醉蝶花在抑制植物土传病害致病菌的活性中的应用转让专利

申请号 : CN201810047279.7

文献号 : CN108064887B

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相似专利:

发明人 : 张艳菊杨森杨静

申请人 : 东北农业大学

摘要 :

本发明涉及醉蝶花在抑制植物土传病害致病菌活性中的应用。本发明首次发现了醉蝶花可以用于防治植物土传病害,尤其是由无性菌类镰孢菌属尖孢镰孢菌黄瓜专化型(Fusarium oxysporium f.sp.cucumarinum)侵染引起的黄瓜枯萎病,醉蝶花可以作为一种生物熏蒸剂,具有环保有效等优点,避免了化学农药造成的环境污染以及农药残留等问题。

权利要求 :

1.醉蝶花挥发成分提取物在制备用于防治黄瓜枯萎病的生物熏蒸剂中的应用,其特征在于,所述醉蝶花挥发成分提取物包括牡丹酚、芳樟醇和茶香螺烷一种或几种的混合。

2.醉蝶花挥发成分提取物在抑制黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporium f.sp. cucumerinum)的活性中的应用,其特征在于,所述醉蝶花挥发成分提取物包括牡丹酚、芳樟醇和茶香螺烷一种或几种的混合。

3.芳樟醇或茶香螺烷在抑制黄瓜枯萎病菌(Fusarium  oxysporium  f.sp. cucumerinum)的活性中的应用。

4.一种利用醉蝶花抑制黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporium f.sp. cucumerinum)的活性的方法,其特征在于,包括以下步骤:将醉蝶花茎叶粉碎后对黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporium f.sp. cucumerinum)进行生物熏蒸。

5.根据权利要求4所述利用醉蝶花抑制黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporium f.sp. cucumerinum)的活性的方法,其特征在于,采集生长120-150天的醉蝶花茎叶。

6.一种利用醉蝶花挥发成分提取物来抑制黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporium f.sp. cucumerinum)的活性的方法,其特征在于,包括以下步骤:采用水蒸气蒸馏法获得醉蝶花挥发成分提取物,该醉蝶花挥发成分提取物含有牡丹酚、芳樟醇和茶香螺烷一种或几种的混合,将醉蝶花挥发成分对黄瓜枯萎病菌(Fusarium  oxysporium  f.sp. cucumerinum)进行生物熏蒸。

7.一种利用芳樟醇或茶香螺烷来抑制黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporium f.sp. cucumerinum)的活性的方法,其特征在于,包括以下步骤:将芳樟醇或茶香螺烷对黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporium f.sp. cucumerinum)进行生物熏蒸。

说明书 :

醉蝶花在抑制植物土传病害致病菌的活性中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物防治领域,尤其涉及醉蝶花在抑制植物土传病害致病菌的活性中的应用。

背景技术

[0002] 由无性菌类镰孢菌属尖孢镰孢菌黄瓜专化型(Fusarium  oxysporium f.sp.cucumarinum)侵染引起的黄瓜枯萎病是黄瓜生产中的重要土传病害,由于保护地的特殊环境条件和长期连作,土壤中病原菌的积累量越来越多,导致黄瓜枯萎病等土传病害发生日益严重。发病率一般为10%-30%,严重时可达80%-90%,造成严重损失。使用化学药剂对土壤进行消毒和熏蒸是防治黄瓜枯萎病等土传病害的有效途径。随着化学农药造成的环境污染越来越严重,以及人类对“绿色食品”的需求越来越强烈,寻找环保有效的可替代化学药剂的生物熏蒸剂成为当务之急。
[0003] 芸苔属植物如萝卜、芥菜和花椰菜等含有大量的硫代葡萄糖苷,会产生一系列挥发性或非挥发性的生物活性物质,包括唑烷硫、酮、硫氰酸酯和不同结构的异硫氰酸酯,对土壤中植物寄生线虫、杂草、病原真菌、具有生物熏蒸作用,并能提高土壤结构及作物产量。醉蝶花(Cleome spinosa)又名紫龙须、西洋白菜花、凤蝶草、蜘蛛花,是白菜花科醉蝶花属的一、二年生草本植物。但是目前国内外尚无应用醉蝶花进行生物熏蒸的相关报道,醉蝶花是否对土传病害具有抑菌活性也尚未得到证实。

