葡萄醋氧化醋酸菌及其应用

摘要

本发明公开了一种葡萄醋氧化醋酸菌(Acetobacter oxydans)缪1.1610，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏登记号为CGMCC No.14778。还公开了一种酿醋氧化醋酸菌制剂，活性成分为葡萄醋氧化醋酸菌缪1.1610。还公开了葡萄醋氧化醋酸菌缪1.1610在葡萄醋或其它果醋的酿造中的应用。利用葡萄蒸馏酒余液酿制葡萄醋，将可能严重污染环境的蒸馏酒余液“变废为宝”，既能减轻对环境的压力，又可增加经济效益。采用的葡萄醋氧化醋酸菌缪1.1610，解决了葡萄醋酿制工艺中因使用普通醋酸菌专一性不强、特异性不明显，导致醋体不协调、醋的葡萄果风味不浓、香气不纯正问题。

权利要求

1.一种葡萄醋氧化醋酸菌(Acetobacter oxydans)缪1.1610，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏登记号为CGMCC No.14778。

2.根据权利要求1所述的葡萄醋氧化醋酸菌，其特征在于：菌落形态：中间乳白色，周边白色，边缘不整齐，隆起；单细胞大小：0.8-0.9μm×1.0-4.0μm；适宜的培养温度：31～33℃；

适宜的培养pH值：4～6.5。

3.一种酿醋氧化醋酸菌制剂，其特征在于：所述制剂的活性成分为权利要求1所述葡萄醋氧化醋酸菌(Acetobacter oxydans)缪1.1610。

4.如权利要求1所述的葡萄醋氧化醋酸菌缪1.1610在葡萄醋的酿造中的应用。

5.如权利要求1所述的葡萄醋氧化醋酸菌缪1.1610在果醋的酿造中的应用。

说明书

葡萄醋氧化醋酸菌及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种葡萄醋氧化醋酸菌及其应用，属于微生物工程领域。

背景技术

[0002] 在水果蒸馏酒生产中，蒸馏后的余液量大而富含营养，直接排放必然会严重污染环境，无害化处理的成本极高且效果并不理想，这是业内客观存在的顽疾。它所导致的水体、土壤的大面积污染，不但严重制约着行业的发展，而且直接给环境造成压力。

[0003] 在酿醋工业中，醋酸菌所分泌的乙醇脱氢酶在有氧环境中将乙醇氧化为乙醛，进而将乙醛氧化为乙酸(醋酸)。但不同种类、不同来源的醋酸菌对酿醋原料的发酵能力差异很大，所生成的醋酸的含量、口感也有很大的差异。现在的酿制果醋的生产用菌种，一般采用酿制粮食醋的醋酸菌，用于生产的醋酸菌种缺乏专一性，导致果醋应具有的水果香气不明显、风味不突出。需要选育具备葡萄果醋优良品质的专一性强的菌株。

[0004] 葡萄果醋，是用葡萄作为直接或间接原料，经过采用现代化生物技术进行酿制，进而形成的一种酸味饮料，该饮料含有独特的风味以及丰富的营养，葡萄果醋同时具备水果与食醋的营养保健作用，以及丰富的维生素和有机酸。能够有效调节血脂，抗氧化等功能。

发明内容

[0005] 针对上述问题，本发明的目的是提供一种能够变废为宝的葡萄醋氧化醋酸菌及其应用。

[0006] 为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

[0007] 一种葡萄醋氧化醋酸菌(Acetobacter oxydans)缪1.1610，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏登记号为CGMCC No.14778。

[0008] 所述的葡萄醋氧化醋酸菌，菌落形态：中间乳白色，周边白色，边缘不整齐，隆起；单细胞大小：0.8-0.9μm×1.0-4.0μm；适宜的培养温度：31～33℃；适宜的培养pH值：4～
6.5。

[0009] 一种酿醋氧化醋酸菌制剂，所述制剂的活性成分为权利要求1所述葡萄醋氧化醋酸菌(Acetobacter oxydans)缪1.1610。

[0010] 本发明还提供了葡萄醋氧化醋酸菌缪1.1610在葡萄醋或其它果醋的酿造中的应用。

[0011] 本发明的有益效果是：利用葡萄蒸馏酒余液酿制葡萄醋，将可能严重污染环境的蒸馏酒余液“变废为宝”，既能减轻对环境的压力，又可增加经济效益。

[0012] 采用的葡萄醋氧化醋酸菌缪1.1610，解决了葡萄醋酿制工艺中因使用普通醋酸菌专一性不强、特异性不明显，导致醋体不协调、醋的葡萄果风味不浓、香气不纯正问题。采用此方法既能“变废为宝”，又能在果醋中较好地保留葡萄果的特定香气及风味。使用本发明方法生产的葡萄果醋中的葡萄果风味浓郁，醋体醇厚，几无不良生理反应，保质期长，适量饮用有益人体健康。

