一种食药用菌源硒螯合肽及其制备方法转让专利
申请号 : CN201810148454.1
文献号 : CN108047307B
文献日 : 2020-01-10
发明人 : 赵立娜 , 陈紫红 , 刘斌 , 于志颖 , 林占熺 , 吕旭聪 , 李鑫
申请人 : 福建农林大学
摘要 :
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种食药用菌源硒螯合肽。所述的食药用菌源硒螯合肽为灰树花硒鳌合肽，其氨基酸序列为：EAMY。其制备方法为：以灰树花蛋白为原料，采用碱性蛋白酶对其进行酶解，酶解液经分离纯化、冷冻干燥得到硒螯合肽。本发明通过对碱性蛋白酶的切割条件、酶解液分离纯化条件的控制，制备得到具有高硒螯合活性的肽，使硒螯合活性得以高效地实现，为食药用菌灰树花的资源化利用提供新思路。
权利要求 :
1.一种食药用菌源硒螯合肽，其特征在于：所述的食药用菌源硒螯合肽为灰树花硒鳌合肽，其氨基酸序列为：EAMY。
说明书 :
一种食药用菌源硒螯合肽及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种食药用菌源硒螯合肽。
背景技术
[0002] 硒（Se）是我们人体所必需的微量元素之一，具有重要的营养生理作用。然而，人体通过食物获得的硒往往不足，硒的缺乏会导致许多疾病的出现。因此，在日常饮食中添加适宜的硒源是非常必要的。硒有多种补充形式，主要包括有机硒和无机硒两种。亚硒酸钠和硒酸钠是主要的无机硒，较低水平就有很高的毒性。研究表明，无机硒在人体内极少部分被吸收，大部分随尿液排出体外，生物利用率低。相反，有机硒的生物利用率高于无机硒，且有机硒毒性较小。
[0003] 灰树花(Grifola frondosa)，又名贝叶多孔菌，浙江庆元等地俗称云蕈，河北迁西等地俗称栗蘑，四川叫千佛菌等，日本称舞茸。上世纪80年代以来，以日本、中国为主的科学家在灰树花的生物、化学、药理学等方面进行了广泛的研究，证明灰树花是具有特殊价值的药食两用菇。从灰树花中提取的活性成分灰树花 D-fraction具有极强的抗癌作用，被誉为“抗癌奇葩”。灰树花也是颇受人们欢迎的食用菌，其肉质脆嫩，脆似玉兰，鲜美诱口。灰树花富含优质蛋白及丰富的维生素和膳食纤维，它们的营养价值已被越来越多的人了解。
[0004] 灰树花营养丰富，其营养素含量经中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所和农业部质检中心检测，每100克干灰树花中含有蛋白质25.2克，所以利用生物技术对灰树花进行蛋白质资源的深加工，联合应用超滤、凝胶过滤和高效液相色谱法对生物活性肽进行筛选和提取分离，得到纯的多肽，通过飞行时间质谱对多肽的氨基酸序列进行测定。这种多肽不仅可以通过反应结合硒元素，将无机硒转化为有机硒，且其能够借助多肽在肠道消化中的吸收、转运特点以配合物的整体形式被主动吸收。该多肽仍具有抗肿瘤、调节胆固醇、降血糖等生物活性，具有重要的研究意义和价值，同时能提高灰树花的附加价值，丰富灰树花功能性食品的种类。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供了一种食药用菌源硒螯合肽。本发明利用碱性蛋白酶酶解灰树花蛋白，所制备的硒螯合肽活性高，能将无机硒转化为有机硒；为灰树花的资源化利用提供了新思路。
[0006] 为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
[0007] 一种食药用菌源硒螯合肽，所述的食药用菌源硒螯合肽为灰树花硒鳌合肽，其氨基酸序列为：EAMY。
[0008] 一种如上所述的食药用菌源硒螯合肽的制备方法：以灰树花蛋白为原料，采用碱性蛋白酶对其进行酶解，酶解液经分离纯化、冷冻干燥得到硒螯合肽。