发明内容

[0004] 鉴于现有技术所存在的问题,本发明提供一种醉蝶花在抑制植物土传病害致病菌的活性中的应用。
[0005] 本发明解决上述技术问题的技术方案如下:
[0006] 本发明首次提供了醉蝶花可以在抑制植物土传病害致病菌的活性进行应用。本发明为进一步利用生物熏蒸技术防治土传病害提供新的思路,醉蝶花是一种环保有效的生物熏蒸剂,具有环保有效等优点,避免了化学农药造成的环境污染以及农药残留等问题。
[0007] 进一步,本发明首次发现了醉蝶花可以在抑制黄瓜枯萎病菌的活性中的应用。醉蝶花可以作为生物熏蒸剂用于黄瓜枯萎病的防治。
[0008] 进一步,醉蝶花含有牡丹酚、芳樟醇和茶香螺烷一种或几种的混合
[0009] 本发明的有益效果是:本发明首次研究了醉蝶花茎叶粉碎物对黄瓜枯萎病菌的熏蒸作用,明确了醉蝶花对黄瓜枯萎病的抑菌作用及成分,为进一步利用生物熏蒸技术防治土传病害提供新的思路,具有环保有效等优点,避免了化学农药造成的环境污染以及农药残留等问题。
[0010] 醉蝶花挥发成分提取物在抑制黄瓜枯萎病菌的活性中的应用,该醉蝶花的挥发成分提取物包括牡丹酚、芳樟醇和茶香螺烷一种或几种的混合。醉蝶花的挥发成分提取物可以作为生物熏蒸剂用于黄瓜枯萎病的防治。
[0011] 本发明的有益效果是:本发明应用GC/MS检测了醉蝶花挥发性物质的有效成分及各成分的抑菌活性,提供了一种新型的生物熏蒸剂,具有环保有效等优点,避免了化学农药造成的环境污染以及农药残留等问题。
[0012] 本发明还发现,牡丹酚、芳樟醇或茶香螺烷可以在抑制黄瓜枯萎病菌的活性等方面进行应用。牡丹酚、芳樟醇或茶香螺烷可以作为生物熏蒸剂用于黄瓜枯萎病的防治。
[0013] 发明人在研究中意外的发现,茶香螺烷对黄瓜枯萎病菌有显著的抑制作用,抑菌率可以达到91.0%,牡丹酚的抑菌率可以达到92.6%、芳樟醇的抑菌率可以达到98.4%,具有环保有效等优点。
[0014] 一种利用醉蝶花抑制黄瓜枯萎病菌的活性的方法,包括以下步骤:将醉蝶花茎叶粉碎后对黄瓜枯萎病菌进行生物熏蒸。具体操作可以为:将醉蝶花茎叶粉碎后施加在培养皿皿盖上,黄瓜枯萎病菌菌碟置于倒有PSA培养基中央处。
[0015] 本发明的有益效果是:通过上述方法可以实现对黄瓜枯萎病的防治,具有环保有效等优点。
[0016] 进一步,采集生长120-150天的醉蝶花茎叶。
[0017] 一种利用醉蝶花挥发成分提取物来抑制黄瓜枯萎病菌的活性的方法,包括以下步骤:采用水蒸气蒸馏法获得醉蝶花挥发成分提取物,该醉蝶花挥发成分提取物含有牡丹酚、芳樟醇和茶香螺烷一种或几种的混合,将醉蝶花挥发成分提取物对黄瓜枯萎病菌进行生物熏蒸。具体操作可以为:采用水蒸气蒸馏法获得醉蝶花挥发成分提取物,该醉蝶花挥发成分提取物含有牡丹酚、芳樟醇和茶香螺烷一种或几种的混合,将醉蝶花挥发成分提取物施加在培养皿皿盖上,黄瓜枯萎病菌菌碟置于倒有PSA培养基中央处。
[0018] 本发明的有益效果是:通过上述方法可以实现对黄瓜枯萎病的防治,具有环保有效等优点。
[0019] 一种利用牡丹酚、芳樟醇或茶香螺烷来抑制黄瓜枯萎病菌的活性的方法,包括以下步骤:将牡丹酚、芳樟醇或茶香螺烷对黄瓜枯萎病菌进行生物熏蒸。具体操作可以为:将牡丹酚、芳樟醇或茶香螺烷施加在培养皿皿盖上,黄瓜枯萎病菌菌碟置于倒有PSA培养基中处。
[0020] 本发明的有益效果是:通过上述方法可以实现对黄瓜枯萎病的防治,具有环保有效等优点。