附图说明

[0013] 图1为葡萄醋氧化醋酸菌缪1.1610平板分离图。

[0014] 图2为葡萄醋氧化醋酸菌缪1.1610斜面试管图。

[0015] 图3为葡萄醋氧化醋酸菌缪1.1610显微镜下1600倍观察图。

具体实施方式

[0016] 实施例1获得葡萄蒸馏酒余液

[0017] 一、葡萄野生酵母菌的分离、提纯

[0018] 将葡萄鲜果破碎后在29～31℃条件下增殖培养48小时，获得具有较多个体的葡萄野生酵母增殖培养液。将得到的增殖培养液按10倍、20倍、40倍、80 倍、160倍、320倍、640倍七个浓度梯度用无菌蒸馏水稀释，然后分别涂布于平板选择培养基上(平板选择培养基配方：4～5°Bé鲜葡萄果浆滤液24.5％、4°Bé麦芽汁24.5％、4°Bé大豆汁24.5％、4°Bé土豆汁24.5％、琼脂2％)，每个稀释浓度梯度的培养液做4个平板，采用“平板划线法”分离出数十个葡萄野生酵母菌的单细胞菌落。根据野生酵母菌的单细胞菌落的菌落形态、单细胞个体形态、长势等，选择五个健壮的纯菌株分别移接至50ml试管斜面成为一级菌种，得到6株野生酵母纯菌株，分别命名为第1、2、3、4、5、6号葡萄野生酵母。平板选择培养基上筛选得到的葡萄野生酵母菌，菌落呈圆形，乳白色，边缘整齐，凸起。将得到的葡萄野生酵母菌置于640倍显微镜下观察，可见细胞呈椭圆形。

[0019] 二、葡萄野生酵母菌纯菌株的性能测定小型试验

[0020] 1试验目的

[0021] 验证分离得到的六个葡萄野生酵母菌菌株发酵能力及产酒效果。

[0022] 2试验材料和方法

[0023] 新鲜葡萄(品种为阳光玫瑰)18千克，去除果蒂、梗并打浆后得葡萄浆液 14.0千克，分为7个试验样本，每个试验样本用量为2.0千克。其中6个试验样本用于实施例1中的6株葡萄野生酵母作为实验组，另外1个样本用于市售商品意大利“英纳帝斯”(Enartis)葡萄酒活性干酵母作为对照。向每个葡萄浆液试验样本中接种新鲜麸皮酵母10.0克，接种量为0.5％(实验组中加入的新鲜麸皮酵母分别由实施例1中第1、2、3、4、5、6号葡萄野生酵母制备得到，对照组中的新鲜麸皮酵母由“英纳帝斯”葡萄酒活性干酵母制备得到)。充分混匀后置于 25℃发酵15天。

[0024] 新鲜麸皮酵母制备方法：1)向实施例1中装有葡萄野生酵母菌一级菌种的 50ml试管中加入30ml无菌水，轻轻摇晃后将液体吸出待用。2)将100克葡萄浆液、100克麸皮混匀后115℃灭菌30分钟，取出冷却至常温，加入步骤1)得到的葡萄酵母菌液体5ml，28～30℃培养
60～72h，(其间在24小时、8小时各摇瓶1次)即得到新鲜麸皮酵母。对照“英纳帝斯”葡萄酒酵母的新鲜麸皮酵母也按照此方法制得。

[0025] 3试验结果

[0026] 将上述7个试验样本25℃发酵25天后进行蒸馏，每株葡萄野生酵母均有较强的产酒能力。在分别蒸馏出200毫升等量酒液的基础上测定酒精度，测得第1、2、 3、4、5、6号葡萄野生酵母和“英纳帝斯”葡萄酒酵母制得的白酒的酒精度依次为： 48、45、46、49、47、51、50(对照)，可见第6号葡萄野生酵母菌株与对照“英纳帝斯”葡萄酒酵母的发酵能力最为接近。同时对酒液的香气、风味等感官指标组织相关人员进行了“盲评”，一致认为第6号野生菌株最有特色且明显优于对照菌株“英纳帝斯”。

