmp，在预设的时间点取1ml的释放液体，再加入1ml新鲜的缓释液，用高效液相色谱仪进行检测。计算出累计释放量。得到载药量所得结果见图4中木质素含量为10%的结果，可以看出药物释放比较缓慢，没有突释现象。

[0030] 将步骤（4）得到的纺丝纤维膜按照如下步骤进行抗菌实验：

[0031] 首先进行实验所需溶液的配制（YDP培养基、营养琼脂）。YDP培养基：称取酵母粉2g、蛋白胨4g、葡萄糖4g依次加入到200ml的去离子水中，充分摇匀，放入到250ml的锥形瓶中，包好备用。营养琼脂：在配制YDP培养基的基础上加入2.5g琼脂和0.5%的吐温-80，充分摇匀。

[0032] 然后进行大肠杆菌的接种及悬菌液的配制，接种前先对操作台（75%的酒精擦拭+紫外灯灭菌30min）以及实验所用玻璃器皿和溶液（高温高压灭菌锅）进行灭菌。大肠杆菌的接种：将接种环放置在酒精灯的火焰上方，从大肠杆菌原菌种内，挑出一个典型的菌落，然后在已凝固好了的营养琼脂上面画线，接种完毕后将营养琼脂培养皿放在 37℃的恒温培养箱中培养 24h-48h。

[0033] 悬菌液制备：将约 20m L 的YDP培养液倒入试管中，用接种环从上述接种细菌中选取一个菌落置于YDP培养液中，然后将其放在37 ℃的震荡水浴锅中进行震荡培养18 20 ~h，观察到溶液变浑浊，这便得到了下面实验即将用到的大肠杆菌悬菌液。

[0034] 最后抑菌圈实验，将静电纺丝纤维膜裁成直径为9mm的圆片，紫外灯下灭菌一晚。将上述配制的营养琼脂于高温高压灭菌锅中煮沸灭菌向已灭菌的培养皿中倒入营养琼脂大约 15ml～20ml，室温条件下凝固备用。取1ml的上述悬菌液均匀涂在营养琼脂上，将制备的样品贴在已涂有菌液的培养基表面上，置于37℃恒温箱，培养8-12h。所得结果见图5中木质素含量为10%的结果，可以看出复合纤维膜具有一定的抑菌效果。

[0035] 将步骤（4）得到的纺丝纤维膜按照如下步骤进行降解实验：在250ml的锥形瓶中加入PBS溶液100ml,将方形试样完全浸入其中，置于37℃，100rpm的摇床中，PBS溶液每周更换新的，取15天的纤维膜于烘箱中60℃干燥12h，观察形貌，所得结果见图6，图a是原始电纺纤维，图b为降解15天之后的电纺纤维形貌，可以看出纤维膜在降解15天时出现了溶胀现象，纤维逐渐消失断裂。

[0036] 实施例2-5

[0037] 除木质素浓度外，其他工艺参数和实施例1相同，实施例2-5木质素加入比例见表1[0038] 表1 实施例2-5木质素浓度

[0039]

[0040] 实施例2-5所得到的纺丝纤维膜微观结构与实施例1一致。

[0041] 实施例2-5药物释放和抑菌实验分别见图4和5。

[0042] 对比说明随着载药木质素纳米颗粒的增加，药物释放速度逐渐增加，但这几种均无突释现象；抑菌圈的直径随着载药木质素含量的增加而增加，及抑菌效果增加。

[0043] 实施例6-8

[0044] 除PVA浓度外，其他工艺参数和实施例1相同，实施例6-8PVA浓度含量见表2[0045] 表2 实施例6-8PVA浓度

[0046]

[0047] 实施例6-8制备的纺丝纤维膜微观结构与实施例1一致，其抑菌性、降解性能、药物释放性能均良好。

[0048] 实施例9-12

[0049] 除步骤（3）纺丝电压外，其他工艺参数和实施例1相同，实施例9-12纺丝电压见表3[0050] 表3 实施例9-12纺丝电压

[0051]

[0052] 实施例9-12制备的纺丝纤维膜微观结构与实施例1一致，其抑菌性、降解性能、药物释放性能均良好。

[0053] 实施例13-15

[0054] 除步骤（3）纺丝流速外，其他工艺参数和实施例1相同，实施例13-15纺丝流速见表4

[0055] 表4 实施例13-15纺丝流速

[0056]