附图说明

[0021] 图1为不同剂量醉蝶花粉碎物对黄瓜枯萎病菌的熏蒸效果图。
[0022] 图2为不同剂量醉蝶花对黄瓜枯萎病菌的熏蒸效果的曲线图。
[0023] 图3为醉蝶花GC/MS总离子色谱图。
[0024] 图4为8种醉蝶花挥发性物质对黄瓜枯萎病菌的抑菌效果,A为空白对照;B为十四烷基环氧乙烷;C为二十四烷;D为十七烷;E为二十八烷;F为乙基环戊烯醇酮;G为茶香螺烷;H为芳樟醇;I为牡丹酚。
[0025] 图5为茶香螺烷、芳樟醇和牡丹酚3种物质对黄瓜枯萎病菌的抑菌效果,其中,A为茶香螺烷对黄瓜枯萎病的抑菌效果。A1为空白对照;A2为0.0075g/皿;A3为0.0151g/皿;A4为0.0226g/皿;A5为0.0301g/皿。B为牡丹酚对黄瓜枯萎病的抑菌效果。B1为空白对照;B2为0.0678g/皿;B3为0.1356g/皿;B4为0.2034g/皿;B5为0.2712g/皿。C为芳樟醇对黄瓜枯萎病的抑菌效果。C1为空白对照;C2为0.0112g/皿;C3为0.0224g/皿;C4为0.0337g/皿;C5为
0.0449g/皿。
[0026] 图6为不同剂量茶香螺烷、芳樟醇和牡丹酚对枯萎病菌的抑制效果,茶香螺烷的剂量分别为每皿0g、0.0075g、0.0151g、0.0226g、0.0301g;牡丹酚的剂量分别为0g、0.0678g、0.1356g、0.2034g、0.2712g。芳樟醇的剂量分别为0g、0.0112g、0.0224g、0.0337g、0.0449g。