[0027] 三、葡萄野生酵母菌纯菌株(缪2.1609)的性能测定中型试验

[0028] 1试验目的

[0029] 用分离、筛选出的第6号葡萄野生酵母菌(缪2.1609)在小型试验的基础上开展中型试验，以便进一步验证该野生酵母菌菌株的性能(色泽、风味、产酒能力等)。

[0030] 2试验材料和方法

[0031] 取实施例2中由第1、2、3、4、5、6号6株葡萄野生酵母菌株中选择出的第6号菌株(缪2.1609)制备得到的新鲜麸皮酵母2.5千克(接种量0.5％)、葡萄浆液50千克，充分混匀后常温条件下(9月份)发酵25天。同时以“英纳帝斯”葡萄酒酵母同样处理作对照。

[0032] 3试验结果

[0033] 常温下发酵15天后，第6号野生酵母菌株(缪2.1609)得到53度蒸馏白酒7千克(出品率14.0％)，对照菌株得到53度蒸馏白酒6.5千克(出品率13.0％)，产酒能力优于对照菌株“英纳帝斯”。

[0034] 同时组织了对相关感官指标的鉴定，用葡萄野生酵母6号菌株(缪2.1609) 制得的蒸馏白酒酒液色泽清晰透明、葡萄风味浓郁、幽雅，味道纯正，入口无刺激感，酒体醇厚，挂杯明显，人饮后不上头，几无不良生理反应，明显优于对照菌株。

[0035] 四、制备鲜食葡萄蒸馏酒

[0036] 1)鲜食葡萄蒸馏酒的制备方法，按照如下工艺流程：

[0037] 鲜食葡萄去除梗、蒂→→原料破碎(得到葡萄浆液)→→接种酵母菌→→发酵15～20天(发酵温度前三天控制在25～28℃增殖培养并伴以间歇搅拌，以利菌体细胞大量增殖，三天后控制在22～23℃，静置发酵以利产酒)→→检测发酵液理化指标→→过滤得到发酵滤液→→第一次蒸馏→→初酒→→第二次蒸馏(分段取酒)→→半成品理化指标检测→→半成品酒→→窖藏陈酿→→成品

[0038] 具体按照如下步骤操作：

[0039] A、制作缪2.1609葡萄酵母菌菌株二级、三级种子

[0040] 将该菌株的纯培养按前述方法制作2.5千克麸皮酵母二级种子。

[0041] 制备5千克鲜葡萄液，与6千克新鲜麸皮拌合均匀，100℃常压维持60分钟灭菌，自然冷却至常温，入种子罐接种2.5千克麸皮酵母二级种子，25℃间歇摇罐通氧，培养60～72小时，得12.5千克麸皮酵母三级种子。

[0042] B、接种

[0043] 在装有1000千克鲜葡萄液的不锈钢发酵罐内接入12.5千克第6号葡萄野生酵母菌菌株的麸皮酵母三级种子，接种量为1.25％。

[0044] C、发酵

[0045] 前三天维持在25～28℃增殖培养并间歇搅拌(每天搅拌三次，每次30分钟)，以促进菌体细胞增殖，确保发酵所需足够的菌体数量。以后维持22～23℃静置发酵15～20天。

[0046] D、检测发酵液的理化指标

[0047] 检测发酵液的酒精度、pH、还原糖等理化指标，以确定发酵终点。

[0048] 酒精含量10％以上、pH3～3.5、还原糖(残糖)0.4g/100ml以下即可终止发酵。(还原糖测定采用亚铁氰化钾法；酒精测定采用比重法；酸度测定采用酸度计法)。

[0049] E、过滤、蒸馏

[0050] 采用发酵罐本体自流法自行过滤。滤液按两次蒸馏的方法取酒。

[0051] 蒸馏方法如下：

[0052] a、第一次蒸馏：将发酵液在90～92℃进行蒸馏，当酒精度为35度时终止蒸馏。剩下的蒸馏余液即为用于制作葡萄醋的原料。

[0053] b、第二次蒸馏：蒸馏对象是第一次蒸馏得到的初酒，蒸馏温度为90～92℃，采取分段取酒的方法：分为三段：第一段为“头子酒”，酒体内含有较多的杂醇油，味道较苦涩，量少，收集出液处酒精度测量装置显示70～76度的白酒，主要用于调配酒；第二段为“中心酒”，是蒸馏酒的主体，量大，酒精度一般在58～70 度之间，味道较为纯正，需要加入一定量的蒸馏水配制成成品酒；第三段为“原浆酒”，量较少，酒精度在53～58度之间，因其具备不用调配(勾兑)可以直接饮用的特点，故称其为“原浆酒”。当酒精浓度低于53度时即可终止蒸馏，余液参与下一锅蒸馏，第二锅接第一锅的尾酒，第三锅接第二锅的尾酒，以此类推(即循环蒸馏)。