[0009] 所述酶解条件为：底物浓度3wt%，酶解pH为10.0、温度50℃、酶解时间为1h、酶-底物质量比为1:20。
[0010] 所述分离纯化的具体步骤为：将酶解液过0.22µm滤膜，通过3 kDa和10 kDa的超滤膜将酶解液分成不同分子量的溶液冻干；测定和收集具有最高硒螯合活性的峰，再用Sephadex G-25凝胶过滤色谱进行分离，洗脱液为去离子水，流速为0.3 ml/min，洗脱峰在214nm下进行测定；收集具有最高硒螯合活性的峰，利用半制备RP-HPLC-C18反相高效液相色谱再进行进一步分离，分离条件是用体积分数为0-50%的乙腈溶液作为洗脱液梯度洗脱，流速为4 ml/min，洗脱液至含体积为100%的水开始，至体积比50%乙腈和50%水混合液结束，进行梯度洗脱，收集体积比为25%乙腈和75%水的洗脱峰，采用LC/MS液质联用质谱仪分析得出保留时间为12.38 min处的峰为所述硒螯合特征肽。
[0011] 本发明的有益效果在于：
[0012] 本发明立足于多肽具备与矿质元素离子螯合的作用位点，能够与其形成稳定的化合物，且多肽-矿质元素螯合物具有独特的螯合体制和转运机制，易被吸收、可同时补充氨基酸和矿质元素的理论基础，以来自于灰树花的灰树花蛋白为原材料，通过对碱性蛋白酶的切割条件、酶解液分离纯化条件的控制，制备得到具有高硒螯合活性的肽，使硒螯合活性得以高效地实现；为食药用菌灰树花的资源化利用提供了新思路。
附图说明
[0013] 图1为纯化灰树花蛋白源硒螯合肽的LC/MS微阵列图。
具体实施方式
[0014] 以下结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不仅仅限于这些实施例。
[0015] 实施例1
[0016] 一种食药用菌源硒螯合肽的制备方法，具体步骤如下：
[0017] 本发明所采用的灰树花蛋白来自于实验室自制，酶购买于北京索莱宝科技有限公司(中国·北京)。
[0018] 称取3.0g灰树花蛋白溶解于100ml蒸馏水中，然后用2mol/L NaOH调节其pH至10.0。先将该溶液水浴加热到50℃，接着再按酶-底物质量比1:20加入相应量的酶，酶解时间1h。接着在沸水浴中灭酶10分钟，冷却后再10000rpm离心10分钟。上清液收集后备用，所述酶为碱性蛋白酶。
[0019] 利用膜超滤技术分离上清，首先将上清溶液过0.22µm 滤膜，再通过3 kDa和10 kDa 的超滤膜将上清液液分成不同分子量的溶液冻干，测定和收集各分子量范围样品并测定硒螯合活性；
[0020] 对膜超滤技术分离的具有最高硒螯合活性的样品再进行下一步的分离，用Sephadex G-25凝胶过滤色谱（长100cm，外径2.0cm）进行分离，洗脱液为去离子水，流速为0.3mL/min，洗脱峰在214nm下进行测定；收集具有最高硒螯合活性的峰，利用半制备RP-HPLC-C18反相高效液相色谱再进行进一步分离，分离条件是用0-50%（v/v）乙腈溶液作为洗脱液梯度洗脱，流速为4 mL/min，洗脱液至含体积为100%的水开始，至体积比50%乙腈和50%水混合液结束，进行梯度洗脱，收集体积比为25%乙腈和75%水的洗脱峰，采用LC/MS液质联用质谱仪分析得出保留时间为12.38min处的峰为所述硒螯合特征肽，冷冻干燥得到硒螯合肽。
[0021] 1、测序
[0022] 对实施例1制得的硒螯合肽利用ESI质谱仪(WATERS MALDI SYNAPT Q-TOF MS, Waters Co., U.S.A) 测定氨基酸序列，氨基酸序列为：EAMY。
[0023] 2、硒螯合肽的硒鳌合力测试：
[0024] 采用比色法测定硒螯合肽对硒离子的螯合作用，采用3,3'-二氨基联苯胺比色法测定硒含量。
[0025] 1）标准曲线的制作：
[0026] 硒标准溶液：准确称取2.1940g干燥的亚硒酸钠，溶于蒸馏水，定容至1L，制备成含硒1g/L的硒贮备液，临用时用蒸馏水稀释成5mg/mL的硒标准溶液。
