一种海带内生真菌及其在制备生物活性提取物方面的应用

摘要

本发明涉及一种海带内生真菌及其在制备生物活性提取物方面的应用，所述海带内生真菌的菌种保藏信息为：保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2018年1月2日；保藏编号：CGMCC No.15181；分类命名：链格孢Alternaria sp.。

权利要求

1.一种海洋真菌，其为链格孢属(Alternaria sp.)W-1，其菌种保藏信息如下：保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2018年1月2日；保藏编号：CGMCC No.15181。

2.权利要求1所述的海洋真菌Alternaria sp. W-1在制备生物活性提取物方面的应用，所述生物活性为乙酰胆碱酯酶抑制活性和抗氧化活性。

3.一种由权利要求1所述的海洋真菌Alternaria sp. W-1制备生物活性提取物的方法，其特征在于包括如下步骤：（1）在无菌条件下，将海洋真菌Alternaria sp. W-1接种到PD液体培养基中，恒温摇床振荡培养，温度为25-30 ℃，摇床转速为150-180 r/min，培养时间为2-4 d，得种子液；

（2）将步骤（1）得到的种子液接种到察氏培养基中，培养基pH为4.0-8.0，接种量为5-

20%，培养温度为22-34℃，培养时间为6-14 d，得发酵物；

（3）将步骤（2）得到的发酵物用3-5层无菌纱布过滤，得滤液，经旋转蒸发仪浓缩后，用乙酸乙酯萃取2-4次，合并有机相，经旋转蒸发仪浓缩即得所述生物活性提取物。

4.权利要求3所述的方法，其特征在于步骤（1）中温度为28℃，转速为160 r/min，培养时间为3 d。

5.权利要求3所述的方法，其特征在于步骤（2）中pH为6.0-7.0，接种量为10-15%；培养温度为28℃；培养时间为8-10 d。

6.权利要求3所述的方法，其特征在于步骤（3）中发酵物用4层无菌纱布过滤，用乙酸乙酯萃取3次。

说明书

一种海带内生真菌及其在制备生物活性提取物方面的应用

技术领域

[0001] 本发明属于海洋微生物领域，具体涉及一种海带内生真菌及其在制备生物活性提取物方面的应用。

背景技术

[0002] 阿尔茨海默病(AD)，即老年痴呆，是一种大脑神经系统慢性退行性疾病。其主要临床表现为记忆力逐渐衰退、认知功能发生障碍、表情淡漠、计算能力障碍、行为异常和社交障碍等。老年痴呆病导致老年人精神残疾，已然成为一个严重的社会问题。目前研究表明，导致阿尔茨海默病的病因颇多，主要有胆碱能缺失学说、氧化应激学说、基因突变学说、炎症因子学说等。“胆碱能缺失学说”主张大脑中枢胆碱能神经递质与记忆和认知功能相关，胆碱能神经递质——乙酰胆碱在AD患者的大脑中缺失，乙酰胆碱酯酶活性增强。目前为止临床上使用最广泛的药物，主要为单靶向的乙酰胆碱酯酶抑制剂，如他克林、多奈哌齐、卡巴拉汀等，但疗效不是很理想且多数价格昂贵。因此寻找来源广泛、高效的多靶向的抗老年痴呆药物迫在眉睫。

[0003] 海带，别名江白菜、昆布，是一种生长在海底岩石的澡类。内生真菌生长繁殖时间短，可通过发酵进行大规模生产，因此研究内生真菌及其代谢产物，从中寻找天然活性物质，不仅前景广阔，而且具有很大的可行性。发明人先前发现青岛海域来源的海带内生真菌ML-X的发酵提取物对乙酰胆碱酯酶显示一定的抑制活性，并对其发酵条件进行优化，但其对乙酰胆碱酯酶的抑制活性仅为28.91％±0.25％。本发明克服现有技术缺陷，从威海海域来源的海带内生真菌W-1的发酵物中获得一种同时具有乙酰胆碱酯酶抑制及抗氧化活性的提取物。