[0054] 在生产的同时采用菌种意大利“英纳帝斯”(Enartis)商品葡萄酒活性干酵母参照上述方法制备葡萄蒸馏酒，接种量为20g/100L(万分之二)，投料量、发酵条件、过滤、蒸馏与上述处理相同。

[0055] 2)试验结果

[0056] 处理(第6号葡萄野生酵母菌纯菌株即缪2.1609)：综合折算产53度蒸馏白酒135千克，出品率为13.5％。酒液色泽清晰透明，葡萄风味浓郁、幽雅，味道纯正，入口无刺激感，酒体醇厚，挂杯明显，人饮后不上头，几无不良生理反应。缪2.1609已由中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC) 进行保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2017年10 月11号，保藏编号为CGMCC No.14779，分类名为Saccharomyces cerevisiae。

[0057] 对照(意大利“英纳帝斯”(Enartis)商品葡萄酒活性干酵母：综合折算产53度蒸馏白酒128千克，出品率为12.8％。酒液色泽清晰透明、葡萄香气单薄、味道较纯正，入口刺激感弱，酒体较醇厚，挂杯较明显。

[0058] 两相比较，自行选育的第6号葡萄野生酵母菌菌株缪2.1609优于对照菌株意大利“英纳帝斯”(Enartis)。根据小试、中试、试生产各项性能综合测定结果，我们认为，缪2.1609在鲜食葡萄蒸馏白酒的生产中具有明显的优势。

[0059] 实施例2利用葡萄蒸馏酒余液酿制葡萄醋

[0060] 一、葡萄野生醋酸菌的分离、提纯

[0061] 将葡萄鲜果破碎后在30～33℃条件下增殖培养48小时，获得具有较多个体的葡萄野生醋酸菌增殖培养液。将得到的增殖培养液按10倍、20倍、40倍、 80倍、160倍、320倍、640倍七个浓度梯度用无菌蒸馏水稀释，然后分别涂布于平板选择培养基上(平板选择培养基配方：3-4Bé葡萄汁90毫升、酵母膏1％碳酸钙2％、65度酒精10毫升、琼脂2.2％)，每个浓度梯度的培养液做4个平板，采用“平板划线法”分离出数十个葡萄野生醋酸菌的单细胞菌落。

[0062] 根据葡萄野生醋酸菌单细胞菌落的菌落形态、单细胞个体形态、长势等，选择五个健壮的纯菌株分别移接至50ml试管斜面成为一级菌种，得到5株野生酵母纯菌株，分别命名为第1、2、3、4、5号葡萄野生醋酸菌。如图1、2所示，为平板选择培养基上筛选得到的葡萄野生醋酸菌，菌落中间乳白色，周边白色，边缘不整齐，隆起，直径为2～4mm，单细胞大小：0.8-0.9μm×1.0-4.0μm。

[0063] 将得到的葡萄野生醋酸菌置于1600倍显微镜下观察，如图3所示，可见细胞呈均匀分散的短杆状的单细胞。

[0064] 二、葡萄野生醋酸菌纯菌株的性能测定及葡萄酒蒸馏余液发酵效果小型试验[0065] 1试验目的

[0066] 验证分离得到的五个野生葡萄野生醋酸菌菌株发酵能力及葡萄酒蒸馏余液发酵产醋效果。

[0067] 2试验材料和方法

[0068] 取按照实施1的方法得到的酒精度3％vol(经调整至6％vol)，总酸(以醋酸计)1.6g/100ml的葡萄酒蒸馏余液12升，分为6个试验样本，每个试验样本用量为2.0升。其中5个试验样本用于前述的5株葡萄野生醋酸菌作为实验组，另外 1个样本用于市售商品AS1.41醋酸菌作为对照组。往1～5号实验组每个葡萄蒸馏酒蒸馏余液试验样本中接种葡萄野生醋酸菌种子菌悬液200毫升(200个菌体 /毫升)，充分混匀；对照组亦同样操作。置于发酵室保温31～33℃，发酵20天，每天搅拌通氧三次，每次5分钟。发酵的终止指标为：检测发酵液酒精度0.1％vol 以下、乙酸达到3.5g％100ml以上。