具体实施方式

[0027] 以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述,所举实例只用于解释本发明,并非用于限定本发明的范围。
[0028] 为寻找环保有效、可替代化学药剂的生物熏蒸剂,本发明采用菌丝生长速率法研究了醉蝶花茎叶粉碎物对黄瓜枯萎病菌的熏蒸作用,应用GC/MS检测了醉蝶花挥发性物质的有效成分及各成分的抑菌活性。研究结果表明,0.1g、0.2g、0.3g和0.4g4个剂量的醉蝶花粉碎物对黄瓜枯萎病菌均有抑制作用,其中每皿0.3g和0.4g抑菌率可达100%。GC/MS鉴定出醉蝶花挥发性物质21种,对其中8种成分的熏蒸效果进行研究,结果表明牡丹酚、芳樟醇和茶香螺烷对黄瓜枯萎病菌有抑制作用,抑菌率分别为92.6%、98.4%和91.0%,而十四烷基环氧乙烷、二十四烷、十七烷、乙基环戊烯醇酮和二十八烷对黄瓜枯萎病菌均无抑制作用。
[0029] 下面通过具体实施例来进行介绍。
[0030] 各实施例中,黄瓜枯萎病菌(FOC,Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum),由东北农业大学植物病理研究室提供,可以为公众获得,用于非商业目的重复本申请的实验内容。该菌株曾记载在发明专利(专利号为ZL201110400011.5)的说明书部分,具体见该说明书的实施例一的方法I的步骤一的“菌悬液的制备”。
[0031] 醉蝶花(Cleome spinosa)种子购自哈尔滨花卉市场,常规方法栽培于东北农业大学校园内。
[0032] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
[0033] 下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到[0034] 实施例1醉蝶花对黄瓜枯萎病菌的抑菌作用
[0035] 采用菌丝生长速率法测定醉蝶花对黄瓜枯萎病菌菌丝的抑制效果。水蒸气蒸馏法可以参照文献:张新虎,何静,沈慧敏,等.苍耳提取物对番茄灰霉病菌的抑制作用及抑菌机理初探[J].草业学报,2008,17(3):99-104.
[0036] 具体操作为:采集生长50d左右的新鲜醉蝶花茎叶,清洗干净并烘干,用中草药高速粉碎机粉碎至细粉状备用。将在PSA培养基上培养7d的黄瓜枯萎病菌,用直径为0.85cm的打孔器在菌落边缘打孔切取菌饼,用移菌钩将菌饼接种于倒有PSA的9.0cm培养皿中央,在培养皿皿盖上分别加入0g、0.1g、0.2g、0.3g、0.4g不同剂量的醉蝶花粉碎物,用封口膜封口,置于20℃培养箱内黑暗培养。每处理5次重复,每隔24h对每个菌落用十字交叉法垂直测量直径,取其平均值。采用下面的公式根据测得的结果计算醉蝶花对黄瓜枯萎病菌的抑菌率。
[0037]
[0038] 图1和图2为不同剂量醉蝶花粉碎物对黄瓜枯萎病菌的熏蒸效果。图1中,A为空白对照,B为0.1g/皿,C为0.2g/皿,D为0.3g/皿,D为0.4g/皿。从图1和图2中可见,4个剂量的醉蝶花粉碎物对黄瓜枯萎病菌均有抑制效果。空白对照(CK)菌落平均增长直径为2.917cm,0.1g醉蝶花粉碎物熏蒸处理后菌落平均增长直径为1.986cm,抑菌率为32.2%;0.2g醉蝶花处理菌落平均增长直径为1.313cm,抑菌率为54.8%;0.3g和0.4g菌落平均增长直径均为
0cm,抑菌率均为100%。
[0039] 实验结果表明:醉蝶花对黄瓜枯萎病菌的熏蒸作用。
[0040] 实施例2醉蝶花挥发性物质成分分析
[0041] 醉蝶花挥发性物质的提取采用水蒸气蒸馏法。水蒸气蒸馏法可以参考文献:李晓明,李成冲,牛英才,等.正交实验优选石菖蒲挥发油提取工艺[J].时珍国医国药,2011,22(4):939.