发明内容

[0004] 本发明提供一种海洋真菌Alternaria sp.W-1，该真菌为海带内生真菌，其中海带采集自威海海域。本发明所述海洋真菌Alternaria sp.W-1的菌种保藏信息：保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2018年1月2日；保藏编号：CGMCC No.15181；分类命名：链格孢属Alternaria sp.W-1。

[0005] 本发明的另一实施方案提供一种提取物，其特征在于该提取物的制备方法，包括如下步骤：

[0006] (1)在无菌条件下，将海洋真菌Alternaria sp.W-1接种到PD液体培养基中，恒温摇床振荡培养，温度为25-30℃，摇床转速为150-180r/min，培养时间为2-4d，得种子液；

[0007] (2)将步骤(1)得到的种子液接种到察氏培养基中，培养基pH为4.0-8.0，接种量为5-20％，培养温度为22-34℃，培养时间为6-14d，得发酵物；

[0008] (3)将步骤(2)得到的发酵物用3-5层无菌纱布过滤，得滤液，经旋转蒸发仪浓缩后，用乙酸乙酯萃取2-4次，合并有机相，经旋转蒸发仪浓缩即得所述提取物。

[0009] 步骤(1)中温度优选为28℃，转速优选为160r/min，培养时间优选为3d；

[0010] 步骤(2)中pH优选为6.0-7.0，接种量优选为10-15％；培养温度优选为28℃；培养时间优选8-10d；

[0011] 步骤(3)中发酵物优选用4层无菌纱布过滤，乙酸乙酯萃取优选3次。

[0012] 本发明的另一实施方案提供一种药物组合物，其特征在于该药物组合物以上述提取物作为有效成分。该药物组合物还可包括适量的药学上可接受的药用辅料(例如药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂)。该药物组合物的剂型可以是固体制剂、液体制剂或半固体制剂。

[0013] 本发明的另一实施方案提供上述提取物在制备抗老年痴呆药物中的应用。

[0014] 本发明的另一实施方案提供上述提取物在制备乙酰胆碱酯酶抑制剂中的应用。

[0015] 本发明的另一实施方案提供上述提取物作为抗氧剂的应用。

[0016] 本发明的另一实施方案提供上述提取物在清除自由基方面的应用。所述自由基优选DPPH自由基、超氧阴离子自由基。

[0017] 本发明的另一实施方案提供上述海洋真菌Alternaria sp.W-1在制备抗老年痴呆药物中的应用。

[0018] 本发明的另一实施方案提供上述海洋真菌Alternaria sp.W-1在制备乙酰胆碱酯酶抑制剂中的应用。

[0019] 本发明的另一实施方案提供上述海洋真菌Alternaria sp.W-1在制备生物活性提取物方面的应用，所述生物活性优选乙酰胆碱酯酶抑制活性、抗氧化活性。

[0020] 本发明的另一实施方案提供由上述海洋真菌Alternaria sp.W-1制备生物活性提取物的方法，其特征在于包括如下步骤：

[0021] (1)在无菌条件下，将海洋真菌Alternaria sp.W-1接种到PD液体培养基中，恒温摇床振荡培养，温度为25-30℃，摇床转速为150-180r/min，培养时间为2-4d，得种子液；

[0022] (2)将步骤(1)得到的种子液接种到察氏培养基中，培养基pH为4.0-8.0，接种量为5-20％，培养温度为22-34℃，培养时间为6-14d，得发酵物；

[0023] (3)将步骤(2)得到的发酵物用3-5层无菌纱布过滤，得滤液，经旋转蒸发仪浓缩后，用乙酸乙酯萃取2-4次，合并有机相，经旋转蒸发仪浓缩即得所述生物活性提取物。所述生物活性优选乙酰胆碱酯酶抑制活性、抗氧化活性。