[0057] 实施例13-15制备的纺丝纤维膜微观结构与实施例1一致，其抑菌性、降解性能、药物释放性能均良好。

[0058] 实施例16-18

[0059] 除步骤（3）纺丝距离外，其他工艺参数和实施例1相同，实施例16-18纺丝距离见表5

[0060] 表5 实施例16-18纺丝距离  实施例16 实施例17 实施例18
纺丝距离 13cm 15cm 20cm

[0061] 实施例16-18制备的纺丝纤维膜微观结构与实施例1一致，其抑菌性、降解性能、药物释放性能均良好。

[0062] 实施例19-20

[0063] 除步骤（4）胶原浓度外，其他参数和实施例1相同，实施例19-20胶原浓度见表6[0064] 表6 实施例19-20胶原浓度

[0065]

[0066] 实施例19-20制备的纺丝纤维膜微观结构与实施例1一致，其抑菌性、降解性能、药物释放性能均良好。

[0067] 实施例21

[0068] （1）将硫酸盐木质素和紫杉醇按照质量比为20:1溶解在四氢呋喃中，制成的硫酸盐木质素浓度为20mg/ml的有机溶液，将所得有机溶液通过0.22μm的滤膜，除去不溶物；将滤液缓慢加入到搅拌状态下的超纯水中，搅拌速度为300r/min，水与木质素溶液的体积比是8:1，搅拌10min，将液体以5000r/min离心10min，取上清液将其放入12-14KDa的透析袋中透析2天，经冷冻干燥后得到载有药物的载体粒子。

[0069] （2）将步骤（1）制备的载体粒子使用超声细胞粉碎机于去离子水中分散均匀，其浓度为20mg/ml，在400W功率下，超声0.5h,将聚合度为1700的聚乙烯醇（PVA）加入其中，使其质量体积比10%，在室温下搅拌4小时，使其充分溶胀，而后升温至90℃继续搅拌4h，再将温度降至80℃，待温度稳定后将质量比为PVA0.7%的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）粉末加入，在80℃下搅拌4h，之后将温度降至室温；将配置好的溶液使用超声细胞粉碎机超声0.5h，功率为400W。

[0070] （3）将上述配置好的液体吸入注射器内，安装型号为20的针头，排空气泡，设定电压为12KV，流速为0.04mm/min，距离为17cm，纺丝12h后，将纤维膜放在真空干燥箱中60℃干燥12h。

[0071] （4）将从猪皮中提取的I型胶原溶解在3%的乙酸中，浓度配置成2mg/ml，在4℃下静置12小时后，搅拌均匀，将步骤（3）中制备的纺丝纤维膜浸泡在静置后的I型胶原溶液中，浸泡时间为5s，而后于60℃下干燥12h。

[0072] 实施例22

[0073] （1）将硫酸盐木质素和紫杉醇按照质量比为5:1溶解在四氢呋喃中，制成的硫酸盐木质素浓度为1mg/ml的有机溶液，将所得有机溶液通过0.22μm的滤膜，除去不溶物；将滤液缓慢加入到搅拌状态下的超纯水中，搅拌速度为300r/min，水与木质素溶液的体积比是1:10，搅拌10min，将液体以5000r/min离心10min，取上清液将其放入12-14KDa的透析袋中透析2天，经冷冻干燥后得到载有药物的载体粒子。

[0074] （2）将步骤（1）制备的载体粒子使用超声细胞粉碎机于去离子水中分散均匀，其浓度为10mg/ml，在600W功率下，超声2h,将聚合度为1700的聚乙烯醇（PVA）加入其中，使其质量体积比12%，在室温下搅拌4小时，使其充分溶胀，而后升温至90℃继续搅拌4h，再将温度降至80℃，待温度稳定后将质量比为PVA0.7%的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）粉末加入，在80℃下搅拌4h，之后将温度降至室温；将配置好的溶液使用超声细胞粉碎机超声0.5h，功率为400W。

[0075] （3）将上述配置好的液体吸入注射器内，安装型号为20的针头，排空气泡，设定电压为12KV，流速为0.04mm/min，距离为17cm，纺丝12h后，将纤维膜放在真空干燥箱中60℃干燥12h。

[0076] （4）将鱼皮中提取的I型胶原蛋白溶解在3%的乙酸中，浓度配置成1mg/ml，在4℃下静置12小时后，搅拌均匀，将步骤（3）中制备的纺丝纤维膜浸泡在静置后的I型胶原溶液中，浸泡时间为20s，而后于60℃下干燥12h。

[0077] 实施例22制备的纺丝纤维膜微观结构，经实验检测证实其与实施例1一致，其抑菌性、降解性能、药物释放性能均良好。