[0042] 具体操作方法为:称取50g醉蝶花茎叶,用中药粉碎机粉碎,置于500mL烧瓶中,加蒸馏水,混匀后,加入35g NaCl。将挥发油提取器与回流冷凝管连接,从冷凝管上端加入蒸馏水使充满挥发油测定器的刻度部分,并溢流入烧瓶为止。将烧瓶置于电热套中缓缓加热至沸,并保持连续沸腾,至测定器中的油面不再变化。放置1h,开启活塞,使油面下降与0刻度平齐,收集挥发油并用500μL色谱纯乙酸乙酯稀释,放入5mL液相瓶中封好以备GC/MS分析。
[0043] 醉蝶花挥发物质成分采用GC/MS分析。可以参考文献:王得道,朱玉,刘洪章,等.水蒸气法提取黑皮由松松针挥发油及GC/MS分析[J].黑龙江农业科学,2013,3:96-97.[0044] GC条件:采用BD-5MS弹性石英毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm);进样口温度为250℃、ECD检测器温度为250℃;载气为高纯氦气,纯度>99.999%,流速1mL/min;柱温起始为45℃,保持5min,以4℃/min升至210℃,保持3min,再以15℃/min升至230℃,不分流进样,进样量1μL。MS条件:离子源EI,离子源温度230℃,电子能量60eV,发射电流35.0μA,四极杆温度165℃,转接口温度275℃,电子倍增器电压350V,质量扫描范围为45-500amu。利用N IST 05标准质谱库分析试验获得的成分。
[0045] 醉蝶花挥发性物质成分分析结果:
[0046] 采用GC/MS共分离出21种化合物。利用N IST05标准质谱库-计算机联机检索,共鉴定出了21种化合物(图3和表1)。21种物质包括13种杂环,1种醇,1种色稀,1种酯,1种酸以及6种长链烷烃。检测出来的物质中含量最多的是牡丹酚(22.60%),其次为1,1,4a-三甲基-
3,4,4a,5,6,7-六氢-2-(1H)-萘酮(12.56%),2,5,5,8a-四甲基-3,4,4a,5,6,8a-六氢-2H-色烯(8.00%),9,12,15-十八碳三烯酸甲酯(6.78%),脂酸(5.04%),沉香醇(3.74%),3-乙基-5-(乙基丁基)-十八烷(3.46%),植酮(3.29%),十四烷基环氧乙烷(3.19%),9-已基-十七烷(3.17%),三十五碳-17-烯(3.16%),二十四烷(3.13%),7-羟基-四甲基-7,8-二氢环庚并吡喃[d,e]萘(3.10%),7,12a-二甲基-1,2,3,4,4a,11,12,12a-八氢化屈(2.93%),十七烷(2.89%),乙基环戊烯醇酮(2.69%),茶香螺烷(2.51%),二十八烷(2.09%),8-甲基-5(4-戊烯基)八氢吲哚嗪(1.95%),2,6-二甲基-1-环已烯-乙酸脂(1.92%),4-羟基-β-紫罗兰酮(1.81%)。
[0047] 表1醉蝶花挥发性物质成分
[0048]
[0049]
[0050] 实施例3醉蝶花挥发性物质对黄瓜枯萎病菌抑菌活性测定
[0051] GC/MS测定醉蝶花挥发性物质后获得的8种物质,采用菌丝生长速率法测定其对黄瓜枯萎病菌的抑菌活性。
[0052] 将在PSA培养基上培养7d的黄瓜枯萎病菌,用直径为0.85cm的打孔器在菌落边缘打孔切取菌饼,接种于倒有PSA的9.0cm培养皿中央,在培养皿盖上分别加入0.3g上述8种物质(分析纯),用封口膜封口,置于20℃培养箱内黑暗培养。在此试验基础上,根据茶香螺烷、牡丹酚和芳樟醇3种物质在GC/MS试验获得的挥发性物质所占比率进行熏蒸试验设计,每皿中茶香螺烷、牡丹酚和芳樟醇含量分别为:茶香螺烷0g、0.0075g、0.0151g、0.0226g、0.0301g;牡丹酚0g、0.0678g、0.1356g、0.2034g、0.2712g;芳樟醇0g、0.0112g、0.0224g、
0.0337g、0.0449g,试验方法同上。