[0024] 步骤(1)中温度优选为28℃，转速优选为160r/min，培养时间优选为3d；

[0025] 步骤(2)中pH优选为6.0-7.0，接种量优选为10-15％；培养温度优选为28℃；培养时间优选8-10d；

[0026] 步骤(3)中发酵物优选用4层无菌纱布过滤，乙酸乙酯萃取优选3次。

[0027] 与现有技术相比，本发明的优点在于：(1)本发明从海带中分离获得一种新的内生真菌，该真菌的发酵提取物对乙酰胆碱酯酶具有显著的抑制活性，同时还具备很强的抗氧化活性；(2)本发明通过对真菌发酵培养条件的优化，确定了最佳发酵条件，并提高了提取物的生物活性。

附图说明

[0028] 图1发酵温度对海洋真菌发酵提取物的AchE抑制率的影响

[0029] 图2发酵初始pH对海洋真菌发酵提取物的AchE抑制率的影响

[0030] 图3接种量对海洋真菌发酵提取物的AchE抑制率的影响

[0031] 图4发酵时间对海洋真菌发酵提取物的AchE抑制率的影响

具体实施方式

[0032] 为了便于对本发明的进一步理解，下面提供的实施例对其做了更详细的说明。但是这些实施例仅供更好的理解发明而并非用来限定本发明的范围或实施原则，本发明的实施方式不限于以下内容。

[0033] 实施例1

[0034] (1)在无菌条件下，将海洋真菌Alternaria sp.W-1接种到PD液体培养基中，恒温摇床振荡培养，温度为28℃，摇床转速为160r/min，培养时间为3d，得种子液；

[0035] (2)将步骤(1)得到的种子液接种到察氏培养基中(发酵量为2.0L)，接种量为10％，培养温度为28℃，培养时间为10d，得发酵物；

[0036] (3)将步骤(2)得到的发酵物用4层无菌纱布过滤，得滤液，经旋转蒸发仪浓缩后，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，经旋转蒸发仪浓缩即得所述提取物(2.8g，简称产品A)。

[0037] 实施例2产品A的乙酰胆碱酯酶抑制活性(AchE)和抗氧化的测定

[0038] 取适量的产品A用DMSO溶解，配制成质量浓度为5mg/mL的溶液。AChE活性抑制率的测定的方法参照改良过的Ellman法，DPPH自由基清除能力、超氧阴离子清除能力测定方法参照文献。结果见表1

[0039] 表1

[0040]

[0041] 实施例3海洋真菌Alternaria sp.W-1发酵条件优化

[0042] 按照相同的步骤制备种子液：在无菌条件下，将海洋真菌Alternaria sp.W-1接种到PD液体培养基中，恒温摇床振荡培养，温度为25-30℃，摇床转速为150-180r/min，培养时间为2-4d，得种子液；按照相同的步骤由发酵物获得提取物：发酵物用3-5层无菌纱布过滤，得滤液，经旋转蒸发仪浓缩后，用乙酸乙酯萃取2-4次，合并有机相，经旋转蒸发仪浓缩即得所述提取物。考察发酵培养(即步骤(2)中)温度、pH、接种量、发酵时间对发酵提取物乙酰胆碱酯酶抑制活性的影响。

[0043] (1)最佳温度的筛选

[0044] 发酵培养基为察氏培养基，培养基pH为6.0，发酵时间为12d，接种量为10％，以AchE抑制率为主要考察指标，选择最佳培养温度(22℃，25℃，28℃、31℃和34℃)，试验每组设定3个平行实验。结果见图1，提取物的AchE抑制率随温度的升高而有所变化当培养温度低于28℃时抑制率呈上升趋势，当培养温度高于28℃抑制率呈下降趋势。培养温度为28℃时提取物的AchE抑制率最大，与其他温度下AchE抑制率有显著性差异(p<0.05)。得出结论，最佳培养温度为28℃，抑制率为66.82％。