[0027] 取5个锥形瓶，分别放入2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL的硒标准溶液，各加蒸馏水至40mL蒸馏水，用1mol/L HCl 调节pH至2 3后，加入0.2mol/L的EDTA-2Na溶液2mL，然后加入~
0.5wt%的3,3'-二氨基联苯胺（DBA）2mL，置于60℃水浴50min（避光）震荡，取出用1 mol/L NaOH溶液调节pH至7.0 7.5，准确加入10mL甲苯，震荡摇匀2min，静置3 4min分层，然后将甲~ ~
苯层于420nm处测定溶液的吸光度（甲苯做空白）。所得到的标准曲线是y=0.00385x+
0.02753，其中y代表吸光度，x代表硒的标准质量浓度/（µg/mL）。
0.5wt%的3,3'-二氨基联苯胺（DBA）2mL，置于60℃水浴50min（避光）震荡，取出用1 mol/L NaOH溶液调节pH至7.0 7.5，准确加入10mL甲苯，震荡摇匀2min，静置3 4min分层，然后将甲~ ~
苯层于420nm处测定溶液的吸光度（甲苯做空白）。所得到的标准曲线是y=0.00385x+
0.02753，其中y代表吸光度，x代表硒的标准质量浓度/（µg/mL）。
[0028] 2）称取多肽溶液6mL，按亚硒酸钠溶液（0.5M）和多肽溶液体积比为4:6加入亚硒酸钠（0.5mol/L），搅拌均匀，调节pH至9.0，在50℃条件下持续反应90min，冷却4500r/min离心10min去除固体，加入5倍体积分数为95%的乙醇溶液，沉淀静置12h，4500r/min离心10min去除上清液，用等体积无水乙醇洗涤数次，干燥得螯合物粉末。称取灰树花蛋白肽-硒螯合物
0.2g，放入100mL小烧杯中，加入5mL消化液，在电炉上消化至无色透明为止，用40wt% NaOH溶液和5wt% NaOH溶液调节pH至7.0，后定容至50mL，待测。将定容好的溶液放至10mL离心管中（保存）。取0.5mL样液，加入40mL蒸馏水，用1mol/L HCl 调节pH至2 3后，加入0.2mol/L的~
EDTA-2Na溶液2mL，然后加入0.5wt%的3,3'-二氨基联苯胺（DBA）2mL，置于60℃水浴50min（避光）震荡，取出用1 mol/L NaOH溶液调节pH至7.0 7.5，准确加入10mL甲苯，震荡摇匀~
2min，静置3 4min分层，然后将甲苯层于420nm处测定溶液的吸光度（甲苯做空白）。将测定~
溶液的吸光度代入标准曲线中，得到测试样品中硒的标准质量浓度，代入下列公式：
0.2g，放入100mL小烧杯中，加入5mL消化液，在电炉上消化至无色透明为止，用40wt% NaOH溶液和5wt% NaOH溶液调节pH至7.0，后定容至50mL，待测。将定容好的溶液放至10mL离心管中（保存）。取0.5mL样液，加入40mL蒸馏水，用1mol/L HCl 调节pH至2 3后，加入0.2mol/L的~
EDTA-2Na溶液2mL，然后加入0.5wt%的3,3'-二氨基联苯胺（DBA）2mL，置于60℃水浴50min（避光）震荡，取出用1 mol/L NaOH溶液调节pH至7.0 7.5，准确加入10mL甲苯，震荡摇匀~
2min，静置3 4min分层，然后将甲苯层于420nm处测定溶液的吸光度（甲苯做空白）。将测定~
溶液的吸光度代入标准曲线中，得到测试样品中硒的标准质量浓度，代入下列公式：
[0029]
[0030] 式中：p为从标准曲线中查得的相当于硒的标准质量浓度/（µg/mL）；V为甲苯萃取所得的样品体积/mL；m为样品的质量/g；N为用于测定的样品体积占总定容后样品的体积分数/%；结果为：EAMY的硒螯合力为49.34 mg/g。
[0031] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。