[0053] 实验结果如图4所示,图4为8种醉蝶花挥发性物质0.3g/皿对黄瓜枯萎病菌的抑菌效果,A为空白对照;B为十四烷基环氧乙烷;C为二十四烷;D为十七烷;E为二十八烷;F为乙基环戊烯醇酮;G为茶香螺烷;H为芳樟醇;I为牡丹酚。从图4中可见,茶香螺烷、芳樟醇、牡丹酚对黄瓜枯萎病菌有抑制作用,而十四烷基环氧乙烷、二十四烷、十七烷、二十八烷、乙基环戊烯醇酮无抑菌作用。
[0054] 进一步研究不同剂量茶香螺烷、芳樟醇和牡丹酚对黄瓜枯萎病的抑菌作用,结果见图5和图6。图5中,A为茶香螺烷对黄瓜枯萎病的抑菌效果。A1为空白对照;A2为0.0075g/皿;A3为0.0151g/皿;A4为0.0226g/皿;A5为0.0301g/皿。B为牡丹酚对黄瓜枯萎病的抑菌效果。B1为空白对照;B2为0.0678g/皿;B3为0.1356g/皿;B4为0.2034g/皿;B5为0.2712g/皿。C为芳樟醇对黄瓜枯萎病的抑菌效果。C1为空白对照;C2为0.0112g/皿;C3为0.0224g/皿;C4为0.0337g/皿;C5为0.0449g/皿。图6中,茶香螺烷的剂量分别为每皿0g、0.0075g、0.0151g、0.0226g、0.0301g;牡丹酚的剂量分别为0g、0.0678g、0.1356g、0.2034g、0.2712g。芳樟醇的剂量分别为0g、0.0112g、0.0224g、0.0337g、0.0449g。
[0055] 通过图5和图6可以看出,随着每皿中3种物质剂量的增加,抑菌率也随之增加。茶香螺烷量为每皿0.0075g、0.0151g、0.0226g、0.0301g时抑菌率分别为66.0%、83.7%、89.2%和91.0%;牡丹酚量为0.0678g、0.1356g、0.2034g和0.2712g时抑菌率分别为
79.7%、87.1%、90.8%和92.6%;芳樟醇量为0.0112g、0.0224g、0.0337g、0.0449g时抑菌率分别为92.0%、97.9%、95.8%和98.4%。
[0056] 生物熏蒸是利用来自十字花科或菊科等有机物在分解中产生的具有杀生性挥发性的气体,抑制或杀灭土壤中的有害生物的方法。十字花科植物,特别是芸薹属植物具有生物熏蒸作用。利用芥菜、甘蓝和芜菁等植物材料进行土壤熏蒸,对等多种土传植物病原菌都具有抑制作用。该属植物组织中含有大量的硫代葡糖酸脂,该物质并不具有很高的活性,但在腐烂过程中可被自身产生的黑芥子酶水解而形成挥发性和杀生性很强的异硫氰酸脂类物质,从而降低土壤中有害微生物的数量。
[0057] 醉蝶花是白花菜目白花菜科醉蝶花属的一、二年生草本植物,被称为紫龙须、凤蝶草、西洋白菜花、蜘蛛花。醉蝶花与十字花科芸薹属植物都属于白花菜目,醉蝶花是否具有类似芸薹属植物的生物熏蒸作用尚无研究报道。本发明首次提出了醉蝶花茎叶粉碎物对黄瓜枯萎病菌的抑制作用,应用GC/MS检测了醉蝶花挥发性物质的有效成分及各成分的抑菌活性。结果表明,0.1g/皿、0.2g/皿、0.3g/皿和0.4g/皿4个剂量的醉蝶花粉碎物对黄瓜枯萎病菌均有抑制作用,其中0.3g和0.4g抑菌率可达100%。GC/MS鉴定出醉蝶花挥发性物质21种,其中牡丹酚、芳樟醇和茶香螺烷对黄瓜枯萎病菌有较好的抑制作用,抑菌率分别为92.6%、98.4%和91.0%。醉蝶花对黄瓜枯萎病菌具有熏蒸作用以及牡丹酚、芳樟醇和茶香螺烷为其主要抑菌成分尚属首次发现。
[0058] 醉蝶花挥发性物质GC/MS测定的成分中并没有类似芸薹属植物的异硫氰酸酯类物质,说明醉蝶花抑菌机理与同目的芸薹属并不相同。醉蝶花挥发成分中含量最多的是牡丹酚,牡丹酚又名丹皮酚、芍药醇,是中药牡丹的有效提取物。牡丹酚在医学领域有广泛的应用,具有镇痛、镇静、催眠、抗菌、抗炎、抗氧化、降血压等作用。本研究结果中除牡丹酚外芳樟醇和茶香螺烷对黄瓜枯萎病菌也有较好的熏蒸作用,说明醉蝶花对黄瓜枯萎病菌的熏蒸作用可能是多种物质共同作用的结果。此发现对于今后醉蝶花在生物熏蒸方面的进一步应用具有重要意义。
[0059] 以上所述仅为本发明的较佳实施例,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。