[0045] (2)最佳初始pH值的筛选

[0046] 发酵培养基为察氏培养基，发酵时间为12d，接种量为10％，培养温度为28℃，以AchE抑制率为主要考察指标，选择最佳初始pH值(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0)，试验每组设定3个平行实验。结果见图2，提取物的AchE抑制率随着初始培养基pH的升高而有所变化。当培养基初始pH低于7时抑制率呈上升趋势，高于7时抑制率呈下降趋势，在PH为7时W-1菌株次生代谢产物AchE的抑制率最高，且与其他pH下AchE抑制率有显著性差异(p<0.05)。说明过酸或者过碱的培养环境都不利于菌株的生长代谢。得出结论，最佳液体发酵初始培养基的pH应该设定为7，抑制率为68.94％。

[0047] (3)最佳接种量的筛选

[0048] 发酵培养基为察氏培养基，发酵时间为12d，培养温度为28℃，培养基pH为6.0，以AchE抑制率为主要考察指标，选择最佳接种量(1％、5％、10％、15％、20％)，试验每组设定3个平行实验。结果见图3，提取物的AChE抑制率随接种量的升高而有所变化。在接种量低于15％时抑制率呈上升趋势，在接种量高于15％抑制率呈下降趋势，这是因为当接种量过大时，发酵初期菌丝体大量生长繁殖，培养金的营养成分被大量消耗，致使后期生长空间和营养不足，影响了菌株发酵后期的生长代谢。接种量为15％时W-1菌株次生代谢产物的AchE抑制率最高，与其他接种量下AchE抑制率有显著性差异(p<0.05)。得出结论，最佳接种量为
15％。抑制率为68.85％。

[0049] (4)最佳发酵时间的筛选

[0050] 发酵培养基为察氏培养基，培养温度为28℃，培养基pH为6.0，接种量为10％，以AchE抑制率为主要考察指标，选择最佳发酵时间(6d、8d、10d、12d、14d)，试验每组设定3个平行实验。结果见图4，提取物的AchE抑制率随时间的增长而有所变化，在培养时间少于8d时抑制率呈上升趋势，培养时间在8天后抑制率呈下降趋势，这主要是因为发酵初期菌丝体以初级代谢为主，次生代谢为辅。在初期进行大量的生长繁殖，产生的次生代谢产物并没有及时的排出胞外；到发酵中期以次生代谢为主，大量的次生代谢产物排出胞外；到了后期，营养物质消耗殆尽，部分菌丝体自溶，培养基粘度增大，影响氧气的传递，最终影响次生代谢产物的产生。培养时间为8天时W-1菌株次生代谢产物AchE抑制率最高，与其他培养时间下AchE抑制率有显著性差异(p<0.05)。得出结论，最佳液体发酵的天数为8天，抑制率为70.63％。

[0051] 实施例4

[0052] (1)在无菌条件下，将海洋真菌Alternaria sp.W-1接种到PD液体培养基中，恒温摇床振荡培养，温度为25℃，摇床转速为180r/min，培养时间为2d，得种子液；

[0053] (2)将步骤(1)得到的种子液接种到察氏培养基中(发酵量为2.0L)，初始pH为6.0为接种量为15％，培养温度为28℃，培养时间为8d，得发酵物；

[0054] (3)将步骤(2)得到的发酵物用3层无菌纱布过滤，得滤液，经旋转蒸发仪浓缩后，用乙酸乙酯萃取2次，合并有机相，经旋转蒸发仪浓缩即得所述提取物(2.4g，简称产品B)。产品B的AchE抑制率及自由基清除能力，见表2。

[0055] 表2

[0056]

[0057] “-”表示未测试。

[0058] 参考文献：

[0059] Ellman G L,Courtney K D,Featherstone R M,et al.Anew and rapid colorimetric determination of acetylcho-linesterase activity[J].Biochemical Pharmacology,1961,7(2):88-95

[0060] 郭雪峰,岳永德,汤锋,王进,姚曦.用清除有机自由基DPPH法评价竹叶提取物抗氧化能力[J].光谱学与光谱分析,2008,28(07):1578-1582

[0061] 许雅娟,赵艳景,胡虹.邻苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶活性的研究[J].西南民族大学学报(自然科学版),2006,32(06):1207-1209+1212。