[0069] 其中，种子菌悬液的制备：葡萄糖1％、酵母膏1％、新鲜的葡萄蒸馏酒蒸馏余液96％，115℃灭菌30分钟，冷却至常温后加入75％酒精2.5％，混匀接种后置于31～33℃的培养箱3天(每天搅拌通氧6次，每次5分钟)。

[0070] 3试验结果

[0071] 将上述6个试验样本31-33℃发酵20天后，每株葡萄野生醋酸菌均有较强的产酸能力。经检测：第1、2、3、4、5号葡萄野生醋酸菌的发酵液总酸(以乙酸计)依次为：3.2g/100ml、2.9g100ml、3.0g/100ml、3.4g/100ml、3.6g/100ml；第6号(对照)3.5g/100ml。可见第5号葡萄野生醋酸菌菌株与对照AS1.41醋酸菌菌株的发酵产酸能力最为接近。

[0072] 三、葡萄野生醋酸菌纯菌株的性能测定及葡萄酒蒸馏余液发酵效果中型试验[0073] 1试验目的

[0074] 将分离筛选出的葡萄野生醋酸菌纯菌株和葡萄酒余液在小型试验的基础上开展中型试验，以便进一步验证该菌株和葡萄酒余液的发酵性能(色泽、风味、产醋酸能力等)。

[0075] 2试验材料和方法

[0076] 用前面筛选出的第5号葡萄野生醋酸菌菌株制备种子菌悬液5升；同时制备对照AS1.41种子菌悬液5升。

[0077] 取实施例1中得到的经调整至酒精度6％vol，总酸(以乙酸计)1.6g/100ml 的葡萄酒蒸馏余液50升，接种第5号葡萄野生醋酸菌菌株种子菌悬液5升(处理)。

[0078] 取酒精度6％vol，总酸(以乙酸计)1.6g/100ml的葡萄酒蒸馏余液50升，接种AS1.41种子菌悬液5升(对照)。

[0079] 将处理和对照均置于31～33℃的培养室发酵20天，其间每天用微型水泵循环通氧4次，每次30～60分钟。

[0080] 3试验结果

[0081] 理化检测：发酵20天后，第5号葡萄野生醋酸菌纯菌株发酵液的总酸(以乙酸计)由1.6g/100ml上升至3.6g/100ml；对照AS1.41醋酸菌的总酸为3.5 g/100ml。

[0082] 感官鉴定：用第5号葡萄野生醋酸菌纯菌株制得的醋液色泽为亮丽的粉红色、葡萄香气浓郁、味道纯正，优于对照AS1.41。

[0083] 将第5号葡萄野生醋酸菌纯菌株命名为缪1.1610，由中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)进行保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2017年10月11号，保藏编号为CGMCC NO.14778，分类命名为Acetobacter oxydans。

[0084] 四、葡萄野生醋酸菌纯菌株的性能测定及葡萄酒蒸馏余液发酵试生产实验[0085] 1试验目的

[0086] 将分离筛选出的葡萄野生醋酸菌纯菌株和葡萄酒蒸馏余液余液在中型试验的基础上开展试生产试验，以便进一步验证该菌株和葡萄酒蒸馏余液在生产上的发酵效果(色泽、风味、产醋酸能力、出品率等)。

[0087] 2试验材料和方法

[0088] 取酒精度6％vol，总酸(以乙酸计)1.6g/100ml的葡萄酒蒸馏余液500升，接种第5号葡萄野生醋酸菌菌株种子菌悬液50升(处理)。

[0089] 取酒精度6％vol，总酸(以乙酸计)1.6g/100ml的葡萄酒蒸馏余液500升，接种AS1.41种子菌悬液50升(对照)。

[0090] 将处理和对照均置于31～33℃的保温发酵罐发酵20天，其间每天循环泵原池回淋通氧4次，每次30～60分钟。

[0091] 将发酵液进行消毒、澄清、过滤得到葡萄醋。消毒温度为90℃，时间为30 分钟。

[0092] 3试验结果

[0093] 理化检测：发酵20天后，缪1.1610纯菌株发酵液的总酸(以乙酸计)由 1.6g/100ml上升至3.6g/100ml；对照AS1.41醋酸菌的总酸为3.5g/100ml。

[0094] 感官鉴定：用缪1.1610纯菌株制得的醋液色泽为粉红色、葡萄香气浓郁、味道纯正，优于对照AS1.41。